Inmunoensayo Ultra-Sensible, Libre de Etiquetas, Usando Biosensores Plasmónicos Híbridos de Nanopartículas de Oro-Óxido de Grafeno

Antecedentes

Los nanomateriales basados en carbono —grafeno, nanotubos de carbono, óxido de grafeno (GO)— se han vuelto pilares en biosensores debido a sus excepcionales propiedades eléctricas, ópticas y química superficial. La estructura bidimensional del GO y grupos funcionales ricos en oxígeno (epóxidos, hidroxilos, carboxilos) confieren alta afinidad proteica y permiten acoplamiento covalente, haciéndolo sustrato atractivo para sensores electroquímicos, fluorescencia, SPR y LSPR. Las nanopartículas de oro (AuNPs) aportan absorción plasmónica sintonizable, biocompatibilidad y química superficial fácil, permitiéndoles actuar como amplificadores de señal u etiquetas ópticas. Cuando AuNPs se decoran en GO, el híbrido hereda la unión rápida del GO y el LSPR intenso de AuNPs, conduciendo a sensibilidad mejorada inmunoensayos, detección ADN y ensayos enzimáticos. A pesar de extensos estudios electroquímicos y SERS, no se han reportado inmunoensayos colorimétricos o libres de etiquetas rápidos basados en híbridos AuNP-GO desnudos a simple vista. Este estudio llena ese vacío desarrollando un inmunoensayo basado en quimisorción, realzado por LSPR, que opera en buffer acuoso y tolera interferentes comunes.

Métodos/Experimental

Materiales

Grafito (Graphene Supermarket), GO (método Hummer modificado, hojuelas 0,1–1 µm, 1,1 nm espesor), cistamina dihidrocloruro (Cys, 96 %), HAuCl₄·3H₂O (99,99 %), citrato sódico, BSA, anti-BSA (IgG conejo), NHS y EDC se obtuvieron de Sigma-Aldrich o Alfa Aesar. Todos los reactivos se usaron sin purificación adicional.

Síntesis de AuNPs

AuNPs se sintetizaron por reducción con citrato: 15 mL de 1 mM HAuCl₄ se reflujo a 550 °C, 1100 rpm; 1,8 mL de 38,8 mM citrato sódico se añadió. Tras 5 min, la mezcla hirvió a 400 °C, 900 rpm por 30 min y enfrió a temperatura ambiente. Este procedimiento produce AuNPs esféricas ~15 nm; usando 0,8 mL citrato produce ~60 nm. La reacción: HAuCl₄ + C₆H₅O₇Na₃ → Au(s) + CO₂ + HCOOH.

Preparación de Antígeno Objetivo GO-BSA

Hojuelas GO (0,1 g L⁻¹) se activaron con EDC (400 µM) y NHS (100 µM) (proporción volumen 1:1). BSA (20 µL, 100 µg mL⁻¹) se acopló covalentemente vía formación enlace amida y purificó por centrifugación repetida. Figura 1 ilustra flujo trabajo conjugación GO-BSA.

Interacción GO-BSA. El grupo carboxilo de hojuelas GO puede activarse usando reacción EDC/NHS y preparación del GO basado en antígeno objetivo para GO-BSA

Preparación de Sonda AuNP-antiBSA

AuNPs se funcionalizaron con Cys (10 mM, 2 h, RT) para introducir grupos –NH₂ expuestos. Anti-BSA (20 µL, 100 µg mL⁻¹) se acopló vía enlaces amida sin activación adicional, seguido de centrifugación para remover anticuerpo no unido. Diluciones seriadas de 100 µg mL⁻¹ a 1 pg mL⁻¹ produjeron rango de sondas AuNP-antiBSA (Fig. 2a). Compuestos AuNP-GO-antiBSA se ensamblaron por activación EDC/NHS de carboxilos GO y unión covalente de AuNPs modificados con Cys, luego acoplamiento anticuerpo (Fig. 2b).

Interacciones AuNP-antiBSA y AuNP-GO-antiBSA. Preparación de sonda basada en anticuerpo a AuNPs y b AuNP-GO

Técnicas de Caracterización

Caracterización estructural y óptica emplearon MET-CE, HR-MET, MEB (JEOL JSM-7800F), espectroscopía UV-vis (U-2900, Hitachi), microscopía Raman (MRI, Protrustech), FTIR (Bruker Vertex 80v ATR) y XPS (Centro Nacional Radiación Sincrotrón). Tamaño AuNP, distribución y química superficial confirmados en todas las muestras.

Resultados y Discusión

Morfología y Composición

MEB y MET revelaron AuNPs uniformes de 60 nm distribuidas uniformemente en hojuelas GO arrugadas (Fig. 3). XPS confirmó presencia de C-C (sp²), C-C (sp³), C-O, C=O y O-C=O grupos funcionales en GO, mientras picos Au 4f verificaron integración AuNP.

Análisis morfología superficie nanocompuesto. a Imágenes MEB hoja GO y b Imagen MET compuesto AuNP-GO. c Imagen MET película ERGO AuNP-GO

Caracterización Espectroscópica de GO

Escaneos alta resolución C 1s XPS, Raman y ATR-FTIR confirman grupos funcionales oxigenados característicos GO (C sp², epóxidos, hidroxilos, carbonilos, carboxilos). Picos Raman a 1355 cm⁻¹ (D), 1614 cm⁻¹ (G) y 2714 cm⁻¹ (2D) corroboran estructura en capas (Fig. 4).

Análisis espectral hojuelas GO. a Escaneo alta resolución XPS región C1s, b Raman, y c FTIR

Interacción Proteica y Respuesta LSPR

Espectros UV-vis de AuNPs (15 nm y 60 nm) muestran picos LSPR a 520 nm y 540 nm, respectivamente. Solo GO muestra absorción π-π* a 230 nm y n-π* a 300 nm. Tras funcionalización, conjugados AuNP-Cys-antiBSA exhiben picos duales a 540 nm (AuNP) y 755 nm (AuNP-Cys-antiBSA) con desplazamiento dependiente de concentración (Fig. 5). Curvas calibración (y = 2,43 + 0,25 x, R² = 0,91 para 540 nm; y = 2,56 + 0,31 x, R² = 0,96 para 760 nm) confirman linealidad en 1,45 nM a 145 fM anti-BSA.

Análisis espectros absorción UV-vis para respuesta interacción AuNP con antiBSA. a Espectros absorción SP AuNPs, b GO-BSA unido, c Sonda AuNP-anti-BSA, y d Curvas calibración AuNP con respuesta interacción antiBSA a diferentes diluciones concentración proteína antiBSA 1,45 nM ~ 145 fM

Híbridos AuNP-GO-antiBSA amplifican further la señal LSPR. Adición de objetivos GO-BSA causa desplazamiento lineal pico 540 nm con concentración anti-BSA (1,45 nM–145 fM), produciendo LOD 145 fM (Fig. 6). Calibración para sonda AuNP-GO (f(x) = 0,918 + 0,124 x, R² = 0,94) y para GO solo (f(x) = 0,791 + 0,057 x, R² = 0,954) demuestran sensibilidad superior del sistema híbrido.

Análisis espectros absorción UV-vis para respuesta inmune. a AuNP-GO unido y GO-BSA unido, b AuNPs y GO-anti-BSA unido, c Sonda AuNP-GO-antiBSA, y d Sonda AuNP-GO-antiBSA y objetivo GO-BSA para respuesta inmune

Estudios interferencia con 10 ng ml⁻¹ hCG mostraron reactividad cruzada mínima (R² = 0,89 AuNP-GO; 0,73 GO solo), confirmando robustez ensayo. El sensor retuvo rendimiento tras cuatro ciclos regeneración, indicando alta estabilidad superficial.

Conclusiones

Hemos diseñado un híbrido AuNP-GO biocompatible que aprovecha LSPR para lograr detección libre etiquetas de anti-BSA a 145 fM. El nanocompuesto exhibe alta bioafinidad, respuesta rápida y resiliencia a interferentes comunes, siendo plataforma convincente para inmunoensayos punto atención. Trabajos futuros explorarán detección multiplexada, integración en dispositivos microfluídicos y adaptación a biomarcadores clínicamente relevantes.

Abreviaturas

Ag:

Plata

AntiBSA:

Anticuerpo albúmina sérica bovina

Au:

Oro

AuNP:

Nanopartícula de oro

BSA:

Albúmina sérica bovina

Cys:

Cistamina

EDC:

1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida

FEG-MET:

Microscopio electrónico transmisión cañón emisión campo

FTIR:

Espectrómetro infrarrojo transformada Fourier

GO:

Hoja óxido grafeno

HR-MET:

Microscopio electrónico transmisión alta resolución

LOD:

Límite detección

LSPR:

Resonancia plasmón superficie localizada

MOA:

Ácido 8-mercaptooctanoico

NHS:

N-Hidroxisuccinimida

Pd:

Paladio

POCT:

Pruebas punto atención

Pt:

Platino

RGO:

Óxido grafeno reducido

SAMs:

Monocapas autoensambladas

SERS:

Dispersión Raman realzada superficie

UV-vis:

Ultravioleta-visible

XPS:

Espectroscopía fotoelectrónica rayos X

ZnO:

Óxido zinc