Nanopartículas Au Nanocage@PEG Altamente Biocompatibles: Un Nuevo Agente de Contraste para TC con Mejora de la Imagen In Vivo

Resumen

En los últimos años, los agentes de contraste se han utilizado ampliamente en tecnología de imagen para mejorar la calidad. Las nanopartículas presentan una mejor capacidad de detección in vivo que los agentes de contraste moleculares convencionales. En este estudio, se sintetizó un nuevo tipo de nanopartículas Au nanocages@PEG (AuNC@PEG) con un fuerte coeficiente de absorción de rayos X como agente de contraste para imágenes de tomografía computarizada (TC). Los resultados mostraron que las AuNC@PEG tenían buena dispersión acuosa, baja citotoxicidad y fuerte capacidad de absorción de rayos X. Además, los estudios in vivo demostraron que las AuNC@PEG sintetizadas presentan una mejora evidente del contraste, tiempo prolongado de circulación sanguínea y toxicidad insignificante in vivo. Por lo tanto, las AuNC@PEG funcionalizadas sintetizadas en este estudio tienen un gran potencial para aplicaciones clínicas en imágenes de TC.

Introducción

En los últimos años, la tomografía computarizada (TC) ha sido la técnica de imagen diagnóstica más utilizada en entornos clínicos, con amplia aplicación en el estudio de diversos tejidos humanos. Debido a su fuerte capacidad de penetración, alto contraste y procesamiento de imagen relativamente simple, la TC se considera la técnica diagnóstica por imagen no invasiva más poderosa en el sistema médico moderno [1, 2]. Sin embargo, durante el proceso de imagen, no existe contraste natural entre la lesión y algunas estructuras circundantes. Por ello, debe utilizarse un agente de contraste —una sustancia con densidad relativamente mayor o menor— para distinguir la estructura, tejido u órgano objetivo. Además, esta sustancia tiene capacidades de absorción variables en diferentes tejidos y puede observarse mediante irradiación de rayos X en tejidos blandos. El uso de algunas moléculas y varios agentes de contraste de micropartículas en imágenes de TC ha sido evaluado [3,4,5].

Actualmente, el agente de contraste más utilizado para TC es una molécula orgánica que contiene yodo. Las moléculas yodadas, como el ion yoduro o preparaciones no iónicas, se emplean ampliamente como agentes de contraste para TC en entornos clínicos. Aunque las moléculas yodadas pueden proporcionar una buena mejora del contraste en TC, presentan una rápida tasa de depuración renal, un corto tiempo de circulación en el cuerpo y propiedades alergénicas, lo que limita significativamente sus aplicaciones adicionales [6, 7]. Debido a la rápida eliminación del revelador de yodo, la ventana de tiempo efectiva para la imagen del pool sanguíneo se ve seriamente limitada, dificultando la obtención de imágenes de alto contraste. Además, la rápida depuración de una gran dosis de fármacos puede tener efectos secundarios potenciales en el riñón [8, 9].

En la última década, la aplicación de nanopartículas en biomedicina, particularmente en imágenes diagnósticas, ha recibido considerable atención [10]. Comparadas con los agentes de contraste basados en yodo, las nanopartículas poseen cargas de características de contraste que las moléculas pequeñas no tienen, además de un tamaño, forma y superficie específicos [11, 12]. Generalmente, las nanopartículas con un número atómico grande, como oro, plata y otras nanopartículas metálicas, tienen un excelente coeficiente de absorción de rayos X; por tanto, poseen una notable capacidad de mejora del contraste [13, 14]. Entre estas nanopartículas, las de oro se han desarrollado rápidamente en el campo biomédico y se consideran un sustituto de los agentes de imagen basados en yodo debido a su significativa inercia biológica y facilidad de síntesis y modificación de superficie [15,16,17]. Las nanopartículas de oro tienen mayor tiempo de circulación sanguínea, menor riesgo de nefrotoxicidad y mayor coeficiente de absorción de rayos X que los compuestos de yodo. Por tanto, puede administrarse una dosis menor y el riesgo de efectos secundarios es bajo [18]. Varias nanopartículas de oro, incluidas nanoesferas, nanobarras y nanoestrellas, se han utilizado ampliamente como agentes de contraste para imágenes de TC [19, 20], con resultados prometedores. Entre las diversas nanoestructuras de oro, las nanocajas de Au presentan un interior hueco y una pared delgada porosa; así, tienen mayor área superficial y una capacidad de imagen de TC más efectiva que otras nanopartículas de oro con diferentes morfologías [21, 22]. En años recientes, las nanocajas de Au se han utilizado como potenciadores de contraste para tomografía de coherencia óptica y tomografía fotoacústica, mostrando buen rendimiento. Asimismo, debido a su gran área de absorción, son transductores fototérmicos efectivos [23, 24]. A nuestro conocimiento, pocos estudios han evaluado el uso de nanocajas de Au como agentes de contraste para TC. Basándonos en los estudios mencionados, exploramosさらに el uso de nanocajas de Au como agentes de contraste para TC. La aplicación de nanopartículas en imágenes de TC requiere superficies con biocompatibilidad y actividad biológica. El polietilenglicol (PEG) es un polímero biodegradable y biocompatible, también utilizado como material "sigiloso" para prevenir la captura por el sistema reticuloendotelial (RES) y mejorar la biocompatibilidad, la capacidad de depuración renal y el tiempo de circulación sanguínea; así, las nanopartículas PEGiladas pueden retenerse en la sangre durante períodos prolongados [15, 25,26,27,28].

En este estudio, se prepararon y caracterizaron nuevas AuNC@PEG. Posteriormente, se evaluó la biocompatibilidad in vitro mediante colorimetría MTT, método de fuga de lactato deshidrogenasa (LDH), ensayo de concentración de especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares, tinción Calcein-AM/PI y otras técnicas experimentales. Además, se realizaron análisis hematológicos e histológicos para determinar la toxicidad in vivo. Los resultados mostraron que las AuNC@PEG presentan gran biocompatibilidad in vitro e in vivo. Además, se encontró que las AuNC@PEG tienen una mayor capacidad de imagen de TC in vitro e in vivo. Estos resultados experimentales demostraron que las AuNC@PEG sintetizadas tienen ventajas evidentes, como fuerte contraste, largo tiempo de circulación sanguínea y bajo riesgo de nefrotoxicidad. Por tanto, las AuNC@PEG funcionalizadas sintetizadas en este estudio tienen gran potencial para aplicaciones clínicas en imágenes de TC.

Materiales y Métodos

Todos los protocolos experimentales, incluidos los detalles relevantes, fueron aprobados por el Comité Regional de Ética de la Universidad Médica de Jinzhou en la provincia de Liaoning, China.

Materiales e Instrumentos

Los kits de prueba de LDH y ROS se adquirieron del Instituto de Bioingeniería de Nanjing, China, y los kits de tinción Calcein-AM/PI de Shanghai Dongren Chemical Technology Co., Ltd., China. Los demás reactivos y disolventes químicos se compraron a Sigma-Aldrich. Todas las secciones se evaluaron mediante microscopía de fluorescencia (DMI4000B, Leica, Wetzlar, Alemania). Las características de las nanopartículas sintetizadas se evaluaron con microscopio electrónico de transmisión (TEM). Se utilizó un escáner TC espiral de 256 filas y 512 cortes (Philips, Alemania), con los siguientes parámetros de imagen: grosor de corte, 0,625 mm; voltaje de tubo, 100 kVp; y corriente de tubo, 100 mA.

Síntesis de AuNC@PEG

Las nanocajas de Au se prepararon mediante una simple reacción de reemplazo galvánico entre nanocubos de Ag y solución de HAuCl₄, según un estudio previo [29, 30]. Típicamente, se prepararon nanocubos de Ag de 25 nm en glicol dietileno y se utilizaron como plantillas para sintetizar nanocajas de Au de 30 nm. Luego, se añadió SH-PEG (PM ≈ 2000, 10 mg disueltos en 5 mL de solución salina fosfato amortiguada - PBS) a la solución de AuNC (pH 8,0, 6,55 nM, 6 mL) y se agitó durante toda la noche en oscuridad bajo protección de nitrógeno. Tras lavar las AuNC@PEG tres veces más, se dispersaron en solución acuosa.

Evaluación de la Toxicidad In Vitro

En este estudio, se utilizaron colorimetría MTT, método de fuga de LDH, ensayo de concentración de ROS intracelulares y tinción Calcein-AM/PI para detectar la toxicidad de las AuNC@PEG sintetizadas in vitro. Las células HUVEC se sembraron en placas de 96 pocillos con una densidad de 1 × 10⁴/pocillo. Se utilizó medio RPMI-1640 suplementado con 10% suero fetal bovino, penicilina (100 μg/mL) y estreptomicina. Las células se cultivaron a 37 °C en incubadora con 5% dióxido de carbono durante 12 h. Posteriormente, se añadió medio con AuNC@PEG a diferentes concentraciones (10, 20, 50, 100, 200, 500 y 1000 μg/mL) para cultivo adicional. Tras 24 h, se realizó el ensayo MTT. El medio de cultivo sin nanopartículas se usó como control en cada grupo.

Luego, se determinó el contenido de lactato deshidrogenasa (LDH) liberado por células HUVEC tratadas con AuNC@PEG a diferentes concentraciones para evaluar la toxicidad in vitro. Las células se sembraron de forma similar al ensayo MTT y se trataron con AuNC@PEG a las mismas concentraciones durante 24 h. El sobrenadante se separó, centrifugó y transfirió a una placa limpia de 96 pocillos. La actividad de LDH en el medio se evaluó según las instrucciones del fabricante, y la absorbancia se determinó usando un instrumento de etiquetado enzimático (450 nm).

Basado en el principio de medición de concentración de ROS intracelulares usando el kit ROS, el DCFH se oxidó a diclorofluoresceína (DCF), una sustancia fuertemente fluorescente verde, en presencia de 2',7'-diclorofluoresceína diacetato (DCFH-DA). Las células HUVEC se cultivaron en placas de 24 pocillos durante 12 h, se trataron con AuNC@PEG a diferentes concentraciones (50, 100, 200 y 500 μg/mL) durante 24 h, e incubaron con DCFH-DA a 37 °C durante 40 min. Las células tratadas con peróxido de hidrógeno (H₂O₂) se usaron como control positivo. La intensidad de fluorescencia se observó mediante microscopía de fluorescencia (λex, 485 nm; λem, 525 nm). Antes de la evaluación, se lavó tres veces con medio libre de suero y hielo.

Para tinción de células vivas/muertas, las células HUVEC se sembraron en placas de 24 pocillos y cultivaron durante 12 h. Luego, se trataron con AuNC@PEG a diferentes concentraciones (10, 20, 50, 100, 200, 500 y 1000 μg/mL) durante 24 h. Tras digestión con tripsina-EDTA mediante centrifugación, las células se lavaron con PBS (pH = 7,4); luego, la suspensión celular preparada se mezcló con el reactivo Calcein-AM/PI preconfigurado y se cultivó a 37 °C durante 15 min. Para detectar la toxicidad de AuNC@PEG, se evaluó el número de células muertas mediante microscopía de fluorescencia.

Modelo Animal

Todos los procedimientos de experimentos con animales se realizaron según los criterios establecidos por el Comité de Protección y Uso de Animales de la Universidad Médica de Jinzhou. Tras el experimento, los animales fueron sacrificados según principios humanitarios. En este estudio se utilizaron ratas Sprague Dawley adultas de 250–300 g (adquiridas del Centro de Animales de la Universidad Médica de Jinzhou). Todos los animales se dividieron aleatoriamente en grupos. Se administró solución de cloral hidrato (10% p/v) vía intraperitonea; luego, todos los materiales se inyectaron vía vena caudal.

Imágenes TC In Vitro e In Vivo

Para imágenes TC in vitro, AuNC@PEG a diferentes concentraciones y soluciones de yodo se colocaron en tubos EP y se dispusieron en orden adecuado, realizándose escaneo TC de frente a atrás. En el escaneo TC in vivo, tras administrar anestesia, los animales se escanearon de cabeza a cola, usando el centro de la cavidad abdominal como referencia. La posición de los animales no cambió en cada escaneo. Todos los datos originales (imagen de 0,625 mm) se transmitieron a la estación de trabajo Philips para análisis mediante TC.

Evaluación de la Toxicidad In Vivo

El análisis hematológico se realizó mediante técnica estándar de recolección de sangre de vena safena. Los tejidos de corazón, hígado, bazo, pulmón y riñón de las ratas se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 48 h y se incluyeron en parafina tras deshidratación. El corte de parafina tuvo 5 μm de grosor y se montó en portaobjetos. Se realizó tinción de hematoxilina-eosina (H&E) y se analizó bajo microscopio.

Análisis Estadístico

Los datos se analizaron mediante análisis de varianza unidireccional, usando el valor P como índice. Un valor P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo, expresado como valor medio ± DE.

Resultados y Discusión

Síntesis y Caracterización de AuNC@PEG

La funcionalización superficial y el control del tamaño son dos factores clave para desarrollar nanoagentes de contraste de alto rendimiento [15]. La estructura y características de AuNC@PEG se determinaron mediante TEM y DLS. La Fig. 1a muestra que el tamaño de AuNC@PEG era de aproximadamente 40 nm con alta uniformidad; mientras tanto, el radio de hidratación de AuNC@PEG también se usó para probar la dispersión en solución, como se muestra en Fig. 1b, el radio de hidratación fue de aproximadamente 50 nm, indicando que AuNC@PEG eran muy estables sin agregación. Las AuNC@PEG tienen un tamaño menor e inercia biológica relativamente buena, lo que es mejor para aplicaciones en nanomedicina. Además, la estructura de jaula hueca indica grandes áreas superficiales internas y externas específicas y mejor capacidad de imagen TC, y las paredes metálicas circundantes proporcionan protección adicional para las cargas durante su procesamiento, transporte y almacenamiento. Con su evidente estructura núcleo-cáscara, el exterior está recubierto con PEG de aplicabilidad biológica, lo que puede mejorar eficazmente la biocompatibilidad y escapar de la captura por macrófagos.

Imágenes TEM de AuNC@PEG (a) y DLS de AuNC@PEG (b)

Seguridad y Estabilidad de AuNC@PEG In Vitro

Antes de usar AuNC@PEG para imágenes in vivo, evaluamos su seguridad y estabilidad. El efecto de AuNC@PEG sobre la viabilidad de células HUVEC se detectó mediante ensayo MTT (Fig. 2a). Las células se trataron con AuNC@PEG a diferentes concentraciones (10, 20, 50, 100, 200, 500 y 1000 μg/mL) durante 24 h. Los resultados del ensayo MTT mostraron que la tasa de supervivencia celular de AuNC@PEG fue similar a la del grupo control y presentó favorable biocompatibilidad cuando la concentración alcanzó 200 μg/mL. La tasa de supervivencia a 1000 μg/mL fue aún > 75%.

Evaluación MTT de la viabilidad de células HUVEC cultivadas con diferentes concentraciones de AuNC@PEG durante 24 h (a). Evaluación de lactato deshidrogenasa en sobrenadante inducido por AuNC@PEG con LDH (b). Examen de imágenes de fluorescencia a 24 h de células cultivadas con AuNC@PEG a diferentes concentraciones (H₂O₂ (I), 0 μg/mL (II), 50 μg/mL (III), 100 μg/mL (IV), 200 μg/mL (V) y 500 μg/mL (VI)) por método ROS (c). *P < 0,05, ***P < 0,001. Barras de escala: 100 μm

Además, el ensayo LDH también se usó para evaluar la biocompatibilidad in vitro. En células normales, la LDH no puede atravesar la membrana celular. Cuando la membrana se daña, la LDH se libera [31]. Así, evaluamos la seguridad midiendo LDH en el sobrenadante celular (Fig. 2b) tras tratar células con AuNC@PEG a diferentes concentraciones durante 24 h. Los resultados mostraron que el nivel de LDH liberado aumentó ligeramente comparado con células control no expuestas cuando la concentración fue < 200 μg/mL, y fue significativamente menor que el grupo control positivo (H₂O₂), consistente con los resultados MTT, encontrándose que 200 μg/mL de AuNC@PEG como concentración óptima tienen buena citocompatibilidad.

Asimismo, se realizaron pruebas de estrés oxidativo y evaluación de tinción inmunofluorescente de células vivas/muertas (Calcein-AM/PI) para detectar toxicidad in vitro. El estrés oxidativo es perjudicial para todos los sistemas vivos, y el exceso de ROS puede causarlo [32, 33]. Por tanto, medimos el nivel de ROS en las células. Tras 24 h de inducción por AuNC@PEG a diferentes concentraciones, la intensidad de fluorescencia verde a 50–200 μg/mL no difería significativamente del grupo control, y fue significativamente menor que el control positivo (Fig. 2c). La intensidad de fluorescencia es proporcional al nivel de ROS. Como se muestra en Fig. 3, la tasa de supervivencia de células HUVEC a 0–200 μg/mL fue > 90% (Fig. 3a–f). Estos resultados validaron que AuNC@PEG a 200 μg/mL son estables y tienen buena compatibilidad celular, pudiendo ser prometedores agentes de contraste clínicos.

Imágenes de microscopía de fluorescencia de tinción vivo/muerto. Tasa de supervivencia de células HUVEC tratadas con AuNC@PEG a diferentes concentraciones (0 μg/mL (a), 10 μg/mL (b), 20 μg/mL (c), 50 μg/mL (d), 100 μg/mL (e), 200 μg/mL (f), 500 μg/mL (g) y 1000 μg/mL (h)) durante 24 h. Fluorescencia verde: células vivas; roja: células muertas. Barras de escala: 100 μm

Imágenes TC In Vitro y Determinación del Valor TC

Para evaluar la factibilidad de AuNC@PEG en imágenes TC, comparamos las mejoras de contraste de diferentes concentraciones molares (AuNC@PEG) con el agente de contraste clínico (yodo). Se obtuvieron imágenes TC y se midieron los valores TC. Las AuNC@PEG se compararon con agentes de imagen de yodo a concentraciones similares (50, 100, 200, 500 y 1000 μg/mL). Los resultados mostraron que el valor TC aumentaba con la concentración (Fig. 4a), y según el análisis de valores TC de AuNC@PEG y agente de contraste de yodo (Fig. 4b), el coeficiente de absorción de AuNC@PEG fue mejor que el de agentes basados en yodo a concentraciones similares, indicando que el uso de AuNC@PEG para imágenes TC es superior.

Comparación de hallazgos de TC in vitro entre AuNC@PEG y agente de contraste basado en yodo. A medida que aumenta la concentración, la atenuación de rayos X aumenta (a). Comparación de valores Hounsfield entre AuNC@PEG y agentes basados en yodo (b). ***P < 0,001

Imágenes TC In Vivo

Debido a la alta capacidad de contraste de AuNC@PEG, comparamos la calidad de imagen con agentes de yodo in vivo. Se inyectaron 200 μL de AuNC@PEG (200 μg/mL) vía vena caudal de las ratas. El tiempo de angiografía del pool sanguíneo se evaluó mediante pre-inyección (0 min) y escaneo continuo post-inyección (10, 20, 30, 40, 60 y 90 min). Las ratas del grupo control recibieron medio de contraste de yodo a concentración adecuada. La dosis de inyección y tiempos de escaneo fueron similares a los de AuNC@PEG. Tras la inyección, observamos simultáneamente las mejoras de contraste del riñón (Fig. 5) y llenado de vejiga (Fig. Suplementaria 1). Los resultados mostraron que el riñón en el grupo AuNC@PEG alcanzó el pico a los 30 min y se excretó completamente a los 90 min, mientras que en el grupo de yodo alcanzó el pico a los 20 min y se excretó a los 60 min. Se observó que la vejiga se llenaba gradualmente con agente de contraste con el tiempo. Esto mostró que el tiempo de angiografía del pool sanguíneo de AuNC@PEG fue mejor que el del agente de yodo. La mayor circulación sanguínea de AuNC@PEG puede proporcionar mejor diagnóstico, y AuNC@PEG tiene mejores perspectivas de desarrollo.

Imágenes TC in vivo de ratas en diferentes puntos temporales tras post-inyección de AuNC@PEG

Seguridad de AuNC@PEG In Vivo

Como se muestra en Fig. 6a, los parámetros estándar de rutina sanguínea y función hepática y renal se reflejaron mediante nivel de hemoglobina, concentración media de hemoglobina corpuscular, volumen corpuscular medio, recuento de plaquetas, eritrocitos, leucocitos, concentración de albúmina, alanina aminotransferasa, aspartato aminotransferasa y creatinina. En el análisis estadístico, no se observó diferencia significativa entre grupos AuNC@PEG, agente de contraste de yodo y control (P > 0,05). Además, los órganos (corazón, hígado, bazo, pulmón y riñón) se analizaron histológicamente (Fig. 6b), 24 h tras inyección de AuNC@PEG (200 μg/mL); seccionaron y tiñeron (H&E). Comparado con grupo control (sin inyección de nanomateriales), no se encontraron cambios morfológicos evidentes ni lesiones bajo microscopio. Estos resultados confirman la seguridad y fiabilidad de AuNC@PEG in vivo.

Evaluación de toxicidad in vivo de AuNC@PEG. Rutina sanguínea y función hepática/renal: hemoglobina (I), concentración media hemoglobina corpuscular (II), volumen corpuscular medio (III), plaquetas (IV), eritrocitos (V), leucocitos (VI), albúmina (VII), ALT (VIII), AST (IX), creatinina (X) (a). Tinción H&E en órganos de ratas normales e inyectadas con AuNC@PEG a 24 h (b). Barras de escala de b: 100 μm

Conclusiones

Hemos desarrollado AuNC@PEG, un nuevo tipo de agente de contraste para TC, con características como tamaño pequeño, alto contraste, larga retención sanguínea y bajo riesgo de toxicidad. Las evaluaciones de toxicidad in vitro e in vivo mostraron que AuNC@PEG tienen buena biocompatibilidad y bajo riesgo de efectos secundarios. El rendimiento de imágenes TC in vitro e in vivo mostró que AuNC@PEG tienen mayor coeficiente de absorción de rayos X y mayor tiempo de angiografía del pool sanguíneo que agentes tradicionales basados en yodo. Además, AuNC@PEG son superiores a agentes de imagen basados en yodo, y su uso es práctico. Todos estos resultados muestran que AuNC@PEG tienen mayor coeficiente de absorción de rayos X que agentes de contraste tradicionales basados en yodo y que su rendimiento de imagen es superior. Por tanto, las AuNC@PEG funcionalizadas sintetizadas en este estudio tienen gran potencial para aplicaciones clínicas en imágenes de TC.

Disponibilidad de Datos y Materiales

Los datos brutos/procesados necesarios para reproducir estos hallazgos no pueden compartirse en este momento, ya que también forman parte de una investigación y desarrollo en curso.

Abreviaturas

TC:

Tomografía computarizada

DCF:

Diclorofluoresceína

DCFH:

Diclorofluoresceína

H₂O₂:

Peróxido de hidrógeno

LDH:

Lactato deshidrogenasa

MTT:

3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro

PBS:

Solución salina fosfato amortiguada

PEG:

Polietilenglicol

ROS:

Especies reactivas de oxígeno

TEM:

Microscopio electrónico de transmisión