Biosensores plasmónicos mejorados de inmunoensayo sin etiquetas híbrido de nanopartículas de oro y óxido de grafeno

Antecedentes

Materiales basados ​​en moléculas de carbono como nanotubos de carbono [1, 2], bolas de carbono (buckminsterfullereno, C60) [3], grafeno bidimensional [4,5,6] y óxido de grafeno (GO) [7,8,9 , 10,11] se han utilizado ampliamente en biosensores. Entre ellos, la estructura de lámina bidimensional de grafeno es un material ideal para permitir películas delgadas con alta conductividad [12, 13] y excelentes características de permeabilidad óptica [14] y alta biocompatibilidad [15, 16]. Por estas razones, el material basado en grafeno se usa ampliamente en la tecnología de detección biomédica y electroquímica [17, 18]. Además, el tipo fotoeléctrico de tecnología de detección biológica se basa principalmente en GO [19,20,21]. Debido a que los grupos de óxido se pueden ajustar para absorber e irradiar una banda prohibida de luz [22, 23], se usa comúnmente en fluorescencia [24], resonancia de plasmón de superficie (SPR) [8,9,10,11, 19,20,21 ], y la tecnología de detección de resonancia de plasmón superficial localizado (LSPR) [25, 26]. En particular, GO tiene grupos funcionales químicos únicos (puentes epoxi, grupos hidroxilo, grupos carboxilo por pares (carboxilo y carbonilo)) que mejoran la afinidad y la unión covalente de biomoléculas.

La síntesis de material de grafeno combinado con nanopartículas (como Pt, Au, Ag, Pd y ZnO) se ha estudiado ampliamente para el desarrollo de nuevas tecnologías de nanocompuestos. En particular, el uso de nanopartículas de oro (AuNP) se ha utilizado como mecanismo para la transferencia de energía de la espectroscopia colorimétrica y de absorción. Además, durante la última década, la investigación sobre AuNP en luz visible ha destacado las características únicas de resonancia plasmónica. Dado que el ajuste del tamaño y la forma de las AuNP puede cambiar el desplazamiento de la longitud de onda de la absorción óptica, las AuNP se pueden utilizar para mejorar la absorción del plasma y la amplificación de la señal [27, 28]. Por lo tanto, los AuNP se han utilizado ampliamente en una amplia gama de aplicaciones, como los componentes optoelectrónicos, debido a sus propiedades ópticas y optoelectrónicas especiales para mejorar la extracción de luz [29, 30] y las reacciones de absorción de luz [31,32,33]. Además, los AuNP son biocompatibles y se han estudiado para su uso en detección química, imágenes biomédicas, terapia del cáncer [34, 35], portador de fármacos [32, 33], terapia fototérmica [36,37,38], aplicaciones de agente de contraste [39], radiosensibilizador [40] y biosensible [33, 41,42,43].

La funcionalidad de los AuNP se modificó agregando el reticulante para evitar la oxidación y actuar como portador de fitoquímicos o vectores; por tanto, esta combinación puede aumentar la biocompatibilidad y la bioactividad [44,45,46]. Los reticuladores como la cistamina (Cys) o el ácido 8-mercaptooctanoico (MOA) se activan mediante monocapas autoensambladas de tiol terminado en ácido carboxílico (SAM) sobre una superficie de Au modificada. MOA se une a la superficie de Au a través del engarce de tiol (extremo -SH) dando como resultado monocapas.

Además, también se ha informado ampliamente sobre la investigación sobre material metálico de plasmón. Por ejemplo, se ha demostrado que las nanopartículas plasmónicas de núcleo metálico [47], nanoestrellas [48] y nanopartículas de óxido de estaño dopadas con flúor [49] mejoran la banda prohibida de energía, lo que las hace deseables en células solares y aplicaciones de detección.

Además, se ha informado del uso de híbridos AuNP-GO basados ​​en síntesis química [50,51,52] y autoensamblaje electrostático [53] en aplicaciones de sensores, energía y catalíticas. En los últimos años, una cantidad cada vez mayor de investigación se ha centrado en el uso de híbridos AuNP-GO en biosensores. Se ha demostrado que estos híbridos son útiles en el desarrollo de tecnología de plataforma electroquímica [54,55,56,57,58,59] y de dispersión Raman mejorada en la superficie (SERS) [56, 59] para mejorar la aplicación en ensayos biológicos. Sin embargo, actualmente no hay informes relevantes sobre el uso de tecnología de biosensores de inmunoensayo rápido colorimétrico o a simple vista. Por ejemplo, se han utilizado biosensores de ADN electroquímicos basados ​​en híbridos de AuNP-GO para detectar biomarcadores de cáncer de mama para permitir un diagnóstico temprano. Con este biosensor, se obtuvo el límite de detección (LOD) de 0,16 nM con una sensibilidad de 378 nA / nM para el biomarcador ERBB2 [54]. Además, se ha utilizado un aptasensor electroquímico basado en nanocompuestos de óxido de grafeno de reducción punteada de AuNP (rGO-AuNP) para detectar selectivamente una concentración de bifenilos policlorados 3,3'4,4' (PCB77) entre 1 pg L ^{- 1} y 10 μg L ^{- 1} , con un LOD de 0,1 pg L ^{- 1} [55]. Además, los híbridos AuNP-GO se han utilizado como biosensor de base electroquímica para detectar peróxido de hidrógeno (H ₂ O ₂ ), con respuestas dinámicas alimentarias que oscilan entre 0,1 y 2,3 mM, y un LOD de 0,01 mM [57]. Otro buen ejemplo es la utilización de híbridos AuNP-GO [56, 59] y AuNP-grafeno [59] para biosensores basados ​​en SERS en diversas aplicaciones, así como bioimágenes medidas por SERS.

En este estudio, proponemos un método alternativo de síntesis química y autoensamblaje electrostático de híbridos AuNP-GO utilizando autoensamblaje capa por capa. También analizamos la sensibilidad de detección biológica de las hojas de AuNP y GO combinadas modificadas y su respuesta inmune proteica. Diseñamos dos tipos de inmunoensayos sin etiquetas de proteínas basados ​​en AuNP-GO y evaluamos su tiempo de respuesta y sensibilidad en las interacciones antígeno-anticuerpo. Las excelentes características de detección de los compuestos de grafeno-AuNP incluyen una sensibilidad ultra alta y la afinidad de las interacciones de biomoléculas que influyen en la detección de una amplia gama de biomoléculas con alta especificidad. Estas características implican que estos compuestos tienen un papel prometedor en aplicaciones futuras y el potencial de ser la ruta preferida de detección de enfermedades en aplicaciones de diagnóstico clínico.

Métodos / Experimental

Materiales

El grafito se adquirió en Graphene Supermarket (Graphene Laboratories Inc., Reading, MA, EE. UU.). Las láminas GO se obtuvieron a partir de escamas de grafito utilizando un método de Hummer modificado [60] seguido de trituración ultrasónica durante 5 h para un tamaño de escamas de 0,1 a 1 μm y un grosor de 1,1 nm. Dihidrocloruro de cistamina (Cys, 96%), tetracloroaurato de hidrógeno (III) trihidrato (HAuCl ₄ · 3H ₂ O), ACS, 99,99% (base de metales) y Au 49,5% min se compraron a Alfa Aesar Co. (EE. UU.). Citrato de sodio (HOC (COONa) (CH ₂ COONa) ₂ · 2H ₂ O) se compró a J.T. Baker Chemical Co. (Estados Unidos). Albúmina de suero bovino (BSA, SI-B4287, Sigma-Aldrich, EE. UU.), Anticuerpo anti-albúmina bovina producido en conejo (antiBSA, SI-B1520, Sigma-Aldrich, EE. UU.), N -hidroxisuccinimida (NHS) y 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) se adquirieron de Sigma-Aldrich Inc. (EE. UU.). Las inmunoglobulinas (Ig) de la estructura del anticuerpo antiBSA fueron producidas por linfocitos B y secretadas al plasma. Las formas monoméricas de las moléculas de Ig eran glicoproteínas con un peso molecular de aproximadamente 150 kDa. Cada monómero de Ig fue capaz de unirse a dos moléculas de antígeno. Todos los reactivos y disolventes se utilizaron sin purificación adicional.

Usamos tres condiciones de temperatura diferentes a 550, 400 y 100 ° C con tiempos de ebullición de 5, 5 y 120 minutos, respectivamente, para controlar la reducción de las nanopartículas. Estas diferentes temperaturas redujeron las nanopartículas para obtener el mismo espectro de absorción a 520 nm como se ve claramente en el archivo adicional 1:Figura S1.

Síntesis de AuNP

El método utilizado para obtener AuNPs se basó en el uso de citrato de sodio como agente reductor para reducir los iones tetracloroaurato taurina en agua. Un volumen de 15 mL de HAuCl ₄ · 3H ₂ Se calentó a reflujo una solución de O que contenía 1 mM de Au y se sometieron a reflujo 1,8 ml de citrato de sodio 38,8 mM (Na ₃ C ₆ H ₅ O ₇ ) a la solución en ebullición (550 ° C, 1100 rpm). La reducción de los iones de oro por los iones de citrato se completó después de 5 min, y la solución se hirvió durante 30 min (400 ° C, 900 rpm) y luego se dejó enfriar a temperatura ambiente [36, 61, 62]. Este método produce AuNP esféricos con un diámetro medio de aproximadamente 15 nm, y se puede utilizar una concentración reducida de 0,8 ml de citrato de sodio 38,8 mM para producir AuNP con un diámetro medio de aproximadamente 60 nm [63, 64]. La reacción química es la siguiente:HAuCl _{4 (aq)} + C ₆ H ₅ O ₇ Na _{3 (aq)} → Au _(s) + CO ₂ + HCOOH.

Preparación de GO basado en un antígeno objetivo

Diseñamos un método de inmunoensayo para preparar láminas de GO como se muestra en la Fig. 1. Usamos una solución de láminas de 200 μL a una concentración de 0.1 g / ly la activación de los grupos terminales carboxilo en la superficie de las láminas de GO para el enlace covalente La formación para inmovilizar cadenas de hidrocarburos se realizó usando una mezcla de 400 µM (EDC) / 100 µM (NHS) en una relación de volumen de 1:1. La proteína BSA se inmovilizó en los extremos de las hojas GO utilizando EDC / NHS para activar y promover reacciones de enlace covalente entre los grupos carboxilo en GO y –HN ₂ de BSA. La superficie de –COOH activado se sometió luego a una fuerte inmovilización covalente a través de una amina (NH ₂ ) -reacción de acoplamiento con 20 μl de proteína BSA a una concentración de 100 μg / ml. Finalmente, usamos una centrífuga para eliminar repetidamente la proteína BSA no inmovilizada en la superficie GO. El procedimiento de diana del antígeno GO-BSA se muestra en la Fig. 1.

Interacción GO-BSA. El grupo carboxilo de las hojas de GO se puede activar mediante la reacción de EDC / NHS y la preparación del GO basado en el antígeno diana para GO-BSA

Preparación de AuNP y AuNP-GO basado en una sonda de anticuerpos

Realizamos la funcionalización de la superficie utilizando Cys con AuNP de 15 nm en un volumen de 200 μL. Los AuNP se modificaron químicamente usando una monocapa de Cys autoensamblada de tiol derivatizado. Las AuNP se sumergieron en una solución de Cys (10 mM) durante 2 ha temperatura ambiente. Debido al fuerte enlace AuNP – S (enlace tiol), Cys puede conectarse fácilmente a AuNP y –NH ₂ grupos expuestos en la superficie de AuNPs – Cys – NH ₂ . Luego agregamos 20 μl de anticuerpos (antiBSA) de 100 μg / ml de proteína para inmovilizar la superficie de las AuNP, seguido de centrifugación repetida para eliminar las Cys no inmovilizadas en la superficie de las AuNP. Luego se usó agua desionizada para eliminar cualquier AuNP no inmovilizado (Cys es una estructura de aminotiol que no necesita ser activada por EDC / NHS). Las Cys unidas a las AuNP tenían amina (–NH ₂ ) grupos acoplados covalentemente con grupos carboxilo (–COOH) en la superficie de antiBSA. Finalmente, utilizamos centrifugación repetida para eliminar la proteína antiBSA no inmovilizada de la superficie de las AuNP. Se preparó una serie de concentraciones de proteína antiBSA mediante diluciones seriadas de 100 µg / ml a 1 pg / ml. La preparación de la sonda AuNP-antiBSA a diferentes concentraciones de anticuerpos se muestra en la Fig. 2a.

Interacciones AuNP-antiBSA y AuNP-GO-antiBSA. Preparación de la a AuNP y b AuNP-GO basado en sonda de anticuerpos

Usamos AuNPs preparados usando el método de hoja GO para modificar el nanocompuesto AuNP-GO. Los AuNP se prepararon usando el método de reducción con citrato de sodio, y el tamaño de los AuNP de 60 nm se modificó usando Cys (5 mM). Luego usamos EDC / NHS para activar los grupos –COOH en la superficie de las hojas GO. Las Cys adjuntas a las AuNP incluían –NH ₂ grupos acoplados covalentemente con grupos –COOH en la superficie de las hojas GO. Las AuNP en la superficie de las hojas GO se inmovilizaron usando un enlazador Cys para promover reacciones de enlace covalente entre las AuNP y GO. El acoplamiento covalente ofrece un método fácil y estable para unir la funcionalización de superficies en láminas GO. Las hojas de GO se enjuagaron minuciosamente con agua desionizada para eliminar el GO no adherido en la superficie del enlazador AuNP. El AuNP-Cys formó un nuevo compuesto de AuNP-GO, seguido de inmovilización con diferentes concentraciones de dilución de 100 μg / ml a 1 pg / ml de proteína sonda de anticuerpo (antiBSA) para formar AuNP-GO-antiBSA, como se muestra en la Fig. 2b.

Caracterización de AuNP y hojas GO

La dispersión y morfología de las láminas de AuNP-GO se caracterizaron utilizando un microscopio electrónico de transmisión de pistola de emisión de campo de 300 kV (FEG-TEM; Tecnai G2F30S-Twin, Philips-FEI, Amsterdam, Países Bajos) y un microscopio electrónico de transmisión de alta resolución ( HR-TEM) en un sistema FEI Tecnai G20 (Hillsboro, OR, EE. UU.). La dispersión y morfología de las láminas AuNP-GO y GO se caracterizaron utilizando un microscopio electrónico de barrido de emisión de campo analítico de resolución extrema JEOL JSM-7800F Prime (JEOL Inc., EE. UU.). El espectro de transmitancia ultravioleta visible (UV-vis) de un espectrofotómetro de doble haz se observó utilizando un espectrofotómetro UV-vis (U-2900, Hitachi High-Technologies Corporation, Tokio, Japón) con una longitud de onda de 200 a 1100 nm a temperatura ambiente. . Las mediciones Raman se realizaron utilizando un sistema Raman microscópico (MRI, Protrustech Co., Ltd., Taiwán). Se utilizó como detector un espectrómetro refrigerado por aire (AvaSpec-ULS2048L) con rejilla de 1800 líneas / mm y una rendija de 50 μm. Las mediciones del espectrómetro infrarrojo de transformada de Fourier (FTIR) se realizaron utilizando un espectrómetro Bruker Vertex 80v en modo de reflexión total atenuada (ATR) y un detector DTGS (64 escaneos) con una resolución de 2 cm ^{- 1} en una pastilla de KBr en un vacío a una presión de alrededor de 6 Pa. El Centro de Instrumentación de la Universidad Nacional Tsing Hua brindó apoyo para este trabajo. La espectroscopia de fotoelectrones de rayos X (XPS) se realizó utilizando las instalaciones del Centro Nacional de Investigación de Radiación de Sincrotrón, Hsinchu, Taiwán. Los experimentos de espectroscopia de fotoelectrones se realizaron utilizando una línea de luz de espectroscopia U5 09A2 para XPS. Se utilizaron fotones con energías fijas de 380 y 900 eV para C (1s) y Co (2p) a lo largo de los experimentos de espectroscopía de fotoelectrones a nivel del núcleo. Los experimentos se llevaron a cabo en modo de producción total de electrones en un monocromador de rejilla esférica de alta energía de 6 m. Los fotones incidieron en la superficie normal y se recogieron fotoelectrones en un ángulo de 58 ° con respecto a la superficie normal. Las energías de enlace en todos los espectros se refieren al Au 4f ^7/2 nivel básico a 84,0 eV. Después de restar el fondo lineal, los espectros se ajustaron con funciones gaussianas-lorentzianas mixtas basadas en un algoritmo no lineal de mínimos cuadrados [65].

Resultados y discusión

Análisis de estructura y morfología

El tamaño de los AuNP dependía de la naturaleza del agente reductor y de las condiciones de formación y almacenamiento. El análisis SEM indicó que las hojas GO y AuNP se unieron uniformemente en la superficie GO, con un tamaño medio de AuNP de 60 nm (Fig. 3). La Figura 3a muestra imágenes SEM de las hojas GO en la película de Au y que las hojas GO tenían menos de 1 μm. Comparando GO y AuNP-GO, se pudo observar un elemento de oro en el compuesto AuNP-GO. Esto indicó que los AuNP se habían adsorbido con éxito en la superficie arrugada de GO. Los híbridos de AuNP-GO sintetizados se caracterizaron usando TEM como se muestra en la Fig. 3b. La figura 3b, c muestra las condiciones de síntesis. La concentración de 10 ml de solución en hoja de GO fue de 0,1 g / ly 200 µl de solución de AuNP tenían una concentración de 2,2 nM. Las imágenes TEM en la Fig. 3a con una barra de escala de 100 nm y la Fig. 3b con una barra de escala de 0.5 μm muestran diferentes amplificaciones del tamaño y muestran claramente que los AuNPs estaban inmovilizados en la superficie de las hojas GO. Los AuNP tenían una forma esférica, lo que sugiere que la funcionalidad carboxílica en la superficie de las hojas de GO puede desempeñar un papel importante en la formación de enlaces covalentes químicos con los AuNP, como se muestra en la Fig. 2b.

Análisis de la morfología superficial del nanocompuesto. un Imágenes SEM de una hoja GO y b Imagen TEM del compuesto AuNP-GO. c La imagen TEM de la película ERGO AuNP-GO

Caracterizaciones de GO por espectroscopia XPS, Raman y FTIR

La Figura 4a muestra el análisis espectral C 1s XPS de alta resolución de las hojas GO. Los C1 de mayor intensidad a una energía de enlace de 284,6 eV correspondían a grupos funcionales carbonilo para C – C (sp2), y los picos a 285,6, 286,6, 288,2 y 289,4 eV correspondían a C – C (sp3) en anillos aromáticos , C – O en grupos hidroxilo y epoxi, C =O en grupos carbonilo y O – C =O en grupos carboxilo, respectivamente. Los espectros C 1s XPS de las hojas de GO sobre un sustrato de película de oro mostraron que los porcentajes atómicos relativos de C – C (sp2), C – C (sp3), C – O, C =O y O – C =O eran 77,44, 2,16, 18,14, 1,77 y 0,49%, respectivamente [66]. La Figura 4b muestra el análisis espectral Raman de las hojas GO en solución de NaCl con picos de características espectrales a 1614 cm ^{- 1} (Banda G), 1355 cm ^{- 1} (Banda D), 2714 cm ^{- 1} (Banda 2D), 2947 cm ^{- 1} (Banda G + D) y ~ 3240 cm ^{- 1} (Banda 2D ’) [38, 67]. La formación de las láminas de GO se analizó adicionalmente para dilucidar las propiedades de diversas especies oxigenadas usando espectros ATR-FTIR como se muestra en la Fig. 4c. Estos espectros ATR-FTIR también revelaron varios picos característicos de GO; C – O a 850 cm ^{- 1} debido a (C – O – C) vibraciones de epóxido, C – O a 1080 cm ^{- 1} debido a la vibración de estiramiento del alcoxi (C – O), C =C a 1500 ~ 1600 cm ^{- 1} debido a enlaces aromáticos C =C y C – O a 1260 cm ^{- 1} debido a las vibraciones asimétricas del epóxido (C – O – C). Los grupos carboxílicos en los bordes de las láminas GO mostraron vibraciones de estiramiento –COOH, con picos a 1652 y 1731 cm ^{- 1} correspondiente a C =O estiramiento vibraciones de grupos carbonilo. Los espectros también mostraron tres picos a 2900 cm ^{- 1} relacionado con vibraciones de estiramiento asimétricas y simétricas de –CH ₂ y un pico de deformación a 1462 cm ^{- 1} debido a los grupos de alquenos (C – H) ubicados en el plano de GO. Los espectros FTIR de GO mostraron una amplia gama de picos de banda ancha de absorción de C – OH y H ₂ O vibraciones a 3370 cm ^{- 1} debido a las vibraciones de estiramiento [67].

Análisis espectral de hojas GO. un Escaneo de alta resolución XPS en la región C1s, b Raman y c FTIR

Análisis de GO y AuNP con propiedades de interacción de proteínas

Los espectros UV-vis de GO y AuNP acuosos con dispersiones de interacción de proteínas se presentan en la Fig. 5. Los AuNP tenían altos coeficientes de extinción y un tamaño único dependiendo de las bandas de absorción del plasmón superficial (SP). Los AuNP modificados de dos dimensiones diferentes fueron 15 y 60 nm para 520 y 540 nm de espectros de absorción de SP [68, 69]. La Figura 5a muestra la solución de AuNP (520 nm) modificada con Cys a una concentración de 5 mM con la banda de extinción de AuNP-Cys [69]. Los espectros UV-vis de las dispersiones acuosas de GO arrojaron dos picos de absorción:el máximo a 230 nm correspondiente al pico de plasmón π-π * de enlaces C-C aromáticos en grupos aromáticos sp2 de diferente tamaño, y el hombro a 300 nm correspondiente a la n – π * pico de plasmón debido a la presencia de enlaces epóxido y carbonilo (C =O) (Fig. 5b) [9, 20]. Los espectros UV-vis de la solución GO-EDC / NHS y GO-EDC / NHS-BSA (Fig. 5b) demostraron que GO-EDC / NHS y GO-EDC / NHS-BSA mostraron un pico a aproximadamente 270 nm, que fue probablemente debido a las fuertes interacciones entre los grupos GO y amina [70, 71]. La Figura 5c muestra los espectros de absorción de los enlaces para diferentes concentraciones de antiBSA con AuNPs (60 nm). La Figura 1b muestra la solución de síntesis de la sonda AuNP-antiBSA (muestra B1). Las longitudes de onda tenían picos de absorción obvios a 540 y 755 nm, siendo la longitud de onda a 540 nm causada principalmente por los AuNP (60 nm), y el pico a 755 nm correspondía a un pico de absorción combinado de AuNP + Cys + antiBSA. Este resultado mostró que un aumento en la concentración de antiBSA indujo un aumento gradual en la absorbancia a 540 nm y un aumento continuo en la absorción de IR cercano a 755 nm. Las diferentes interacciones de unión antiBSA en la superficie de las AuNP causaron cambios en el índice de refracción de la superficie, que a su vez se transdujo en intensidad de absorbancia del LSPR. La banda LSPR se vio afectada por el tamaño de las partículas. Los AuNP mostraron fuertes bandas SPR en la región visible. Con aumentos en el índice de refracción de las partículas de tamaño mediano, el cambio en las posiciones de los picos de SPR podría ajustarse desde el visible al infrarrojo cercano. En los resultados experimentales de interacción de proteínas, mezclamos AuNP-antiBSA como se muestra en la Fig. 5d. La sensibilidad se determinó trazando la longitud de onda LSPR de la banda de 500 a 760 nm en función del índice de refracción medido. Luego usamos diluciones en diferentes concentraciones de proteína antiBSA de 1,45 nM a 145 fM y las mezclamos en un volumen de 200 μl. Los cambios en la absorción de 540 y 760 nm fueron causados ​​por las diferentes concentraciones de antiBSA y AuNP. A continuación, se realizaron mediciones espectrales 5 minutos después, que mostraron diferentes concentraciones de absorción de intensidad de luz, y se observó un pico de absorción de 60 nm para las AuNP a 540 y 755 nm. Estos resultados fueron consistentes con las curvas de calibración de absorción AuNP-antiBSA. Las curvas de calibración fueron ajustadas por y =2,43 + 0,25 × (coeficiente de correlación, R ² =0,91) para el pico de absorción de 540 nm y y =2,56 + 0,31 × (coeficiente de correlación, R ² =0,96) para el pico de absorción de 760 nm, donde x es la concentración de antiBSA y y es la absorbancia óptica.

Análisis de espectros de absorción UV-vis para AuNP con respuesta de interacción antiBSA. un Espectros de absorción de SP de AuNP, b BSA con destino a GO, c Sonda AuNP-anti-BSA y d Curvas de calibración para AuNP con respuesta de interacción antiBSA a diferentes concentraciones de dilución de proteína antiBSA de 1,45 nM ~ 145 fM

Análisis de AuNP-antiBSA y AuNP-GO-antiBSA basado en interacciones de inmunoensayo

Para comprender el mecanismo de detección inmunológica de los nanocompuestos GO y AuNP-GO, se realizó un análisis espectral de reacciones de unión como se muestra en la Fig. 6. La Figura 6a muestra los espectros de absorción UV-vis de los nanocompuestos AuNP-GO y GO-BSA. Para la solución de hoja GO (0,1 g / l), hubo un pico a aproximadamente 230 nm [70] y un hombro a aproximadamente 300 nm, y los conjugados GO-BSA mostraron un pico de absorción a aproximadamente 270 nm y un pico a aproximadamente 230 nm [9, 20, 70] . En la combinación de nanocompuestos de AuNP-GO, se observaron tres picos de absorción a 230, 300 y 540 nm, respectivamente. El apilamiento π – π o las interacciones de enlace covalente entre AuNP y la superficie de la hoja de GO fueron la principal fuerza impulsora que anclaba los AuNP en los materiales de GO altamente biocompatibles. Se hizo que las hojas de GO se congregaran en los AuNP, lo que resultó en una fuerte banda de absorción de 200 a 300 nm. Por lo tanto, la absorción de las hojas de GO fue mucho mayor que la absorción de AuNP en la banda de luz visible. La Figura 6b muestra que los espectros UV-vis del pico de absorción de AuNP estaban a 540 nm [50, 68, 69]. Los picos de absorción estaban a 540 y 660 nm para los conjugados AuNP + Cys; 230, 300, 540 y 660 nm para conjugados AuNP + Cys + GO; y 230, 270, 540 y 660 nm para conjugados AuNP + Cys + GO + antiBSA. Las hojas GO tenían dos picos de absorción a 230 nm (pico de plasmón π – π *) y 300 nm (pico de plasmón n – π *). Se observó un cambio en la longitud de onda de absorción, y se consideró que este cambio de absorbancia indicaba la confirmación de la absorción de antiBSA (0 fM ~ 1,45 nM) sobre la superficie AuNP + Cys + GO. La Figura 6c muestra la síntesis de la solución de la sonda AuNP + Cys + GO + antiBSA (muestra B2) como en la Figura 2b. El aumento de la concentración de antiBSA fue relativamente alto a 540 nm. La Figura 6c muestra diferentes concentraciones de absorción de intensidad de luz y se observó un pico de absorción de 60 nm para las AuNP a 540 nm. El aumento de la concentración de antiBSA fue relativamente alto a 540 nm. Este resultado mostró que AuNP-GO podría mejorar las características de absorción del plasmón a 540 nm cuando se aumentó la concentración de antiBSA. Además, en el experimento de inmunoensayo, mezclamos la diana de GO-BSA (1,52 µM) (muestra A) y la sonda de AuNP + Cys + GO + antiBSA como se muestra en la Fig. 6d. Además de las características de interacción hidrófoba y π – π de las hojas GO, los enlaces covalentes entre las proteínas y los grupos carboxilo en las hojas GO también apoyaron la adhesión a la superficie. Este resultado probablemente se debió a la estructura híbrida AuNP + GO-antiBSA para formar una respuesta inmune estable con otras proteínas en GO-BSA. Las longitudes de onda tenían un pico de absorción obvio a 260 nm. Además de las características de interacción hidrófobas y π – π (π – π * pico de plasmón) de las hojas GO, los enlaces covalentes entre proteínas y grupos carboxilo en las hojas GO también apoyaron la adhesión a la superficie. Antes y después de la unión de BSA y antiBSA, los valores máximos de plasmón π – π * de GO (230 y 270 nm) se modificaron significativamente, lo que demostró que BSA y antiBSA estaban vinculados positivamente.

Análisis de espectros de absorción UV-vis para respuesta inmune. un GO unida a AuNP y BSA unida a GO, b AuNP y anti-BSA unido a GO, c Sonda AuNP-GO-antiBSA y d Sonda AuNP-GO-antiBSA y objetivo GO-BSA para la respuesta inmune

La Figura 7 muestra que estos resultados concuerdan bien con las curvas de calibración. El análisis detallado de los resultados experimentales anteriores (Fig.6c, d) mostró que las respuestas de detección a las correspondientes inexactitudes promedio de absorbancia fueron 1.3487, 1.1776, 1.0698, 0.8755 y 0.8588 (Fig.7a) y 0.9226, 0.8535, 0.7649, 0.7243 y 0,695 (Fig. 7b), correspondientes a concentraciones de proteína 1,45 nM, 145 pM, 14,5 pM, 1,45 pM y 145 fM, respectivamente. La Figura 7a muestra que la regresión lineal de las curvas de calibración fue f (x) =0,918 + 0,124 × (coeficiente de correlación, R ² =0,94) para la sonda AuNP-GO con interacciones antiBSA, donde x es la concentración de proteína y y es la absorbancia óptica. Además, la Fig. 7b muestra que la ecuación de regresión lineal de la curva ajustada fue f (x) =0,791 + 0,057 × (coeficiente de correlación, R ² =0,954) para GO y AuNP-GO según el inmunoensayo.

Comparación de las curvas de calibración de las respuestas de detección obtenidas a diferentes concentraciones de proteínas. un Curvas de calibración para sonda AuNP-GO con interacciones antiBSA. b Curvas de calibración para GO y GO-AuNP basadas en un inmunoensayo

Durante el experimento de cuantificación, agregamos una concentración fija de 10 ng / ml de proteína de gonadotropina coriónica humana (hCG) para actuar como una interferencia. Los resultados mostraron que la proteína hCG de interferencia fija en las curvas de calibración del inmunoensayo fue ajustada por f (x) =0,843 + 0,113 × (coeficiente de correlación, R ² =0,89) para la sonda AuNP-GO con interacciones antiBSA (Fig. 7a) y f (x) =0,722 + 0,051 × (coeficiente de correlación, R ² =0,73) para GO y AuNP-GO según el inmunoensayo (Fig. 7b).

Además, nuestros resultados experimentales mostraron que la estrategia de detección permitió la regeneración de la superficie sin pérdida de especificidad (cuatro regeneraciones) y que también podría usarse para detectar proteína antiBSA con respuestas dinámicas que van desde 1,45 nM, 145 pM, 14,5 pM, 1,45 pM , 145 fM y 0 fM. The results demonstrated that with a decreased concentration of antiBSA (from 1.45 nM to 145 fM) and even without the presence of antiBSA (0 fM), the spectral absorption intensity did not change the minimum level of quantitation. The hCG protein interfered with the antibody recognition in the immunoassay to a limited extent, possibly due to non-specific adsorption. This implies a very low cross-reactivity of the hCG protein and non-specific interactions at a low adsorption. In the practical quantitative analysis with immunoassays, a LOD of 145 fM for antiBSA was achieved in both buffer and interference protein samples.

Conclusiones

We successfully demonstrated a GO-bound AuNP biocompatible nanocomposite in a biosensing mechanism in a rapid and label-free immunoassay for biomolecule interactions. The results showed that the AuNP-GO nanocomposite was biocompatible and exhibited LSPR extinction to biomolecules, which could promote the absorption spectra characteristic peaks, accelerate the reaction of molecules, and enhance the stability of chemical covalent bonds during immobilization. For the detection of antiBSA protein, the limit of detection of the GO and AuNP-GO based on the immunoassay was as low as 145 fM. Among the AuNP-GO biosensors, GO immobilized in the AuNP-GO nanocomposite showed the highest bioaffinity, with good sensitivity, low detection limit, and fast response toward the protein immunoassay. The results of our experiments showed that a fixed concentration 10 ng/ml of hCG protein as an interferer did not affect the test response. Given the growing trend of applying biosensors in POCT, LSPR for AuNP-GO nanocomposite technology is a highly promising and versatile tool for use in immunoassays. Combining the properties of AuNPs and GO sheets to develop new nanocomposites for the synthesis of smart materials shows promise for the development of user-friendly diagnosis applications. In the future, AuNP-GO nanocomposites may be used in innovative immunoassays, rapid detection reagents, and miniaturization, which may in turn make LSPR technology an irreplaceable tool for routine clinical analysis and POCT diagnostics.

Abreviaturas

Ag:

Silver

AntiBSA:

Bovine serum albumin antibody

Au:

Gold

AuNP:

Gold nanoparticle

BSA:

Bovine serum albumin

Cys:

Cystamine

EDC:

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide

FEG-TEM:

Field-emission gun transmission electron microscope

FTIR:

Fourier-transform infrared spectrometer

GO:

Graphene oxide sheet

HR-TEM:

Microscopio electrónico de transmisión de alta resolución

LOD:

Limit of detection

LSPR:

Localized surface plasmon resonance

MOA:

8-Mercaptooctanoic acid

NHS:

N -Hydroxysuccinimide

Pd:

Palladium

POCT:

Point-of-care testing

Pt:

Platinum

RGO:

Reduction graphene oxide

SAMs:

Self-assembled monolayers

SERS:

Surface-enhanced Raman scattering

UV-vis:

Ultraviolet-visible

XPS:

Espectroscopia de fotoelectrones de rayos X

ZnO:

Zinc oxide

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