Detección Mejorada de Peróxido de Hidrógeno mediante Nanoporos Sólidos Modificados en Superficie

Resumen

Existen muchas técnicas para detección de moléculas. Pero la detección a través de nanoporos de estado sólido en solución es una tecnología prometedora, de alto rendimiento y bajo costo usada actualmente. En la presente investigación, se fabricó una plataforma de nanoporo de estado sólido para detección de peróxido de hidrógeno (H₂O₂), que no solo es un producto libre de etiqueta sino también un participante significativo en reacciones redox. Se fabricaron exitosamente nanoporos de nitruro de silicio (Si₃N₄) con diámetros ~50 nm usando haz de iones Ga enfocado, y la superficie interna del nanoporo se modificó con peroxidasa de rábano picante (HRP) empleando química de acoplamiento carbodiimida. Las enzimas HRP inmovilizadas tienen capacidad para inducir reacciones redox en un solo canal de nanoporo. Además, se monitorearon e investigaron eventos de translocación molecular en tiempo real de ABTS•+ agregado. El biosensor de nanoporo de estado sólido diseñado es reversible y puede aplicarse para detectar H₂O₂ múltiples veces.

Introducción

La tecnología de detección por nanoporo se origina en el contador Coulter y canales iónicos celulares. El nanoporo detecta moléculas cargadas en solución que pasan a través de él. La aparición de moléculas en el nanoporo cambia aparente la conductancia del poro, resultando en cambio en la señal de corriente. El cambio en la corriente proporciona información sobre tamaños y concentraciones de moléculas dentro del poro, revelando la dinámica del proceso de translocación. Algunos objetos nanoescalares pueden detectarse usando nanoporo, como nanopartículas, virus, moléculas de proteínas y secuencias de ADN. Los nanoporos son de dos tipos: biológicos y de estado sólido. El nanoporo biológico tiene menor relación señal-ruido (SNR) y mayor resolución. Proteínas pequeñas y desplegadas pueden detectarse usando nanoporos biológicos. El nanoporo de estado sólido es ajustable en tamaño y tiene mayor estabilidad. Normalmente se perfora en una lámina que divide la celda fluídica en dos partes. Un voltaje sesgado se aplica a través de una membrana delgada conteniendo un nanoporo, resultando en corriente iónica de una celda a otra. Moléculas de proteínas incluyendo estructuras plegadas y desplegadas son detectadas y analizadas por nanoporo de estado sólido. La interacción de proteínas también puede detectarse. Además, tiene capacidad para detectar cinética de proteínas. Para resolver límites en rango de detección, nanoporos de estado sólido químicamente modificados se han aplicado extensivamente, para detectar ADN monocatenario y proteínas.

Muchos métodos cuantitativos se han aplicado para detección de H₂O₂, la mayoría basados en espectrometría, quimioluminiscencia, amperometría y electroquímica. Los métodos espectrométricos y quimioluminiscentes convencionales son comúnmente lentos y costosos. El sensor de nanoporo de estado sólido tiene bajo consumo y estructura simple, y puede usarse para detectar moléculas pequeñas.

Aquí presentamos un tipo de nanoporo de estado sólido modificado con peroxidasa de rábano picante (HRP). Las HRPs se inmovilizaron en la superficie interna del nanoporo de estado sólido, las HRPs inmovilizadas permanecieron activas en la reacción redox ocurrida dentro de un solo canal de nanoporo en presencia de H₂O₂. El ABTS•+ producido en la reacción redox se agregaría, luego el ABTS•+ agregado pasó a través del nanoporo. Los eventos de translocación pueden detectarse. Para la detección de peróxido de hidrógeno, la estructura de estado sólido es simple, y puede detectar el ABTS•+ agregado usando bajo consumo de reactivos. Este sensor de peróxido de hidrógeno (H₂O₂) con nanoporo de estado sólido modificado con enzimas HRP puede lograr la detección indirectamente, a través de la detección de ABTS•+ agregado. Tiene significado instructivo para detección de molécula única y ensamblaje molecular dentro de nanoporo de estado sólido.

Métodos

Químicos y Materiales

La molécula de Peroxidasa de Rábano Picante (HRP) (1 mg mL⁻¹, Comisión de Enzimas No.1.11.1.7, 44 kDa) se compró de Xiya Reagent (Chengdu, China). La muestra (HRP) se disolvió en PBS 0.1 M filtrado 0.02 µm, almacenada a 4 °C, y usada dentro de dos días de preparación. Cloruro de potasio (KCl), N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDC), N-hidroxisuccinimida (NHS) y 2,2'-Azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico) (ABTS, 98%) se compraron de DiBo chemical technology co., LTD (Shanghai, China). Peróxido de hidrógeno (H₂O₂, 30%) se compró de Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (3-Aminopropil)trietoxisilano (3-APTES) se compró de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Experimentos se condujeron usando agua ultrapura de sistema de purificación Milli-Q (resistividad 18.2 MΩ/cm, 25 °C, Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) filtrada a través de 0.02 µm en sistema FEI Strata 201 FIB (FEI Co., Hillsboro, OR, USA), Zetasizer (Malvern Zetasizer Nano ZS), y Axopatch 700B (Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA, USA).

Fabricación de Nanoporo de Estado Sólido y Mediciones Eléctricas

Primero, una membrana delgada de Si₃N₄ (100 nm espesor) se depositó en sustrato Si de 300 µm espesor. Seguido por fotolitografía (tamaño de ventana abierta 500 × 500 µm²). Luego, la superficie de la membrana fue bombardeada con iones Ga⁺ usando sistema FEI Strata 201 FIB a potencial de aceleración 30 kV, mientras la corriente se midió como 1 pA. El tiempo de fresado fue 1.5 s bajo modo spot. Finalmente, los chips de nanoporo de estado sólido se obtuvieron y limpiaron en solución piraña fresca a 80 °C por 30 min, seguido de enjuague con agua ultrapura. Tras limpieza, el chip se ensambló en celda Teflon personalizada con dos anillos Viton para separar los dos lados del chip, formando dos reservorios para asegurar el único camino para corriente iónica a través del nanoporo. Electrodos (Ag/AgCl) se conectaron a la celda fluídica y un amplificador patch clamp (Axopatch 700B, Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA, USA) que hizo medible la corriente iónica bajo voltajes constantes, con tasa de muestreo 100 kHz para señales. El filtro Bessel de ocho polos interno del amplificador se estableció a 10 kHz. Todo el instrumento se colocó en una jaula de Faraday doble.

Resultados y Discusión

Inmovilización de Nanoporo con HRPs

El nanoporo seleccionado con diámetro ~50 nm se sumergió en solución piraña a 80 °C por 30 min. Tras tratamiento con piraña, la superficie interna del nanoporo pudo tomar grupos hidroxilo de silicio. Subsecuentemente, toda la lámina delgada se activó con (3-Aminopropil)trietoxisilano (3-APTES). Como resultado, grupos amino (-NH₂) se generaron en la superficie de la lámina.

Tras activación con 3-APTES, el chip de nanoporo se introdujo en solución PBS 0.1 M de EDC (10 mM) y NHS (20 mM). Luego, el chip de nanoporo se introdujo a peroxidasa de rábano picante (HRP) (10 ng/ml). Según resultados previos de nuestro grupo, con diferente concentración de sal de 0.1 a 2 M KCl, pH 7.0, HRP no se agregó. Debido al valor pI de HRP siendo 4.3 ± 0.2, también probamos que HRP no se agregó en 0.1 M KCl pH 6.0 y 7.0. El reactivo EDC activó los grupos carboxyl (-COOH) de HRP en un intermediario o-acoilisourea altamente reactivo. Además, el intermediario se convirtió en un éster reactivo de succinimidilamina más estable en presencia de NHS. Resultando en acoplamiento covalente del intermediario con los (-NH₂) generados en las superficies internas del nanoporo para formar enlaces amida estables (Fig. 1).

Estos procesos llevan a la inmovilización de HRPs en la superficie interna de un solo nanoporo. La realización del proceso de funcionalización se confirmó midiendo curvas corriente-voltaje (I-V) de un solo nanoporo antes y después de modificación (Fig. 2).

Caracterización de Nanoporo de Estado Sólido Modificado con HRPs

Aquí, la forma de un solo canal de nanoporo Si₃N₄ es cilíndrica. La figura 2 muestra las típicas curvas corriente-voltaje (I-V) del nanoporo sin modificar (original) y modificado en 0.1 M KCl, buffer pH 7.0 con 0.1 M PBS. Tras modificar la superficie interna del nanoporo con enzimas HRP, el tamaño del poro se volvió menor.

Según Wanunu et al., considerando la conductancia externa del nanoporo, el diámetro de nanoporo de estado sólido puede calcularse por la ecuación: d = (1 + √[1 + 16σl/(πG)]) G/(2σ). Donde d y l son diámetro y longitud del poro, G es conductancia de poro abierto, σ es conductividad de solución iónica.

Considerando efectos geométricos, tras modificación del nanoporo de estado sólido con enzimas HRP, el tamaño efectivo puede calcularse. El diámetro de un solo nanoporo puede calcularse basado en la ecuación (1). El valor de conductancia (G_unmodified) ~15 nS se obtiene de curvas I-V del nanoporo sin modificar. La conductividad (σ) de solución iónica 0.1 M KCl (25 °C), buffer pH 7.0 con 0.1 M PBS es ~1.28 S/m. Por tanto, el diámetro del nanoporo sin modificar es ~51 nm, similar al medido. Usando el mismo método, el valor de conductancia (G_modified) ~7.5 nS, y el diámetro (~34 nm) del nanoporo modificado puede calcularse. La reducción de diámetro es posible por dos razones: primera, tratar la superficie interna con 3-APTES permitiendo grupos amino (-NH₂). Segunda, el diámetro hidrodinámico (D_h) de enzima HRP es ~8 nm, las HRPs inmovilizadas podrían reducir el diámetro del poro. Aquí, el nanoporo de estado sólido modificado con HRPs con diámetro ~34 nm se usa como canal de detección de peróxido de hidrógeno.

Principio de Reacción Redox

La reacción redox se condujo dentro de un solo nanoporo modificado, y el siguiente proceso de reacción presentado concuerda bien con la reacción redox propuesta. En presencia de H₂O₂ (0.5 mM), las enzimas HRP inmovilizadas en la superficie interna del nanoporo se convirtieron en compuesto 1 inmediatamente. Luego, el compuesto 1 aceptó un electrón de la molécula sustrato reductor ABTS (1.5 mM) para generar compuesto 2. Subsecuentemente, el compuesto 2 se redujo de vuelta a la enzima en reposo vía transferencia de un electrón de otra molécula sustrato ABTS.

Los productos catiónicos (ABTS•+) de las reacciones redox se acumularon en el nanoporo único. La translocación de moléculas acumuladas desde el canal del nanoporo cambiaría la conductancia (G), y así el cambio de corriente (ΔI_b) puede encontrarse.

Detección de Eventos de Translocación

Experimentos se realizaron usando nanoporos modificados con HRP con diámetros de poro modificados (~34 nm) en 0.1 M KCl, buffer pH 7.0 con 0.1 M PBS. ABTS (1.5 mM) y H₂O₂ (0.5 mM) se añadieron al compartimento trans del nanoporo. Tras añadir ABTS y H₂O₂, se realizaron experimentos con voltajes sesgados de -100 a -800 mV, muestreando a 100 kHz. No hubo eventos de translocación hasta que el voltaje aumentó a -400 mV. La figura 3 muestra trazas representativas de corriente iónica de eventos de translocación a diferentes voltajes de -400 a -800 mV en 0.1 M KCl, 0.1 M PBS, pH 7.0.

Se observaron eventos de bloqueo de corriente en milisegundos, conducidos en 0.1 M KCl, 0.1 M PBS, pH 7.0. Al añadir reactivos H₂O₂ y ABTS al compartimento trans, enzimas HRP inmovilizadas en la superficie interna de un solo canal de nanoporo, ocurrió reacción redox. Abundancia de moléculas ABTS•+ se produjeron, una sola molécula ABTS•+ más pequeña puede no ser detectada usando nuestro nanoporo de estado sólido, debido a la resolución del sistema. Sin embargo, estas moléculas se agregan tras su producción. Por tanto, es posible detectar moléculas ABTS•+. Aquí, voltajes negativos se mantuvieron, y moléculas ABTS•+ agregadas pasaron a través de los nanoporos. Hubo flujo electroforético y electroosmótico cuando se aplicó voltaje negativo. HRP estaba cargado negativamente en 0.1 M KCl, 0.1 M PBS, pH 7.0, como resultado, se produciría capa eléctrica doble, y electroosmosis sería hacia dirección de electrodo negativo. Debido a esto, electroforesis y electroosmosis fueron hacia la misma dirección. Los ABTS•+ agregados en el canal de nanoporo único se transportarían a través del nanoporo de estado sólido, fluyendo hacia dirección de electrodo negativo.

Análisis Estadístico de Eventos de Translocación

Dado que el voltaje sesgado jugó papel clave en translocación de ABTS•+ agregado, se discutió la influencia de bloqueos de corriente de ABTS•+ agregado pasando a través del nanoporo modificado con HRPs versus voltajes aplicados. La frecuencia de ocurrencia de eventos de translocación mejoró enormemente con aumento de voltaje (Fig. 3f). A medida que el voltaje aumentó, también lo hizo la amplitud de corriente. Sin embargo, los eventos de translocación desaparecieron gradualmente cuando el voltaje sesgado se mantuvo por debajo de -300 mV, sugiriendo que ABTS•+ agregado a través de nanoporos modificados con HRPs necesitó voltaje umbral de -300 mV. La figura 4 muestra histogramas de la amplitud de corriente media de eventos de translocación medidos para ABTS•+ agregado a diferentes voltajes. Basado en curvas de ajuste, los valores pico de bloqueo de corriente (ΔI_b) son 308.4 ± 27.795 pA, 419.1 ± 20.354 pA, 478.8 ± 32.857 pA, 528.1 ± 36.98 pA, 606.9 ± 40.916 pA en -400, -500, -600, -700, y -800 mV, respectivamente, es probable que la reducción de corriente sea inducida por molécula ABTS•+ agregado pasando a través del nanoporo a diferentes voltajes. Los valores de amplitud de corriente se ajustaron con función polinómica de primer orden, produciendo pendiente -0.706 e intercepto 49.262. Sin embargo, basado en curvas de ajuste, los valores de tiempo de permanencia son 54.5 ± 21.374 ms, 42.8 ± 20.181 ms, 10.3 ± 3.05 ms, 6.0 ± 1.744 ms, 4.0 ± 1.441 ms, en -400, -500, -600, -700, y -800 mV. La figura 3h muestra función de decaimiento exponencial (t_d ~ e^(-v/v0)) empleada para ajustar tiempo de permanencia dependiente de voltajes aplicados.

El bloqueo de corriente versus tiempo de permanencia de eventos para cada ABTS•+ agregado a diferentes voltajes se ajustaron en diagramas de dispersión bidimensionales (Fig. 5). Todos los ABTS•+ agregados muestran un cluster de eventos de -400 a -800 mV, los clusters principales son debidos a ABTS•+ agregado pasando a través del nanoporo de estado sólido modificado con HRPs.

Además, el evento de translocación individual a cada voltaje fue analizado, y el bloqueo de corriente fue inducido por misma sustancia de tamaño y carga. Así, se considera que cada evento de translocación fue inducido por un solo ABTS•+ agregado. Para analizar el tiempo de translocación de ABTS•+ agregado en nuestros experimentos. La duración del bloqueo de corriente t_d se considera como tiempo de permanencia de un solo ABTS•+ agregado desde donde se produce hasta la salida del nanoporo. Aquí, otra condición se consideró, puede haber algunas enzimas HRP inmovilizadas en la entrada del nanoporo, y podrían catalizar la reacción redox. Por tanto, otros experimentos se condujeron para verificar que la reacción redox ocurrió en la superficie interna de un solo nanoporo en lugar de en la entrada. Para verificación, nanoporos sin modificar por HRPs se aplicaron y analizaron. Estos nanoporos fueron activados con 3-APTES. Y la misma concentración de HRPs (10 ng/ml), ABTS (1.5 mM) y H₂O₂ (0.5 mM) se añadieron al compartimento trans del nanoporo, voltaje sesgado negativo se aplicó en 0.1 M KCl, 0.1 M PBS, pH 7.0, debido a fuerza electroforética, HRPs no pudieron pasar a través del nanoporo. Debido a la reacción redox, ABTS•+ agregado se produjo, pero no se encontraron eventos de translocación. Es posible que ABTS•+ agregado cause efecto electrostático con HRPs y prevenga el ABTS•+ agregado pasando a través del nanoporo.

La figura 6 muestra diagramas de dispersión bidimensionales del cambio de conductancia (ΔG) versus tiempo de permanencia de eventos para cada ABTS•+ agregado a diferentes voltajes. Se encuentra que el cambio de conductancia (ΔG) se concentra principalmente en 0.8 nS. La forma de eventos de translocación es casi la misma. El valor medio de ΔG es ~0.8 nS a diferentes voltajes. Se puede especular que la exclusión de volumen de cada molécula ABTS•+ agregado es casi la misma. Es posible que efectos electrostéricos y estéricos de moléculas ABTS•+ agregadas cambien la corriente iónica. Tras análisis, se observaron dos formas típicas de trazas de corriente con translocación de ABTS•+ agregado cargado positivamente (Fig. 7). Los eventos de translocación a -700 mV como representativos. El porcentaje de dos tipos de eventos se analizó, y se observó que el porcentaje de eventos tipo 1 aumentó con aumento de voltaje, por otro lado, el porcentaje de eventos tipo 2 disminuyó. Se consideró que voltaje más alto hace la translocación más rápida que voltaje más bajo.

Las señales de bloqueo de corriente revelaron tamaño, conformación e interacción de ABTS•+ agregado pasando a través del canal de nanoporo único. Para el cambio en forma de corriente, el proceso de cambios se especuló. Para evento 1, señales de corriente tienen parte de fluctuación típica con intensidad profunda y tiempo de permanencia corto. Es posible que ABTS•+ agregado pasara a través del nanoporo desde donde se produce. Cuando ABTS•+ agregado pasa a través del nanoporo, la corriente iónica del nanoporo restaura al nivel original (Baseline) (I_0). Para evento 2, señales de corriente tienen parte de fluctuación con intensidad profunda y luego tienen etapa horizontal. Esta forma de señales puede atribuirse a interacción electrostática de ABTS•+ agregado con HRPs en la salida del nanoporo, y la corriente se recuperó lentamente al baseline.

Conclusiones

En conclusión, fabricamos un nanoporo Si₃N₄ empleando FIB exitosamente, un sistema de nanoporo único cuya superficie fue modificada con enzimas HRP enlazadas covalentemente. El efecto de las enzimas HRP inmovilizadas en un solo nanoporo de estado sólido como sensor de peróxido de hidrógeno (H₂O₂) fue afirmado investigando productos (ABTS•+) de reacciones redox ocurridas en presencia de sustratos H₂O₂ y ABTS. El radical catiónico ABTS•+ agregado producido dentro del nanoporo de estado sólido y redujo la corriente iónica en el nanoporo de estado sólido modificado con HRPs, consistente con dependencia de voltaje. Las tendencias de bloqueo de corriente mostraron dependencia lineal para voltajes sesgados aplicados. La relación entre tiempo de permanencia versus voltaje sesgado aplicado fue decaimiento exponencial (t_d ~ e^(-v/v0)). Mientras tanto, el ABTS•+ agregado pasó a través de nanoporos modificados con HRPs necesitó voltaje umbral de -300 mV. El cambio de conductancia (ΔG) ha sido calculado analíticamente y comparado a valores experimentales medidos. Los eventos de translocación fueron producidos por el ABTS•+ agregado catiónico de tamaño cierto. Esperamos que el uso de nanoporos de estado sólido permita bajar el límite de detección y mejorar la sensibilidad del sistema. Para nuestro sistema de nanoporo de estado sólido, la estructura es simple; no es susceptible a ensuciamiento y puede usarse múltiples veces.

Abreviaturas

3-APTES:

(3-Aminopropil)trietoxisilano

ABTS:

3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico

EDC:

N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida

FIB:

Haz de iones enfocado

HRP:

Peroxidasa de rábano picante

KCl:

Cloruro de potasio

NHS:

N-hidroxisuccinimida

SEM:

Microscopía electrónica de barrido

SNR:

Relación señal-ruido