Restaurar miR-133a-3p o reducir PSAT1 limita el aneurisma intracraneal por daño endotelial inhibiendo la vía GSK3β/β-catenina

Resumen

El papel funcional del microARN-133a-3p (miR-133a-3p) en el aneurisma intracraneal (AI) no está claro. El objetivo fue investigar su papel regulador en el AI inducido por lesión endotelial vascular a través de la vía de señalización fosfoserina aminotransferasa 1 (PSAT1)/glucógeno sintasa quinasa 3β (GSK3β)/β-catenina. Se recolectaron tejidos arteriolares intracraneales normales y de AI de pacientes con traumatismo cerebral y AI. La expresión de miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β y β-catenina en tejidos se determinó por RT-qPCR y *western blot*. Se cultivaron células endoteliales (CE) humanas de AI y se trataron con mimético de miR-133a-3p y si-PSAT1 para evaluar su función en migración, apoptosis y proliferación. La expresión de miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, β-catenina, Ki-67, Ciclina D1, Bax y Bcl-2 en CE se analizó por RT-qPCR o *western blot*. Además, se estableció un modelo de rata de AI para detectar cambios patológicos y expresión de miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, β-catenina, VEGF y MMP-9 en tejidos de AI *in vivo*. La expresión de miR-133a-3p se relacionó con el número y tamaño de AI. La expresión de miR-133a-3p disminuyó y la de PSAT1, GSK3β y β-catenina aumentó en AI. La restauración de miR-133a-3p y la depleción de PSAT1 aliviaron los cambios patológicos; redujeron la expresión de PSAT1, GSK3β y β-catenina en AI; suprimieron la apoptosis y promovieron proliferación y migración de CE de AI, además de reducir VEGF y MMP-9 en tejidos de AI *in vivo*. Nuestro estudio sugiere que la sobreexpresión de miR-133a-3p o la regulación negativa de PSAT1 frenan el daño de células endoteliales y promueven su proliferación inhibiendo la vía GSK3β/β-catenina en AI. El miR-133a-3p podría ser un marcador y diana terapéutica potencial para AI.

Planteamiento de la Hipótesis

En este estudio, especulamos que el eje miR-133a-3p/PSAT1 podría afectar el AI inducido por daño de células endoteliales mediante la modulación de la vía GSK3β/β-catenina.

Comprobación de la Hipótesis

Para verificar esta hipótesis, recolectamos muestras clínicas, células endoteliales (CE) de AI humano y establecimos modelos de rata de AI para elucidar las funciones de miR-133a-3p y PSAT1 en el proceso de AI.

Implicaciones de la Hipótesis

Nuestro estudio confirma la hipótesis: la sobreexpresión de miR-133a-3p o la regulación negativa de PSAT1 frenan el daño de células endoteliales y promueven su proliferación inhibiendo la vía GSK3β/β-catenina en AI. Estos hallazgos aportan una nueva diana terapéutica para AI.

Introducción

El aneurisma intracraneal (AI) es un trastorno cerebrovascular caracterizado por una dilatación anómala de la arteria cerebral y hemorragia subaracnoidea (HSA) por rotura, con alta mortalidad y morbilidad [1]. La patogénesis del AI no se ha esclarecido [2]. El AI tiene forma familiar rara, pero generalmente se considera resultado de lesión vascular adquirida por hipertensión, tabaquismo y otros factores de riesgo tradicionales [3]. El *coiling* endovascular o *clipping* microquirúrgico se usan para prevenir rotura futura en aneurismas no rotos de alto riesgo [4]. A pesar de avances quirúrgicos, la recuperación postoperatoria sigue siendo pobre [5]. La difícil situación del tratamiento del AI hace necesario explorar mecanismos y hallar nuevas estrategias terapéuticas.

Los microARN (miARN) son ARN no codificantes que modulan la expresión génica inhibiendo la traducción a nivel post-transcripcional o mediando degradación de ARNm [6]. Se ha revelado que miR-133a-3p actúa como supresor tumoral en varias neoplasias malignas y su sobreexpresión inhibe el crecimiento de células de cáncer colorrectal (CCR) [7]. Un estudio previo indicó que, al bloquear la glutaminólisis mediada por autofagia, miR-133a-3p suprime metástasis y crecimiento de cáncer gástrico [8]. También se ha mostrado que miR-133a-3p participa en desarrollo cardíaco e hipertrofia [9]. Un estudio demostró que la regulación positiva de miR-195-5p reduce angiogénesis y resistencia a cisplatino en cáncer de ovario mediante la supresión de la vía GSK3β/β-catenina dependiente de PSAT1 [10]. Otro estudio reportó que miR-365 reprime invasión y crecimiento en carcinoma escamoso de esófago (CEE) modulando PSAT1 [11]. PSAT1 es una enzima implicada en biosíntesis de serina; se purificó originalmente de cerebros de oveja y presenta altos niveles en muchos tejidos [12]. Se ha documentado que PSAT1 media la progresión del ciclo celular en cáncer de mama modulando la vía GSK3β/β-catenina [13]. Liu et al. señalan que PSAT1 influye en el desarrollo de CEE y pronostica supervivencia pobre, pudiendo ser diana prometedora para terapias anticancerígenas [14]. Dado lo anterior, este estudio esperaba contribuir a un nuevo enfoque sobre el papel funcional del eje miR-133a-3p/PSAT1/GSK3β/β-catenina en AI.

Materiales y Métodos

Declaración Ética

El estudio fue aprobado por el Comité de Revisión Institucional del Primer Hospital Docente de la Universidad de Medicina Tradicional China de Tianjin. Todos los participantes firmaron consentimiento informado. Los experimentos con animales siguieron la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de Comités Internacionales.

Sujetos de Estudio

De enero 2016 a marzo 2018, se seleccionaron casos de HSA por AI tratados en neurocirugía del Primer Hospital Docente de la Universidad de Medicina Tradicional China de Tianjin. Se obtuvieron 75 muestras patológicas de AI por microcirugía (grupo AI): 29 hombres y 46 mujeres, 31-55 años, edad media 44,98 ± 6,79 años. Como control, se seleccionaron pacientes con traumatismo cerebral tratados en el mismo período en el mismo hospital. Se obtuvieron 75 tejidos arteriolares intracraneales normales por cirugía traumática o descompresión interna: 43 hombres y 32 mujeres, 34-56 años, edad media 48,14 ± 8,68 años. Se excluyeron pacientes con antecedentes de hipertensión, diabetes o tumores. No hubo diferencia significativa en género y edad entre grupos (ambos *P* > 0,05).

Tratamiento y Conservación de Muestras

Tras resección quirúrgica, algunas muestras de ambos grupos se fijaron con formaldehído, deshidrataron con alcohol graduado e incluyeron en parafina. Luego se cortaron para tinción hematoxilina-eosina (HE) e inmunohistoquímica. Algunas muestras se colocaron rápidamente en nitrógeno líquido y luego en congelador a -80 °C para *western blot* y RT-qPCR. Otras se fijaron con glutaraldehído para microscopía electrónica y otras para aislamiento de CE.

Microscopía Electrónica

Las muestras se fijaron con glutaraldehído al 3 % y luego con tetróxido de osmio al 1 %. Se deshidrataron con acetona, incluyeron en Epon812 y se cortaron secciones semifinas de 3 μm. Finalmente, se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo y observaron con microscopio electrónico de transmisión H-600IV (Hitachi, Tokio, Japón).

Tinción HE

Las secciones de parafina se hornearon a 60 °C 30 min. Luego se fijaron en xileno, deshidrataron con alcohol absoluto graduado y lavaron con PBS. Se tiñeron con hematoxilina, trataron con amoníaco pocos segundos, tiñeron con eosina 2 min, deshidrataron y clarificaron. Se montaron con goma neutra y cubreobjetos. Se observaron y registraron con microscopio (Nikon, Tokio, Japón).

Inmunohistoquímica

Kit de inmunohistoquímica de Zymed Laboratories (San Francisco, CA, EUA). Las láminas se desparafinizaron, hidrataron e inmersaron en xileno 5 min × 3. Luego en alcohol absoluto 100 % 3 min × 2 y alcohol 95-75 % 3 min cada uno. Tras desparafinizado, se incubaron con peróxido de hidrógeno al 3 % 15 min para eliminar peroxidasa endógena. Se incubaron con suero de cabra normal 15 min, luego con anticuerpo primario anti-MMP-9 (5 μg/mL) y anti-VEGF (1:250, Abcam, Cambridge, MA, EUA) (PBS para control negativo) 1-2 h. Se incubaron con anticuerpo secundario biotinilado 30-60 min. Se añadió estreptavidina/peroxidasa marcada con peroxidasa de rábano picante, se goteó DAB recién preparado, se contratiñó y bloqueó. La imagen se adquirió con sistema Nikon SPOT FlexTM. El área de expresión de MMP-9 y VEGF se cuantificó con software de análisis inmunohistoquímico. Se detectaron 5 campos de alta potencia al azar en área de acumulación de células positivas en cada muestra, usando la absorbancia media promedio para análisis estadístico.

Aislamiento y Cultivo de CE

Las CE se aislaron de tejidos arteriolares normales y de AI y cultivaron. El tejido se cortó en fragmentos de 3 mm² e incubó 25 min en colagenasa B 0,1 % / dispasa 0,1 % (Roche, Basilea, Suiza). Se disoció, trituró 2 min con pipeta de 2 mL y filtró por malla de 100 μm (BD Biosciences, NJ, EUA) para aislar CE. La suspensión celular se centrifugó y resuspendió en medio MV2 con factores de crecimiento y 20 % suero fetal bovino (PromoCell, Heidelberg, Alemania). Luego se sembraron en placas recubiertas de fibronectina (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA) a densidad 10⁴ células/cm² (1 μg/cm²) y crecieron 1 día con 5 % CO₂. Al día siguiente, se lavaron con PBS para eliminar células no adheridas y se puso medio fresco. Al alcanzar 80-100 % confluencia, se expusieron a inmunoseparación con cuentas recubiertas de Ulex europaeus Agglutinina I (UEA) (Vector Laboratories, Peterborough, UK) (Dynabeads M-450 Tosylactivated, Oxoid, Hampshire, UK) para obtener CE puras. Las CE unidas a cuentas se recogieron con concentrador de partículas magnéticas; las no unidas se eliminaron lavando con medio basal dos veces. Las células UEA-positivas se resuspendieron en medio de cultivo y sembraron en placas recubiertas de fibronectina para mejorar adhesión y crecimiento. Los cultivos confluyeron en 4-6 días.

Identificación de CE

Las CE se identificaron por inmunocitoquímica con anticuerpo de superficie CD31 y antígeno relacionado con factor VII. Las células se lavaron dos veces con PBS, fijaron con paraformaldehído al 4 %, incubaron con H₂O₂ al 3 % 10-15 min para eliminar peroxidasa endógena y luego con Triton X-100 al 0,1 % 10 min para permeabilizar. Se incubaron con anticuerpo primario específico: Factor VII (1:200), CD31 (1:400, Roche, Basilea, Suiza) a 4 °C toda la noche. Luego con inmunoglobulina G (1:50) marcada con anticuerpo secundario de peroxidasa de rábano picante. Incubación a 37 °C 45 min y revelado con DAB evitando luz 4 min. Se detuvo revelado con agua destilada y se observó al microscopio. Se contó células positivas y totales al azar en 10 campos bajo microscopio de fluorescencia de contraste de fase invertido. Tasa de células positivas = (células positivas / total células) × 100 %. Se estableció grupo NC correspondiente reemplazando anticuerpo primario por PBS.

Agrupamiento y Transfección de Células

Para estudiar efectos entre miR-133a-3p y PSAT1 en CE de AI, las CE se agruparon en: grupo control (CE vasculares normales sin transfección), grupo AI (CE vasculares de AI sin transfección), grupo mimético NC (transfectado con mimético NC de miR-133a-3p), grupo mimético miR-133a-3p (transfectado con mimético miR-133a-3p), grupo si-NC (transfectado con si-PSAT1 NC), grupo si-PSAT1 (transfectado con si-PSAT1), y grupo mimético miR-133a-3p + oe-PSAT1 (transfectado con mimético miR-133a-3p y oe-PSAT1). Mimético NC, mimético miR-133a-3p, si-PSAT1, si-NC y oe-PSAT1 fueron diseñados y sintetizados por GenePharma Co., Ltd. (Shanghái, China). La transfección se realizó estrictamente según instrucciones de Lipofectamine™ 2000 (Thermo Fisher Scientific, MA, EUA).

Citometría de Flujo

Se descartó medio, se lavaron células dos veces con PBS. Se desprendieron con tripsina 0,25 %, centrifugaron 800 rpm 5 min, resuspendieron en 1× buffer de unión, ajustando densidad a 1×10⁷ células/mL. 100 μL de suspensión se incubaron con 5 μL yoduro de propidio (PI, 20 μg/mL) y annexina V-FITC 20 min, luego mezclaron con 400 μL 1× buffer de unión. Citómetro de flujo (BD FACSArial I) detectó apoptosis en 1 h. Resultados: cuadrante inferior izquierdo (Q4) células vivas sanas (FITC⁻/PI⁻), cuadrante inferior derecho (Q3) apoptosis temprana (FITC⁺/PI⁻), cuadrante superior derecho (Q2) apoptosis tardía y células apoptóticas (FITC⁺/PI⁺); tasa apoptosis = % apoptosis temprana (Q3) + % apoptosis tardía (Q2).

Ensayo MTT

Las células se desprendieron con tripsina para preparar suspensión. Se contaron bajo microscopio invertido. Concentración ajustada a 5×10⁴ células/mL. Se sembraron en placa de 96 pozos. Tras 48 h, se incubaron con 20 μL solución MTT 4 h. MTT se disolvió con 150 μL DMSO. La densidad óptica (DO) se midió a 570 nm. La tasa de proliferación se calculó según DO.

Prueba de Rasguño

Las células de cada grupo se sembraron en placa de 24 pozos con 2×10⁵ células/pozo. Tres pozos paralelos por grupo. Al alcanzar ~90 % confluencia, se rasgó el plano de crecimiento con punta de micropipeta estéril de 1 mL; un rasguño por pozo, longitud y profundidad consistentes. Tras rasguño, se eliminaron células flotantes, se cambió medio fresco y se observó espacio de rasguño tras 24 h de cultivo. El área de cicatrización se cuantificó con software National Instrument Vision Assistant 8.6. Migración celular = área cicatrización / área rasguño inicial × 100 %.

Animales de Experimento y Modelo de Rata de AI

84 ratas Sprague-Dawley (SD) de 7 semanas, 180-200 g (Centro de Animales de Laboratorio, Academia de Ciencias Médicas Militares, Pekín, China). Alojadas en centro experimental a 22-25 °C, 50-60 % humedad, luz natural. 4 ratas por jaula, agua potable y alimento estándar. Camas cambiadas cada 3 días, jaulas lavadas y esterilizadas. El modelo de AI se realizó según ref. [15]. AI rota se identificó cuando aparecieron en ratas [16]: 1, disminución de ingesta/actividad (pérdida ~10 % peso en 24 h); 2, flexión de torso y extremidades anteriores al levantar; 3, caminata lateral en postura normal; 4, inclinación lateral en reposo, sin actividad espontánea. Ratas con estos síntomas fueron eutanasiadas 3 meses postoperación. Tejidos de AI se obtuvieron durante operación, perfundidos con PBS, y se perfundió colorante azul con ácido glutámico en arteria cerebral.

Tratamiento e Intervención en Ratas AI

Las 84 ratas se dividieron aleatoriamente en 7 grupos (12 ratas/grupo). Tratamientos: grupo normal (sin modelado); grupo AI (inyección estereotáctica 100 μL mezcla PBS + Lipofectamine 2000); grupo mimético NC (100 μL mimético NC miR-133a-3p + Lipofectamine 2000); grupo mimético miR-133a-3p (100 μL mimético miR-133a-3p + Lipofectamine 2000); grupo si-NC (100 μL si-PSAT1 NC + Lipofectamine 2000); grupo si-PSAT1 (100 μL si-PSAT1 + Lipofectamine 2000); grupo mimético miR-133a-3p + oe-PSAT1 (100 μL mimético miR-133a-3p + oe-PSAT1 + Lipofectamine 2000). Todas las inyecciones una vez al día; ratas mantenidas en laboratorio SPF 12 semanas. Tras 12 semanas, ratas anestesiadas, tórax abierto. Desde ventrículo izquierdo intubando aorta, se liberó sangre cortando vena cava. Simultáneamente, 30 mL salina con heparina sódica (37 °C) perfundidos por conducto, luego 10 % poliformaldehído/0,1 M tampón fosfato (pH 7,4) inyectado lentamente en cerebro. Tras fijación por perfusión, se abrió cerebro. Anillo arterial base craneal separado y removido bajo microscopio quirúrgico, observaron cambios de aneurismas y encuestaron características patológicas. Mimético NC, mimético miR-133a-3p, si-NC, si-PSAT1, oe-PSAT1 compuestos por Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd. (Shanghái, China).

Detección de Hemodinámica

El flujo sanguíneo al final de la arteria carótida común izquierda se midió 3 días antes de operación y 12 semanas tras intervención. Método: ratas en marco de anestesia por inhalación, ajustaron parámetros de flujo. Tras respiración estable y sin reacción al tocar cola, ratas fijadas en mesa con banda elástica. Pelo del cuello afeitado con afeitadora eléctrica. Encendido detector Doppler color, midieron velocidad flujo sanguíneo al final de arteria carótida común izquierda tras untar sonda con agente de acoplamiento. Tras medición, ratas devueltas a jaula manteniendo vía respiratoria permeable hasta despertar de anestesia.

RT-qPCR

ARN total extraído con kit RNA simple total RNA extraction (TIANGEN Biotech, Pekín, China). ARN de alta calidad confirmado por análisis UV y electroforesis en gel desnaturalizante con formaldehído. ARN transcrito inversamente a ADNc con PrimeScript RT reagent Kit. PCR con SYBR Permix Ex Taq II (Takara, Dalian, Liaoning, China). Cebadores diseñados por Beijing ComWin Biotech Co., Ltd. (Pekín, China) (Tabla 1). U6 como referencia interna para miR-133a-3p; PSAT1, GSK3β, β-catenina, Bax, Bcl-2, Ki-67, Ciclina D1 con GAPDH. Datos calculados por 2⁻ΔΔCt.

Análisis Western Blot

Proteínas totales extraídas de células y tejidos, cuantificadas con kit BCA (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghái, China). Mezcladas con 1/4 vol. buffer de muestra 5× y hervidas 5 min. Gel separador 10 % y concentrador 5 % para electroforesis. Membrana bloqueada en leche desnatada 5 % 60 min. Incubada con anticuerpos primarios: PSAT1 (1:500), GSK3β (1:500), β-catenina (1:5000), Bax (1:1000), Bcl-2 (1:1000), Ciclina D1 (1:200), Ki-67 (1:5000), MMP-9 (1 μg/mL), VEGF (1:1000) (todos Abcam, Cambridge, MA, EUA). Luego anticuerpo secundario (1:2000) 60 min. Membrana inmersa en solución electroquimioluminiscencia (Beyotime) 1 min, cubierta con film alimentario. Expuesta a rayos X, resultado observado tras revelado y fijado. GAPDH (1:10000, Abcam) como control de carga. Imagen proteica analizada con software ImageJ2x.

Ensayo de Luciferasa Dual

La relación diana entre miR-133a-3p y PSAT1 y sitio de unión en 3'UTR de PSAT1 predichos por web bioinformática (https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/). Secuencia de región promotora 3'UTR de PSAT1 con sitio de unión amplificada y clonada en plásmido pGL3-basic luciferasa (Takara Bio Inc., Otsu, Shiga, Japón) para construir plásmido tipo salvaje (WT) (PSAT1-WT); plásmido recombinante mutante (MUT) (PSAT1-MUT) formulado mutando sitio de unión con kit mutagénesis puntual (Takara Bio Inc.). CE vasculares en fase logarítmica de crecimiento sembradas en placa 96 pozos. Al ~70 % confluencia, plásmidos PSAT1-WT y PSAT1-MUT mezclados con mimético NC y mimético miR-133a-3p por Lipofectamine 2000 y co-transfectados en CE vasculares. Células recolectadas y lisadas 48 h post-transfección, actividad luciferasa verificada con kit detección luciferasa (Promega, Madison, WI, EUA).

Análisis Estadístico

Todos los datos analizados con SPSS 21.0 (IBM Corp., Armonk, NY, EUA). Datos de enumeración como tasa/porcentaje, análisis chi-cuadrado o Fisher. Datos de medición con distribución normal como media ± DE. Comparación dos grupos: prueba *t*; múltiples grupos: ANOVA unidireccional + prueba post-hoc Tukey. *P* < 0,05 significativo.

Resultados

Datos Generales de Pacientes con AI

La Tabla 2 compara datos generales del grupo AI y control. Información detallada en Tabla 2.

Expresión de miR-133a-3p Relacionada con Número y Tamaño de AI

Al analizar relación entre expresión de miR-133a-3p y características clinicopatológicas de AI, la Tabla 3 muestra que, según expresión relativa media de miR-133a-3p en AI, 75 casos se dividieron en grupo alta expresión (n=47) y baja expresión (n=28). Análisis chi-cuadrado o Fisher mostró que miR-133a-3p no se asoció a edad, género, forma y posición de aneurisma (todos *P* > 0,05), pero sí a número y tamaño (ambos *P* < 0,05).

Expresión de miR-133a-3p Disminuye y PSAT1, GSK3β, β-Catenina Aumentan en Tejidos de AI

RT-qPCR determinó expresión de miR-133a-3p en AI: frente a arteriolas intracraneales normales (control), miR-133a-3p se redujo en tejidos de AI (grupo AI) (*P* < 0,05) (Fig. 1a). RT-qPCR y *western blot* mostraron que PSAT1, GSK3β y β-catenina aumentaron en tejidos de AI vs. normales (todos *P* < 0,05) (Fig. 1a-c).

Expresión de miR-133a-3p disminuye y PSAT1, GSK3β, β-catenina aumentan en tejidos de AI. a Expresión de miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, β-catenina en grupo AI y normal. b Bandas proteicas de PSAT1, GSK3β, β-catenina. c Expresión proteica por *western blot*. n=75, *P* < 0,05 vs. control. Datos como media ± DE, prueba *t* muestras independientes.

Cambios Patológicos de Aneurisma y Expresión de MMP-9 y VEGF en Tejidos de AI

Observación directa: en control, vasos en tejidos arteriales eran rojo brillante, sin placas ateroscleróticas ni trombos laterales evidentes en luz. En grupo AI, tumor de aneurisma mayormente marrón u oscuro, aspecto escrotiforme o fusiforme, textura dura. Al abrir tumor, aparecían placas ateroscleróticas blancas u oscuras en pared (planas, redondas u ovales). En algunas muestras, trombo mural en cavidad, textura blanda. Pared del tumor se adelgazaba desde cuello; algunas solo membrana fibrosa delgada en ápice, algunas rotas. Fisura de aneurisma rota en ápice o cerca.

Tinción HE: en control, pared de arteriolas normales grosor uniforme; estructura anatómica íntima, media, adventicia clara e intacta; morfología celular normal; sarcolema de células adyacentes unido estrechamente; células inflamatorias raras. En grupo AI: protrusiones locales en cavidad vascular distal lateral en ápice de bifurcación de arteria intracraneal; ángulo de aneurisma se volvía obtuso y menor; pérdida local de CE. Pocas muestras mostraron migración de capa de células musculares lisas a íntima y proliferación miógena intimal. CE disminuidas o desaparecidas. Capa endotelial compuesta por células miógenas hiperplásicas y CE dispuestas linealmente, o por CE apoptóticas y células sanguíneas adheridas a luz. Vacuolas degeneradas con interrupción de continuidad. Algunas desprendidas con membrana basal, fibras colágenas intimal aumentadas. Aterosclerosis alterada, pared arteriolar visiblemente adelgazada y llena de abundantes tejidos conectivos escaleriformes. Infiltración y difusión inflamatoria en todas capas, principalmente media y adventicia. Depósitos de lípidos y cristales de colesterol en algunas células. Algunas paredes tumorales completamente o localmente adelgazadas y expandidas hacia afuera (Fig. 2a, b).

Cambios patológicos y expresión de MMP-9 y VEGF en AI. a Tejido arteriolas normales control tinción HE (×10). b Tejido AI tinción HE (×10). c Ultraestructura arteriolas normales control microscopio electrónico (×10 000). d Ultraestructura tejido AI microscopio electrónico (×10 000). e Expresión MMP-9 control y AI inmunohistoquímica (×200). f Expresión VEGF control y AI inmunohistoquímica (×200).

Microscopía electrónica: en arteriolas normales, fibras matriz de pared vascular cerebral visibles, sin lesión endotelial, pirnosis o degeneración celular. En tejidos AI: lesión endotelial evidente, pirnosis nuclear o degeneración vacuolar, disminución células musculares lisas medias, pirnosis nuclear mayoritaria, agregación cromatina y cuerpos apoptóticos. Algunas células con hinchazón mitocondrial y pérdida estructura interna normal. Matriz extracelular que forma citoesqueleto borrosa, material amorfo floculoso. Muchos fragmentos en partes faltantes de células (Fig. 2c, d).

Inmunohistoquímica para MMP-9 y VEGF: en 75 casos control, sin expresión de MMP-9 ni VEGF. En 75 muestras AI, 60 casos expresión positiva MMP-9. MMP-9 positivo en íntima y adventicia de pared AI, no uniforme; citoplasma pardo amarillento. VEGF positivo en 66 de 75 casos AI. En pared AI, alta expresión positiva en media y adventicia, baja en íntima; citoplasma pardo amarillento (Fig. 2e, f). Expresión MMP-9 y VEGF en ambos grupos en Tabla 4.

Identificación de CE Vasculares

Expresión de factor VIII y CD31 en CE analizada por inmunohistoquímica. CE vasculares reaccionaron positivamente a anticuerpos antígeno factor VIII y CD31, tasa positiva 95 %. Además, abundantes gránulos pardos en citoplasma; quinta pasada de células con tinción parda dramáticamente mayor que pasada primaria (Fig. 3a, b).

CE vasculares reaccionan positivamente a antígenos FVIII y CD31. a Identificación CE por CD31. b Identificación CE por FVII.

Sobreexpresión de miR-133a-3p y Regulación Negativa de PSAT1 Suprimen Apoptosis y Promueven Proliferación y Migración de CE en AI

Citometría de flujo, RT-qPCR y *western blot* observaron apoptosis y expresión Bax/Bcl-2 en CE de AI tras tratamiento con mimético miR-133a-3p o si-PSAT1. Frente a control, tasa apoptosis y expresión Bax aumentaron en grupo AI y Bcl-2 disminuyó (todos *P* < 0,05). Grupo AI, mimético NC y si-NC sin cambios significativos (todos *P* > 0,05). Comparado con si-NC y mimético NC, tasa apoptosis en si-PSAT1 y mimético miR-133a-3p se suprimió, Bax disminuyó, Bcl-2 aumentó (todos *P* < 0,05). Frente a mimético miR-133a-3p, tasa apoptosis y Bax aumentaron, Bcl-2 disminuyó en grupo mimético miR-133a-3p + oe-PSAT1 (todos *P* < 0,05) (Fig. 4a-e).

Alta expresión miR-133a-3p y baja PSAT1 inhiben apoptosis y promueven proliferación y migración de CE de AI. a Detección apoptosis CE por citometría flujo. b Tasa apoptosis CE cada grupo. c Expresión Bax y Bcl-2 en CE por RT-qPCR. d Bandas proteicas Bax y Bcl-2. e Expresión proteica Bax y Bcl-2 en CE por *western blot*. f Ensayo MTT detecta actividad proliferación CE cada grupo. g RT-qPCR detecta expresión Ki-67 y Ciclina D1 cada grupo CE. h Bandas proteicas Ki-67 y Ciclina D1. i Expresión proteica Ki-67 y Ciclina D1 en CE por *western blot*. j Detección migración CE cada grupo por prueba rasguño. k Resultados estadísticos migración CE cada grupo. N=3, *P* < 0,05 vs. control. #*P* < 0,05 vs. mimético NC. &*P* < 0,05 vs. si-NC. +*P* < 0,05 vs. mimético miR-133a-3p. Datos media ± DE; ANOVA unidireccional + Tukey.

Ensayo MTT, RT-qPCR y *western blot* observaron proliferación y expresión Ki-67/Ciclina D1 en CE de AI tras mimético miR-133a-3p o si-PSAT1. Frente a control, actividad proliferación y expresión Ki-67/Ciclina D1 reducidas en grupo AI (todos *P* < 0,05). Sin diferencia significativa entre AI, mimético NC y si-NC (todos *P* > 0,05). Respecto a si-NC y mimético NC, actividad proliferación y expresión Ki-67/Ciclina D1 aumentaron en si-PSAT1 y mimético miR-133a-3p (todos *P* < 0,05). Comparado con mimético miR-133a-3p, actividad proliferación y expresión Ki-67/Ciclina D1 reducidas en grupo mimético miR-133a-3p + oe-PSAT1 (todos *P* < 0,05) (Fig. 4f-i).

Migración de CE tras 24 h tratamiento con mimético miR-133a-3p o si-PSAT1 observada por prueba rasguño. Migración en grupo AI inhibida vs. control (*P* < 0,05). Sin cambio marcado en AI, si-NC, mimético NC (todos *P* > 0,05). Comparado con si-NC y mimético NC, migración aumentó en si-PSAT1 y mimético miR-133a-3p (ambos *P* < 0,05). Frente a mimético miR-133a-3p, migración disminuyó en grupo mimético miR-133a-3p + oe-PSAT1 (*P* < 0,05) (Fig. 4j, k).

Restauración de miR-133a-3p y Depleción de PSAT1 Reducen Expresión de PSAT1, GSK3β, β-Catenina en CE de AI

RT-qPCR detectó expresión miR-133a-3p en CE de AI: frente a control, expresión reducida en grupo AI (*P* < 0,05). Sin cambio marcado en AI, mimético NC, si-NC (*P* > 0,05). Expresión en grupo mimético miR-133a-3p aumentó vs. mimético NC (*P* < 0,05). Comparado con si-NC, sin cambio distinto en si-PSAT1 (*P* > 0,05). Frente a mimético miR-133a-3p, sin diferencia significativa en grupo mimético miR-133a-3p + oe-PSAT1 (*P* > 0,05) (Fig. 5a).

Regulación positiva miR-133a-3p y negativa PSAT1 disminuyen PSAT1, GSK3β, β-catenina en CE de AI. a Expresión miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, β-catenina en CE por RT-qPCR. b Bandas proteicas PSAT1, GSK3β, β-catenina. c Expresión proteica PSAT1, GSK3β, β-catenina en CE cada grupo por *western blot*. N=3, *P* < 0,05 vs. control. #*P* < 0,05 vs. mimético NC. &*P* < 0,05 vs. si-NC. +*P* < 0,05 vs. mimético miR-133a-3p. Datos media ± DE; ANOVA unidireccional + Tukey.

Expresión PSAT1, GSK3β, β-catenina en CE de AI por *western blot* y RT-qPCR. Frente a control, expresión aumentada en grupo AI (todos *P* < 0,05). Sin cambio dramático en AI, mimético NC, si-NC (todos *P* > 0,05). Expresión en grupos mimético miR-133a-3p y si-PSAT1 degradada vs. mimético NC y si-NC (todos *P* < 0,05). Frente a mimético miR-133a-3p, expresión aumentada en grupo mimético miR-133a-3p + oe-PSAT1 (todos *P* < 0,05) (Fig. 5a-c).

Regulación Positiva de miR-133a-3p y Negativa de PSAT1 Alivian Cambios Patológicos de Tejidos AI

Probando cambios hemodinámicos tras modelado, monitorizamos velocidad flujo sanguíneo cada grupo 3 días preoperación y 12 semanas post-intervención. No hubo diferencia obvia en velocidad flujo 3 días preoperación (*P* > 0,05). Tras 12 semanas intervención, velocidad flujo en grupo AI deprimida vs. normal (*P* < 0,05). Sin diferencia distinta en grado disminución velocidad en AI, mimético NC, si-NC, mimético miR-133a-3p + oe-PSAT1 (todos *P* > 0,05). Comparado con si-NC y mimético NC, velocidad aumentó en mimético miR-133a-3p y si-PSAT1 (ambos *P* < 0,05). Frente a mimético miR-133a-3p, velocidad disminuyó en grupo mimético miR-133a-3p + oe-PSAT1 (*P* < 0,05) (Fig. 6a).

miR-133a-3p regulado positivamente y PSAT1 negativamente alivian cambios patológicos tejidos AI. a Cambios hemodinámicos cada punto temporal tras modelado exitoso ratas. b Cambios tejido AI post-transfección. n=12, *P* < 0,05 vs. normal. #*P* < 0,05 vs. mimético NC. &*P* < 0,05 vs. si-NC. +*P* < 0,05 vs. mimético miR-133a-3p. Datos media ± DE; ANOVA unidireccional + Tukey.

Cambios tejidos AI verificados por tinción HE. En normal: fibras elásticas capa media tejido vascular intracraneal ordenadas, estructura ondulada normal proteína elástica, sin rotura ni degradación. Frente a normal: luz tejido vascular intracraneal agrandada, estructura ondulada proteína elástica desaparecida, fibra elástica capa media local rota, algunas fibras completamente degradadas en grupo AI. Sin cambio distinto morfología tejidos AI en si-NC, mimético NC, AI, mimético miR-133a-3p + oe-PSAT1. Contrastando con si-NC y mimético NC, estructura ondulada proteína elástica en tejido vascular intracraneal de ratas en grupos mimético miR-133a-3p y si-PSAT1 existía, estructura vascular proteína elástica local ligeramente desordenada, pero sin fractura ni disolución (Fig. 6b).

Alta Expresión miR-133a-3p y Baja PSAT1 Reducen PSAT1, GSK3β, β-Catenina, VEGF, MMP-9 en Tejidos AI In Vivo

RT-qPCR detectó expresión miR-133a-3p en tejidos AI *in vivo*: frente a normal, expresión declinó en grupo AI (*P* < 0,05). Sin cambio obvio en AI, mimético NC, si-NC (todos *P* > 0,05). Expresión en grupo mimético miR-133a-3p elevada vs. mimético NC (*P* < 0,05). Comparado con si-NC, sin cambio marcado en si-PSAT1 (*P* > 0,05). Frente a mimético miR-133a-3p, sin diferencia significativa en grupo mimético miR-133a-3p + oe-PSAT1 (*P* > 0,05) (Fig. 7a).

Sobreexpresión miR-133a-3p y baja expresión PSAT1 disminuyen PSAT1, GSK3β, β-catenina, VEGF, MMP-9 en tejidos AI *in vivo* y PSAT1 es gen diana de miR-133a-3p. a Detección expresión miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, β-catenina en tejidos AI ratas cada grupo por RT-qPCR. b Bandas proteicas PSAT1, GSK3β, β-catenina. c Detección expresión proteica PSAT1, GSK3β, β-catenina en tejidos AI ratas cada grupo por *western blot*. d Bandas proteicas VEGF y MMP-9. e Detección expresión proteica VEGF y MMP-9 en tejidos AI ratas cada grupo por *western blot*. f Predicción sitio diana PSAT1 unión miR-133a-3p por Target Scan. g Resultado ensayo luciferasa dual. a-e, n=12; f-g, N=3, *P* < 0,05 vs. normal/WT+NC. #*P* < 0,05 vs. mimético NC. &*P* < 0,05 vs. si-NC. +*P* < 0,05 vs. mimético miR-133a-3p. Datos media ± DE; ANOVA unidireccional + Tukey.

Expresión PSAT1, GSK3β, β-catenina en tejidos AI *in vivo* por *western blot* y RT-qPCR. Frente a normal, expresión aumentada en grupo AI (todos *P* < 0,05). Sin cambio marcado en AI, mimético NC, si-NC (todos *P* > 0,05). Expresión en grupos mimético miR-133a-3p y si-PSAT1 disminuida vs. mimético NC y si-NC (todos *P* < 0,05). Frente a mimético miR-133a-3p, expresión aumentada en grupo mimético miR-133a-3p + oe-PSAT1 (todos *P* < 0,05) (Fig. 7a-c).

*Western blot* verificó expresión VEGF y MMP-9 en tejidos AI *in vivo*: frente a normal, VEGF y MMP-9 aumentados en grupo AI (ambos *P* < 0,05). Sin cambio obvio en AI, mimético NC, si-NC (todos *P* > 0,05). Respecto a mimético NC y si-NC, VEGF y MMP-9 disminuyeron en mimético miR-133a-3p y si-PSAT1 (todos *P* < 0,05). Frente a mimético miR-133a-3p, VEGF y MMP-9 aumentaron en grupo mimético miR-133a-3p + oe-PSAT1 (todos *P* < 0,05) (Fig. 7d, e).

PSAT1 es Gen Diana de miR-133a-3p

Software predicción online (https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/) usado para predecir y analizar sitio diana PSAT1 unión a miR-133a-3p, y secuencia región 3'UTR combinada PSAT1 y miR-133a-3p. Para probar que sitio unión predicho de miR-133a-3p causaba cambio en actividad luciferasa, se diseñaron secuencia mutante y salvaje de 3'UTR PSAT1 eliminando sitio unión miR-133a-3p. Actividad luciferasa verificada por co-transfección mimético miR-133a-3p y plásmidos recombinantes WT (Wt-miR-133a-3p/PSAT1) o MUT (Mut-miR-133a-3p/PSAT1) en CE vasculares. Resultados: mimético miR-133a-3p sin efecto distinto en actividad luciferasa en grupo Mut-miR-133a-3p/PSAT1 (*P* > 0,05), mientras actividad en grupo Wt-miR-133a-3p/PSAT1 disminuyó marcadamente (*P* < 0,05) (Fig. 7f, g).

Discusión

El AI es dilatación anómala de arteria intracraneal que debilita pared arterial al empujar continuamente hacia afuera, aumentando riesgo de rotura [17]. En estudio de Liu et al., algunos miARN modulan proliferación de células musculares lisas vasculares, asociada a AI [18]. Estudio reciente prueba que miARN circulantes pueden ser biomarcadores para evaluar posibilidad de AI en individuos alto riesgo [19]. Se considera que PSAT1 puede estar involucrado en espectro esquizofrenia y alterar metabolismo serina [20]. Estudio actual diseñado para explorar papel regulador de miR-133a-3p modulando lesión endotelial vascular y AI vía vía PSAT1/GSK3β/β-catenina.

En este estudio, se analizó relación entre expresión miR-133a-3p y características clinicopatológicas AI: expresión miR-133a-3p no relacionada con edad, género, forma, posición aneurisma, pero asociada a número y tamaño. Algunos autores consideran que estrés cortante flujo sanguíneo regional en pared arterial induce expresión de proteína quimioatrayente monocitaria-1 (MCP-1) y proteína inflamatoria macrófaga 1α (MIP-1α) por fibroblastos y CE vasculares en pared vascular. Quimioatrayentes MCP-1 y MIP-1α altamente reactivos causan agregación macrófagos en pared vascular y median respuesta inflamatoria, inducen excitación factor transcripción nuclear c-Jun y regulan activación proteína activada 1 (AP-1), activan promotor MMP-9 en dominio estructural elevando expresión ARNm MMP-9, y finalmente inducen disolución matriz extracelular pared vascular, causando formación AI [21-23]. Saito et al. [24] hallaron células MMP-9 positivas principalmente de macrófagos capa media y adventicia, certificando que MMP-9 expresado por macrófagos media degeneración pared arterial, llevando a formación aneurisma arterial. Estudios indican MMP-9 vinculado a formación AI. Nuestros resultados revelan MMP-9 regulado positivamente en AI; especulamos miR-133a-3p podría involucrarse en ocurrencia y desarrollo AI regulando vía PSAT1/GSK3β/β-catenina y luego MMP-9. Encontramos que restaurar miR-133a-3p redujo expresión PSAT1, GSK3β, β-catenina y MMP-9 en tejidos AI. Realizaremos investigación futura para verificar hallazgos.

Nuestro estudio aporta evidencia sustancial: expresión miR-133a-3p disminuida y PSAT1, GSK3β, β-catenina elevados en AI. Evidencia emergente sugiere miR-133a-3p papel supresor en distintos tumores. Estudio reciente: expresión miR-133a-3p drásticamente degradada en tejidos cáncer mama vs. no cancerosos [25]. Otro: expresión miR-133a-3p declinada en cáncer próstata avanzado (CaP) vs. tejidos adyacentes normales o lesiones benignas, especialmente CaP metastásico óseo [26]. Efecto promotor PSAT1 en otras enfermedades hallado en literatura. PSAT1 expresión notablemente aumentada en cáncer pulmón no microcítico (CPNM) y pronostica mal resultado clínico [27]. PSAT1 considerado gen más regulado positivamente en tumores CCR y altamente expresado en pacientes quimiorresistentes [28]. Actividad GSK3β elevada en tejidos cancerosos [29]. Además, nivel fosforilación GSK3β y expresión β-catenina nuclear también aumentados, sugiriendo vía GSK3β/β-catenina participaría en regulación osteopontina [30].

Otros resultados de nuestros datos: regulación positiva miR-133a-3p y negativa PSAT1 suprimieron apoptosis y promovieron proliferación y migración CE AI, redujeron VEGF y MMP-9 en tejidos AI. Previamente se sugirió que sobreexpresión miR-133a-3p retrae invasión, crecimiento y mitosis células carcinoma escamoso oral diana COL1A1 [31]. Expresión alta miR-133a-3p reprime propagación células CEE, promueve apoptosis, reduce migración e invasión CEE diana COL1A1 [32]. Otro estudio verificó que regulación positiva transitoria miR-133a-3p suprime migración, invasión y crecimiento células carcinoma vesícula biliar diana directa proteína recombinante señal unión Jκ [33]. De igual modo, este estudio sugiere miR-133a-3p ejerce papel en AI diana PSAT1. PSAT1 sobreexpresado impulsa crecimiento células CEE e invasión matrigel *in vitro*, e inyección ratones con células CEE alta expresión PSAT1 induce formación tumoral *in vivo* [14]. Otro estudio reporta PSAT1 altamente expresado pronostica mal resultado clínico, aumenta tumorigenicidad y proliferación *in vivo* e *in vitro* [13]. Investigación previa confirma PSAT1 promueve progresión ciclo celular, proliferación y tumorigenicidad mediante experimentos pérdida/ganancia función [27]. Se indica MMPs son enzimas que escinden sustratos proteicos mediante mecanismo conservado activando molécula agua unida a sitio activo por ion Zn²⁺ [34]. MMP-9 proteasa distinta con gran influencia procesos biológicos [35]. Estudio sostiene MMP-9 elevado en grupos aneurisma vs. control [36]. Factor crecimiento endotelial vascular-A (VEGF-A) reconocido modulador clave diferenciación endovascular trofoblasto [37]. Estudio revela expresión PSAT1 silenciada suprime VEGF, β-catenina, fosforilación GSK3β [10].

Conclusiones

En conclusión, nuestro estudio confirma la hipótesis: la sobreexpresión de miR-133a-3p o la regulación negativa de PSAT1 frenan el daño de células endoteliales y promueven su proliferación inhibiendo la vía GSK3β/β-catenina en AI. Estos hallazgos aportan nueva perspectiva para terapia diana novedosa en AI. Subrayan papel miR-133a-3p en AI respecto a vía PSAT1/GSK3β/β-catenina. Sin embargo, no puede concluirse claramente sobre efectos miR-133a-3p y PSAT1 debido a investigaciones limitadas. Requiere monitoreo riguroso y reporte apropiado en futuros ensayos clínicos.