Potencial antioxidante de extractos de Artemisia capillaris, Portulaca oleracea y Prunella vulgaris para la biofabricación de nanopartículas de oro y evaluación de citotoxicidad

Resultados y discusión

Actividades antioxidantes de los extractos

Se obtuvieron extractos acuosos de las partes aéreas de cada planta mediante sonicación. Los rendimientos de extracción de A. capillaris , P. oleracea y P. vulgaris fueron 14,1%, 39,12% y 28,6%, respectivamente. El rendimiento de extracción más alto se mostró en P. oleracea , seguido de P. vulgaris y por último A. capillaris . Para evaluar las actividades antioxidantes de los extractos, medimos la actividad de eliminación de radicales libres, el poder reductor y el contenido fenólico total. Las actividades de eliminación de radicales libres de los extractos se determinaron mediante ensayos de DPPH y ABTS. El DPPH se usa ampliamente para evaluar la actividad antioxidante de los compuestos fenólicos porque el radical DPPH es un radical libre estable que pierde su intensidad de absorbancia cuando es reducido por antioxidantes. El ensayo ABTS mide la capacidad de un antioxidante para eliminar los radicales que se generan por la reacción de un agente oxidante fuerte con ABTS. Se evalúa la reducción de la absorbancia del radical ABTS por antioxidantes con propiedades donantes de hidrógeno. Los extractos acuosos exhibieron actividades de eliminación de una manera dependiente de la dosis. A las concentraciones analizadas (15,63 μg / mL, 31,25 μg / mL, 62,5 μg / mL, 125 μg / mL y 250 μg / mL), el extracto de P. vulgaris (IC ₅₀ 50,35 ± 1,22 µg / ml contra el radical DPPH; IC ₅₀ 38,6 ± 0,44 μg / mL contra el radical ABTS) exhibieron las actividades más potentes contra los radicales DPPH y ABTS seguidos por el extracto de A. capillaris (IC ₅₀ 156,72 ± 0,97 µg / ml contra el radical DPPH; IC ₅₀ 147,28 ± 2,95 μg / mL contra el radical ABTS) y luego el extracto de P. oleracea (IC ₅₀ 247,33 ± 1,57 μg / mL contra el radical DPPH; IC ₅₀ 305,54 ± 4,86 ​​μg / mL contra radical ABTS). En particular, P. vulgaris mostró una actividad captadora de radicales libres DPPH más potente que BHT (IC ₅₀ 71,37 ± 0,84 μg / mL), que se utilizó como estándar (Tabla 1 y Fig.1a, b). El extracto de P. vulgaris demostraron las mayores actividades de eliminación de radicales de DPPH y ABTS entre los tres extractos. Este resultado implicaba que posiblemente existirían más compuestos antioxidantes en P. vulgaris que en A. capillaris y P. oleracea.

Actividades de captación de radicales DPPH y ABTS y poder reductor de los extractos acuosos de A. capillaris , P. oleracea y P. vulgaris . un Actividades de captación de radicales DPPH. b Actividades de captación de radicales ABTS. c Poder reductor de los extractos. Los datos se presentan como la media ± SEM. Los asteriscos indican la importancia de la diferencia frente al estándar (BHT o vitamina C):* p <0.05, ** p <0.01, *** p <0,001. Los resultados son representativos de tres experimentos independientes

También examinamos las actividades antioxidantes de los extractos vía un ensayo de poder reductor. En presencia de antioxidantes, ferricianuro de potasio (Fe ³⁺ ) se convierte en ferrocianuro de potasio (Fe ²⁺ ), que reacciona con el cloruro férrico para formar un complejo férrico-ferroso. El complejo férrico-ferroso tiene una absorbancia máxima a 700 nm, que se puede utilizar para evaluar el poder reductor de un antioxidante. En el informe actual, el poder reductor se expresa como la concentración (μg / mL) de cada extracto que dio una absorbancia de 0,7 a 700 nm. Como se muestra en la Fig. 1c, P. vulgaris (162,98 μg / mL) ejerció un poder reductor notablemente mayor que A. capillaris (235,38 μg / ml) y P. oleracea (396,16 μg / mL). Como se mencionó anteriormente, los resultados del poder reductor también indicaron que posiblemente existirían más compuestos antioxidantes en P. vulgaris que en A. capillaris y P. oleracea.

También se investigó el contenido fenólico total de cada extracto. Es bien sabido que los compuestos fenólicos son antioxidantes potenciales y poseen la capacidad de eliminar radicales debido a sus grupos hidroxilo. Por tanto, la actividad antioxidante de un extracto vegetal puede correlacionarse bien con su contenido fenólico. Se construyó una curva de calibración estándar usando ácido gálico, y esta curva mostró una relación lineal ( y =6.0617 x + 0,1293, r ² =0,9983). Utilizando la curva estándar, se calculó el contenido fenólico total y se expresa como miligramos de equivalente de ácido gálico (GAE) por gramo de extracto. El contenido fenólico total de los extractos fue de 90,53 ± 6,81 mg GAE / g para P. vulgaris , 39,88 ± 4,55 mg GAE / g para A. capillaris y 18,32 ± 2,76 mg GAE / g para P. oleracea . La cantidad de contenido fenólico total fue la más alta en P. vulgaris entre los tres extractos.

Hubo una correlación positiva entre el contenido fenólico total y la capacidad de los extractos para eliminar radicales o su poder reductor. Tomados en conjunto, los extractos acuosos de A. capillaris , P. oleracea y P. vulgaris exhibió actividades antioxidantes significativas. En particular, el extracto de P. vulgaris mostró la mayor actividad de eliminación de radicales contra los radicales DPPH y ABTS, el poder reductor más fuerte y el contenido fenólico total más alto, lo que implica que el extracto de P. vulgaris ejercería la actividad más fuerte como agente reductor para la biofabricación de AuNPs. Estos interesantes resultados de la biofabricación de AuNP utilizando los tres extractos se discutirán en la siguiente sección.

Biofabricación de AC-AuNP, PO-AuNP y PV-AuNP

Hemos propuesto que la actividad antioxidante del extracto afecta fuertemente el proceso de biofabricación de AuNPs. Dado que la actividad antioxidante es una fuerza impulsora importante en la reducción de las sales de Au a AuNP, P. vulgaris , que tiene la mayor actividad antioxidante, es capaz de ser el agente reductor más eficaz. El proceso de biofabricación fue seguido por espectrofotometría UV-visible, ya que los AuNP poseen un SPR distintivo en el rango de longitud de onda del infrarrojo cercano visible. La biofabricación de AuNP se realizó mezclando sales de Au con cada solución de extracto. Cada extracto contenía diversos fitoquímicos que son muy eficientes para la reducción de las sales de Au a AuNP.

La banda de SPR distinta de AuNP dio como resultado cambios en el color de la solución inicialmente de color amarillo pálido a azul oscuro para los PO-AuNP, marrón fluorescente para los AC-AuNP y rojo vino para los PV-AuNP (Fig.2) . Los espectros de UV-visible se registraron después de la incubación a 37 ° C en un horno seco durante 5 h para observar la banda de SPR distinta de cada conjunto de AuNP (Fig. 3). La absorbancia máxima se observó a 530 nm para las PV-AuNP y a 555 nm para las AC-AuNP. En el caso de los PO-AuNP, se observó una amplia banda de SPR de 500 a 700 nm. Los tres extractos generaron AuNP con una banda SPR característica en espectros UV-visible. Cada cambio de color junto con la banda de SPR distinta respaldaron claramente la biofabricación exitosa de AuNP con cada extracto. Propusimos que los tres factores relacionados con las actividades antioxidantes (actividad captadora de radicales libres, contenido fenólico total y poder reductor) afectan la biofabricación de AuNP. El extracto de P. vulgaris obtuvo el puntaje más alto para los tres factores, seguido de A. capillaris y por último por P. oleracea . Curiosamente, se demostró que los PO-AuNP se agregan después del almacenamiento a temperatura ambiente (25 ° C) durante 30 min. Este resultado sugirió que los PO-AuNP eran los más inestables, ya que la actividad antioxidante, la cantidad de compuestos fenólicos totales y el poder reductor de P. oleracea fueron los más bajos entre estos tres extractos. Por el contrario, los PV-AuNP mostraron la mayor absorbancia y una solución transparente de color rojo vino. La absorbancia de los AC-AuNP estaba entre la de los PO-AuNP y los de los PV-AuNP. Por lo tanto, en base a estas observaciones, se determinó que una mayor actividad de eliminación de radicales libres, contenido fenólico total y poder reductor de P. vulgaris El extracto dio como resultado la síntesis de AuNP más estables en comparación con las AuNP producidas por los extractos de A. capillaris y P. oleracea . En conjunto, las bandas máximas de SPR mostraron cambios bathocrómicos e hipocrómicos con una actividad antioxidante decreciente del extracto. Además, la forma de la banda SPR tendió a ensancharse con la disminución de la actividad antioxidante. En consecuencia, los PV-AuNP se caracterizaron además mediante mediciones de HR-TEM, HR-XRD, tamaño hidrodinámico y potencial zeta. Para determinar el rendimiento de la reacción, se realizó el análisis ICP-OES. La actividad antioxidante y la citotoxicidad en presencia / ausencia de FBS se evaluaron más a fondo contra las células cancerosas.

Fotografías digitales de PO-AuNP, AC-AuNP y PV-AuNP

Espectros UV-visible de PO-AuNP (línea negra), AC-AuNP (línea roja) y PV-AuNP (línea azul)

Imágenes HR-TEM de los PV-AuNP

Las técnicas microscópicas son las herramientas más efectivas para visualizar nanopartículas. Junto con HR-TEM, la microscopía electrónica de barrido y la microscopía de fuerza atómica se utilizan comúnmente para determinar el tamaño, la morfología, la topografía y las estructuras bidimensionales / tridimensionales. El tamaño y la morfología de las PV-AuNP se investigaron con HR-TEM. Como se muestra en la Fig. 4, se observaron varias formas, incluidas esferas, triángulos, varillas, rombos y hexágonos (Fig. 4a ~ e). La observación de estructuras reticulares en una barra (Fig. 4f, g) y un triángulo (Fig. 4h) demostró claramente que los PV-AuNP eran de naturaleza cristalina. Este resultado fue fuertemente respaldado por los resultados posteriores del análisis HR-XRD. El tamaño de cada forma de partícula se midió a partir de las imágenes HR-TEM, y los histogramas de tamaño resultantes se ilustran en la Fig. 5. Todos los histogramas mostraron una distribución gaussiana. Se seleccionaron al azar nanopartículas discretas en las imágenes para obtener un tamaño promedio de cada forma. Se determinó que el diámetro de las esferas era 23,8 ± 1,3 nm a partir de 250 nanopartículas (Fig. 5a). Curiosamente, se produjeron triángulos equiláteros; así, medimos las alturas de 64 nanopartículas (25,7 ± 2,2 nm, Fig. 5b). Se eligieron al azar veintisiete nanopartículas en forma de varilla para determinar la longitud media (28,4 ± 0,4 nm, Fig. 5c). Se determinó que la relación de aspecto promedio, definida como la longitud dividida por el ancho, de las varillas era 2,4. Para la forma de rombo, se seleccionaron al azar 38 rombos en las imágenes. Como se muestra en la Fig. 5d, e, las longitudes medias de las líneas diagonales largas y cortas se midieron en 22,0 ± 0,6 nm y 15,4 ± 0,3 nm, respectivamente. Los PV-AuNP de forma diversa poseían el tamaño de menos de 30 nm, y los tamaños se compararon con el tamaño hidrodinámico en la siguiente sección.

Imágenes HR-TEM de PV-AuNP. La barra de escala representa a 50 millas náuticas, b 50 millas náuticas, c 50 millas náuticas, d 50 millas náuticas, e 10 millas náuticas, f 2 nm, g 2 nm y h 2 millas náuticas

Histogramas de tamaño de PV-AuNP. un El diámetro de las esferas. b La altura de los triángulos equiláteros. c La longitud de las varillas. d La longitud (línea diagonal larga) de los rombos. e La longitud (línea diagonal corta) de los rombos

Tamaño hidrodinámico y potencial zeta de los PV-AuNPs

El tamaño hidrodinámico y el potencial zeta son características importantes en la investigación de nanopartículas para futuras aplicaciones. Generalmente, el tamaño medido a partir de imágenes HR-TEM es más pequeño que el tamaño hidrodinámico, ya que el tamaño hidrodinámico refleja las biomoléculas unidas a la superficie de las nanopartículas. Como se muestra en la Fig.6a, se determinó que el tamaño hidrodinámico era de 45 ± 2 nm con un índice de polidispersidad de 0,258, que era mayor que el tamaño de las esferas medidas a partir de las imágenes HR-TEM (23,8 ± 1,3 nm de 250 nanopartículas) . Este resultado sugirió claramente que los fitoquímicos en el extracto se unieron a la superficie de los PV-AuNP y los estabilizaron. Además, los PV-AuNP poseían un potencial zeta negativo de -13,99 mV (figura 6b). Estos resultados mostraron que los fitoquímicos con cargas negativas probablemente contribuyeron al potencial zeta negativo. This negative zeta potential gives repulsive forces in a colloidal solution of PV-AuNPs endowing its stability. Therefore, one of our future works will include the phytochemical screening on the extract of P. vulgaris to elucidate the exact compounds which contribute to the negative zeta potential.

Hydrodynamic size and zeta potential of PV-AuNPs. un Hydrodynamic size. b Zeta potential

HR-XRD Analysis of the PV-AuNPs

X-ray diffraction analysis is generally employed to obtain crystallographic information about metallic nanoparticles. The characteristic diffraction patterns in terms of the Bragg reflections obtained from HR-XRD showed that the PV-AuNPs possessed a crystalline structure. The diffraction peaks (2θ values) observed at 38.1°, 44.5°, 64.8°, and 77.4° corresponded to the (111), (200), (220), and (311) planes, respectively, of a face-centered cubic structure in the PV-AuNPs (Fig. 7). The Scherrer equation (D  = 0.89·λ/W·cosθ ) was used to determine the approximate size of the PV-AuNPs. We selected the most intense (111) peak for application in the equation. The definition of each term in the equation is as follows:D is the size of the PV-AuNPs determined from the (111) peak, θ is the Bragg diffraction angle of the (111) peak, λ is the X-ray wavelength that was utilized, and W is the full width at half maximum (FWHM) of the (111) peak, in radians. From the Scherrer equation, the approximate size of the PV-AuNPs was determined to be 16.7 nm. The size determined from the Scherrer equation was smaller than the sizes measured from both HR-TEM images and the hydrodynamic size. The hydrodynamic size was the largest, possibly due to the fact that phytochemicals in the extract bound to the surface of the PV-AuNPs.

HR-XRD analysis of PV-AuNPs

Reaction Yield of the PV-AuNPs

ICP-OES was used to estimate the reaction yield. First, the total concentration of Au was obtained by analyzing the PV-AuNP solution. Second, the PV-AuNPs were centrifuged and the supernatant was collected. The supernatant was analyzed to ascertain the concentration of unreacted Au in the reduction reaction. Then, the reaction yield was estimated as follows:reaction yield (%) = 100 − [Au concentration in the supernatant/Au concentration in the colloidal solution] × 100.

Based on ICP-OES analysis, the concentrations of Au in the colloidal PV-AuNP solution and the supernatant were determined to be 96.337 ppm and 0.679 ppm, respectively. Therefore, the reaction yield of the PV-AuNPs was determined to be 99.3%. From the ICP-OES results, we concluded that the reaction condition was optimal which produced a high reaction yield of PV-AuNPs.

Antioxidant Activity of the PV-AuNPs

The DPPH radical scavenging activity was examined to evaluate the antioxidant activity of the PV-AuNPs. As shown in Fig. 8, the DPPH radical scavenging activity of the PV-AuNPs was nearly constant at a concentration of less than 20.9 μg/mL (based on the Au concentration). However, as the concentration increased (41.9~334.8 μg/mL based on the Au concentration), the DPPH radical scavenging activity also increased, suggesting that the activity was dose-dependent. The IC₅₀ of the PV-AuNPs was observed to be 165.0 μg/mL, which was equivalent to the IC₅₀ of vitamin C (49.4 μM).

DPPH radical scavenging activity of PV-AuNPs. The concentration was expressed as Au concentration

Green-synthesized AuNPs or AgNPs have been known to possess antioxidant activity in terms of DPPH radical scavenging activity [20, 21]. Ginseng-berry-mediated AuNPs demonstrated antioxidant activity [20]. The absorption of phytochemicals in the ginseng berry extract on the surface of nanoparticles having a large surface area can be credited to the antioxidant activity of AuNPs [20]. Green-synthesized AuNPs using Angelica pubescens roots showed antioxidant activity with a dose-dependent manner [21]. Secondary metabolites in A. pubescens such as flavonoids, sesquiterpenes, and phenolic compounds are potential contributors for the free radical scavenging activity [21]. However, AgNPs demonstrated higher antioxidant activity than AuNPs in the two articles mentioned above.

Cytotoxicity of the PV-AuNPs

The cytotoxicity of the PV-AuNPs against three cancer cells from different tissue types (colon, pancreas, and breast) was evaluated to examine the tissue-specific cytotoxicity of the nanoparticles in the presence/absence of FBS (Fig. 9). When serum was present during the cell culture, various kinds of protein coronas formed. The protein corona was dependent on the characteristics of the nanoparticles, such as the size, shape, surface charge, and surface roughness [22]. The protein corona can either increase or decrease the cellular uptake and cytotoxicity of the nanoparticles [23]. However, there are controversial reports regarding whether the protein corona causes the cytotoxicity to increase or decrease. Thus, the cytotoxicity of the PV-AuNPs was evaluated in the presence and absence of FBS. In the absence of FBS, HT-29 showed the greatest cytotoxicity at the tested concentrations (29.9~478.3 μg/mL) among three cells (Fig. 9a), followed by MDA-MB-231 (Fig. 9b) and lastly by PANC-1 (Fig. 9c). However, in the presence of FBS, these cells demonstrated a different phenomenon. PANC-1 showed the highest cytotoxicity, followed by HT-29 cells. In the absence of FBS and with 478.3 μg/mL Au, both the PANC-1 and MDA-MB-231 cells did not show any significant cytotoxicity, while strong cytotoxicity was observed for the HT-29 cells (65.6% cytotoxicity). However, in the presence of FBS, cytotoxicity was observed for PANC-1 (37.5% cytotoxicity) at 478.3 μg/mL Au. In general, the PV-AuNPs surrounded by a protein corona strongly influenced the cytotoxicity against cancer cells, although the results were tissue-specific. The protein corona produced by FBS increased the cytotoxicity against PANC-1 when compared with the cytotoxicity in the absence of FBS; however, the cytotoxicity decreased in the presence of the protein corona for HT-29 when compared with the cytotoxicity without the protein corona.

In vitro cytotoxicity on cancer cells. un HT-29. b MDA-MB-231. c PANC-1

It has been reported that a variety of proteins bind to both positively and negatively charged AuNPs, while few proteins bind to AuNPs with a neutral charge [17, 24]. The negatively charged AuNPs showed a higher affinity and a slower release of fibrinogen protein than the positively charged AuNPs, suggesting the existence of specific binding sites for fibrinogen on the negatively charged AuNPs [17]. The PV-AuNPs possessed a negative zeta potential; thus, the binding of fibrinogen may affect the cytotoxicity against cancer cells. The investigation of the protein corona of nanoparticles is beneficial in nanomedicine research for future biomedical and clinical applications.

Conclusiones

The aqueous extracts of A. capillaris , P. oleracea , and P. vulgaris exhibited antioxidant activity which was evaluated by free radical scavenging activity, total phenolic content, and reducing power. P. vulgaris exerted the highest antioxidant activity, followed by A. capillaris and P. oleracea . The extract of P. vulgaris possessing the highest antioxidant activity was a very efficient green reducing agent for the biofabrication of AuNPs. The findings of our study demonstrate that the factors of the antioxidant activity, such as the free radical scavenging activity, reducing power, and total phenolic content, are closely correlated with the color of the colloidal solution and the shape of the SPR band of the resulting AuNPs. When the antioxidant activity was high, the resulting AuNPs showed a narrow SPR band with a strong absorbance. In contrast, a broad SPR band was observed for the PO-AuNPs, in which P. oleracea exhibited the lowest antioxidant activity among the three extracts. Furthermore, the PO-AuNPs aggregated easily after storage at ambient temperature. Consequently, the extract of P. vulgaris produced a wine-red colloidal solution of PV-AuNPs with various shapes with a maximum SPR of 530 nm. A face-centered cubic crystalline pattern of PV-AuNPs was confirmed by high-resolution X-ray diffraction analysis. The reaction yield was estimated by ICP-OES to be 99.3%. The hydrodynamic size (45 ± 2 nm) was larger than that measured from HR-TEM images suggesting that phytochemicals bound on the surface of the PV-AuNPs. Furthermore, phytochemicals with negative charges possibly attributed to a negative zeta potential of − 13.99 mV. The antioxidant activity of the PV-AuNPs was dependent on the Au concentration that was assessed based on the DPPH radical scavenging activity. Green-synthesized AuNPs using ginseng-berry and A. pubescens root extracts also showed DPPH radical scavenging activity [20, 21]. The PV-AuNPs showed cytotoxicity against HT-29, PANC-1, and MDA-MB-231 cells. Interestingly, the presence or absence of FBS dramatically affected the cytotoxicity against these cells. This phenomenon was possibly due to the protein corona that surrounded the surface of the nanoparticles.

Currently, AuNPs have diverse applications in nanomedicine as drug delivery vehicles or carriers of anticancer agents such as doxorubicin. P. vulgaris ethylacetate fraction showed cardioprotective effects with a concentration-dependent manner on isolated rat cardiomyocytes subjected to doxorubicin-induced oxidative stress [25]. PV-AuNPs can be applied as doxorubicin delivery vehicles with a cardioprotective ability. Therefore, our subsequent work will explore the anticancer activities of the PV-AuNPs loaded with doxorubicin for future biomedical and pharmaceutical applications. Diverse plant extracts have a potential to be effective reducing agents for biofabricating AuNPs. When the biofabrication reaction is conducted, it is essential to select a plant extract that possesses a high antioxidant activity in order to produce stable AuNPs. Additionally, P. vulgaris extract has a potential to be used as a reducing agent for the green synthesis of other novel metallic nanoparticles with valuable applications in the future.

Abreviaturas

ABTS:

2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)

AC-AuNPs:

Gold nanoparticles green synthesized by the extract of A. capillaris

AgNPs:

Nanopartículas de plata

AuNPs:

Nanopartículas de oro

BHT:

Butylated hydroxytoluene

DMEM:

Dulbecco’s modified Eagle’s medium

DPPH:

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl

FBS:

Suero fetal bovino

GAE:

Gallic acid equivalent

HR-TEM:

Microscopía electrónica de transmisión de alta resolución

HR-XRD:

High-resolution X-ray diffraction

HT-29:

Human colorectal adenocarcinoma cell

IC₅₀ :

Half maximal inhibitory concentration

ICP-OES:

Inductively coupled plasma optical emission spectroscopy

MDA-MB-231:

Human breast adenocarcinoma cell

PANC-1:

Human pancreas ductal adenocarcinoma cell

PO-AuNPs:

Gold nanoparticles green synthesized by the extract of P. oleracea

PV-AuNPs:

Gold nanoparticles green synthesized by the extract of P. vulgaris

SPR:

Surface plasmon resonance

WST assay:

Water-soluble tetrazolium assay

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