Biosensor electroquímico basado en nanoescamas de disulfuro de estaño para detección rápida y sensible de cortisol salival

Resumen

El cortisol, la hormona del estrés por excelencia, es secretado por el eje hipotálamo-hipófisis-suprarrenal (HHS) y sirve como biomarcador crítico para estrés psicológico y fisiológico. La sobreexpresión prolongada de cortisol puede llevar a trastornos graves como síndrome de Cushing y enfermedad de Addison, subrayando la necesidad de detección rápida en punto de atención (POC). Aquí presentamos un ensayo electroquímico no invasivo para cortisol salival basado en una película multicapa de nanoescamas de disulfuro de estaño (SnS₂), un anticuerpo específico de cortisol (C-M_ab) y albúmina sérica bovina (BSA) inmovilizados en un electrodo de carbono vítreo (ECV). El sensor BSA/C-M_ab/SnS₂/ECV fue caracterizado por espectroscopía de impedancia electroquímica (EIE) y voltametría cíclica (VC). La voltametría de pulso diferencial (VPD) reveló una respuesta lineal a concentraciones de cortisol de 100 pM a 100 µM, con límite de detección (LOD) de 100 pM y sensibilidad de 0.0103 mA M⁻¹ cm⁻² (R² = 0.9979). Las muestras de saliva medidas con el sensor coincidieron con resultados ELISA dentro de un margen del 5%, demostrando su relevancia clínica y especificidad. El dispositivo ofrece una alternativa rápida y rentable a inmunoensayos convencionales para monitoreo de biomarcadores relacionados con estrés.

Introducción

El cortisol es una hormona esteroide liberada por el eje HHS y es el biomarcador más usado para evaluar estrés psicológico. Su ritmo circadiano alcanza pico en la mañana temprano y declina por la noche, y su desregulación puede desencadenar condiciones desde síndrome de Cushing a enfermedad de Addison. El monitoreo preciso y en tiempo real de cortisol es esencial para diagnosticar y manejar diversos trastornos relacionados con estrés, incluyendo TEPT, depresión y trastorno del espectro autista.

Los métodos de laboratorio actuales (cromatografía, radioinmunoensayo, ELISA, SPR, QCM) son de laboratorio, consumen tiempo y son costosos, limitando su uso en entornos POC. Los inmunosensores electroquímicos, basados en interacciones específicas antígeno-anticuerpo, ofrecen solución prometedora con instrumentación simple, lecturas rápidas, bajo costo y alta sensibilidad. La medición de cortisol salival es especialmente atractiva por ser no invasiva y requerir manipulación mínima de muestra.

Aunque numerosos nanomateriales de sulfuro metálico se han explorado para biosensores, el disulfuro de estaño (SnS₂) rara vez se ha usado como matriz de inmovilización de proteínas. El SnS₂ es un semiconductor tipo n con banda prohibida de 2.18-2.44 eV, alta movilidad de portadores y excelente estabilidad química, lo que lo convierte en plataforma ideal para transducción electroquímica. En este trabajo, aprovechamos nanoescamas 2D de SnS₂ para construir un sensor de cortisol altamente sensible que opera en el rango de concentración fisiológica.

Materiales y Métodos

Materiales

Hidrocortisona, anticuerpo anti-conejos cortisol (C-M_ab), hexacianoferrato potásico (II/III), β-estradiol, testosterona, progesterona, corticosterona y albúmina sérica bovina (BSA) se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Cloruro de estaño(IV) pentahidratado y tioacetamida fueron suministrados por Showa (Japón) y Alfa Aesar (UK), respectivamente. Salino fosfato tamponado (PBS) y alúmina micropulida se obtuvieron de Sigma-Aldrich y Buehler (UK). Todos los reactivos se usaron sin purificación adicional. Un kit ELISA comercial de cortisol (Cat # SA E-6000) se compró de LDN (Alemania).

Síntesis de Disulfuro de Estaño

SnCl₄·5H₂O y C₂H₅NS se disolvieron en 70 mL agua desionizada y ajustaron a pH 7.4. La solución se transfirió a autoclave hidrotérmico y calentó a 200 °C en 1 h, luego mantuvo 11 h. El polvo SnS₂ resultante se lavó con agua y etanol a 6000 rpm por 15 min y secó a 80 °C en aire, produciendo nanoescamas uniformes.

Caracterización de Materiales

Difracción de rayos X (DRX) confirmó fase hexagonal SnS₂ (JCPDS 89-2358). Microscopía electrónica de barrido de emisión de campo (MEB-EC) reveló morfología en escamas con dimensiones laterales ~300 nm. Microscopía electrónica de transmisión (MET) y difracción electrónica de área seleccionada (SAED) confirmaron estructura monocristalina con espaciados de red de 0.167 nm y 0.316 nm; las nanoescamas tenían menos de 10 nm de espesor.

Fabricación de Biosensores BSA/C-M_ab/SnS₂/ECV

Electrodos de carbono vítreo (ECV) se pulieron con suspensión de alúmina y se depositaron por gota con dispersión 5 M SnS₂. Los electrodos se incubaron secuencialmente con soluciones 1 mg mL⁻¹ C-M_ab y 1% BSA en PBS. Los sensores terminados se almacenaron a 4 °C cuando no estaban en uso. El concepto de detección y configuración se ilustran en Fig. 1.

Análisis Electroquímico

Espectroscopía de impedancia electroquímica (EIE) y voltametría cíclica (VC) se emplearon para evaluar comportamiento electroactivo del sensor. Todas las mediciones usaron celda de tres electrodos: BSA/C-M_ab/SnS₂/ECV como electrodo de trabajo, hilo Pt como contraelectrodo y electrodo de calomelano saturado como referencia, en 10 mM PBS (pH 7.4) conteniendo 5 mM Fe(CN)₆³⁻/⁴⁻. Barridos VC y voltametría de pulso diferencial (VPD) se realizaron de -0.4 V a 1.0 V a 10 mV s⁻¹.

Recolección de Muestras de Saliva y Detección Electroquímica

Dos voluntarios sanos proporcionaron 2 mL muestras de saliva al mediodía. Las muestras se congelaron a -20 °C, descongelaron, centrifugaron (3500 rpm, 15 min) y el sobrenadante se usó para análisis. Las mediciones de cortisol del sensor se compararon con resultados del kit ELISA.

Estudio de Interferencias

Interferentes potenciales (β-estradiol, testosterona, progesterona, corticosterona, cada 100 nM) se probaron incubando sensor 10 min y midiendo respuesta VC. La influencia en detección de cortisol fue inferior al 5%.

Detección de Cortisol Salival por ELISA

ELISA siguió protocolo del fabricante. Se generó curva estándar con seis concentraciones de cortisol (0, 0.1, 0.4, 1.7, 7.0, 30 ng mL⁻¹). La absorbancia se leyó a 450 nm y la curva resultante se usó para cuantificar muestras desconocidas.

Resultados y Discusión

Análisis de Material SnS₂

El patrón DRX coincide con fase hexagonal SnS₂ (JCPDS 89-2358). Imágenes MEB-EC muestran partículas uniformes en escamas de 300 nm. MET confirma escamas monocristalinas con espaciados intercapas de 0.167 nm y 0.316 nm, y espesor total bajo 10 nm.

Respuestas Electroquímicas del Electrodo

La adición de SnS₂ a ECV aumentó significativamente corriente de oxidación. La modificación posterior con anticuerpo y BSA aumentó resistencia de transferencia de carga, como reflejan datos EIE. VC del BSA/C-M_ab/SnS₂/ECV a velocidades de barrido 10-100 mV s⁻¹ mostró aumento lineal de corriente de pico, confirmando proceso redox reversible controlado por superficie.

Tanto VC como VPD demostraron disminución monótona de corriente de pico con concentración creciente de cortisol. VPD produjo relación lineal: y = -0.0103x + 0.0443 (R² = 0.9979), con LOD de 100 pM y sensibilidad de 0.0103 mA M⁻¹ cm⁻². El rango dinámico del sensor (100 pM-100 µM) cubre todo el espectro fisiológico de cortisol salival.

Estudio de Estabilidad de Almacenamiento

VC se realizó en sensores almacenados 1 día a 1 semana bajo dos condiciones: vacío-seco y 4 °C. El almacenamiento a 4 °C preservó 91% de corriente de pico redox tras 7 días, comparado con 82% bajo vacío, indicando mejor estabilidad de actividad de anticuerpo a menor temperatura.

Estudio de Interferencias

Incubación con 100 nM β-estradiol, testosterona, progesterona y corticosterona produjo <5% cambio en señal de cortisol, confirmando alta especificidad del ensayo.

Detección de Cortisol Salival usando ELISA y Métodos Electroquímicos

Muestras de saliva de dos voluntarios rindieron concentraciones de cortisol de 1.105 × 10⁻⁸ M y 3.998 × 10⁻⁹ M por ELISA, y 1.046 × 10⁻⁸ M y 3.911 × 10⁻⁹ M por sensor electroquímico - solo 2-5% discrepancia - confirmando precisión del sensor.

Comparación con Otros Estudios

Las tablas comparan nuestro sensor con sensores de cortisol no basados en oro. Ventajas del presente trabajo incluyen: (1) costo de material significativamente menor; (2) protocolo de fabricación rápido y directo; (3) LOD comparable o mejor que dispositivos existentes.

Conclusiones

Hemos demostrado un biosensor electroquímico basado en nanoescamas de disulfuro de estaño que entrega LOD de 100 pM y rango de detección 100 pM-100 µM para cortisol salival, igualando precisión ELISA. El sensor exhibe <5% interferencia de esteroides estructuralmente similares y mantiene >90% actividad tras 7 días a 4 °C. Su bajo costo, ensamblaje simple y lectura rápida lo hacen candidato convincente para monitoreo POC de estrés.