Biocompatibilidad mejorada en matrices anódicas TaO x nanotubos

Métodos

Preparación de TaO _x Nanotubos

Se adquirieron láminas de Ta de ECHO Chemical (espesor de 0,127 mm, pureza del 99,7%, CAS No. 7440-25-7). Antes del proceso de anodización, las láminas de Ta se limpiaron ultrasónicamente en acetona, isopropanol, etanol y agua. Todos los experimentos de anodización se realizaron a 20 ° C en una solución de ácido sulfúrico que contenía 4,9% en peso de HF, que se preparó a partir de productos químicos de grado reactivo y agua desionizada. Se empleó una celda electroquímica de dos electrodos con Ta como ánodo y Pt como contraelectrodo. Los voltajes se ajustaron de 10 a 40 V para dar como resultado TaO _x diámetros de nanotubos que van desde 20 hasta 90 nm. Irradiación de luz ultravioleta de baja intensidad (aproximadamente 2 mW / cm ² ) con bombillas fluorescentes de luz negra en TaO _x Se tomaron muestras de nanotubos durante 8 h antes de las pruebas biocompatibles.

Caracterización del material

La morfología de la superficie, el diámetro interior y exterior, el grosor de la pared y la longitud de TaO _x Los nanotubos se caracterizaron mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). Se empleó difracción de rayos X (XRD) y microscopía electrónica de transmisión (TEM) equipada con un espectrómetro de dispersión de energía (EDS) para examinar la estructura cristalina de la TaO _x matrices de nanotubos. Se llevaron a cabo mediciones del ángulo de contacto para evaluar la humectabilidad de la superficie del TaO _x muestras de nanotubos por el método de extensión utilizando un microscopio horizontal con ocular transportador. Se utilizaron agua y medio de cultivo como líquidos de prueba para las mediciones.

Cultivo de células de fibroblastos humanos

Se sembraron fibroblastos humanos MRC-5 (BRCC, Bioresource Collection and Research Center, Hsinchu, Taiwán, BCRC No. 60023) en una placa de cultivo de tejidos de 10 cm y se cultivaron con medio esencial mínimo de Eagle (Gibco) que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS ), L-glutamina 2 mM, 1,5 g / L de bicarbonato de sodio, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales y 1,0 mM de piruvato de sodio y en 5% de CO ₂ a 37 ° C. Luego, las células se sembraron en el autoclave TaO _x hojas colocadas en la parte inferior de la placa de cultivo de 12 pocillos (Falcon) para su estudio adicional.

Ensayo de adhesión celular

Las células se sembraron en cada TaO _x hoja con una densidad de 2,5 × 10 ³ células / cm ² y se incubó en 5% CO ₂ a 37 ° C durante 3 días y se enjuagó dos veces con PBS. Las células adherentes sobre el sustrato se fijaron durante 1 h en paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente, seguido de dos lavados en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y permeabilización con Triton X-100 al 0,1% (Sigma-Aldrich) en PBS durante 15 min a 4 ° C. Después de lavar con PBS, el filamento de actina se marcó incubando con rodamina faloidina (Life Technologies) a temperatura ambiente durante 15 min. Luego, los núcleos celulares se tiñeron incubando con diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Thermo FisherScientific) durante 5 min. Las células se analizaron bajo un microscopio fluorescente (AX80, Olympus) para examinar la morfología de la adhesión celular y la disposición citoesquelética. Para la observación SEM, las células se fijaron con solución de glutaraldehído al 2.5% (Merck) durante 1 ha temperatura ambiente, luego se enjuagaron en solución de PBS dos veces, se deshidrataron en una serie de etanol (40, 50, 60, 70, 80, 90 y 100 %) y secado de punto crítico con un secador de punto crítico (CPD 030, Leica). Se recubrió una fina película de platino sobre las muestras antes de la observación SEM.

Ensayo de proliferación celular

Las células se sembraron en cada TO _x sustratos a una densidad de 1 × 10 ⁴ células / cm ² y cultivado durante 1 semana. Después de 1 semana, las muestras se enjuagaron con PBS dos veces y se estimó la proliferación celular utilizando el kit de reactivos WST-1 (Roche, Penzberg, Alemania). El medio que contenía 10% de reactivo de proliferación celular WST-1 se añadió a cada muestra y se incubó en una atmósfera humidificada de 5% de CO ₂ a 37 ° C durante 2 h. La solución de cada pocillo se transfirió a una placa de 96 pocillos. La absorbancia de la solución se midió a 450 nm usando el espectrofotómetro (Spectral Max250).

Análisis estadístico

Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado y se realizaron al menos tres experimentos independientes. Los datos se presentaron como media ± desviación estándar (DE) y se analizaron mediante análisis de varianzas (ANOVA) utilizando el software SPSS 12.0 (SPSS Inc.). A p un valor de <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados y discusión

La Figura 1a-e muestra las imágenes SEM de la lámina plana de Ta y el TaO anodizado _x matrices de nanotubos con un diámetro medio de nanotubos de 20, 35, 65 y 90 nm, respectivamente. Todo como TaO anodizado _x Los nanotubos exhiben una estructura nanotubular bien definida, y sus diámetros de nanotubos eran casi proporcionales a los voltajes aplicados. Entre estas muestras, los nanotubos de 20 nm de diámetro muestran una superficie nanotubular relativamente poco clara, como se muestra en el área ampliada tomada de la Fig. 1b. Esta observación se puede atribuir a la fuerza de campo más débil en operación de bajo voltaje en el proceso de anodización. La Figura 2 muestra además la sesión cruzada de todas las TaO _x nanotubos y sus correspondientes longitudes nanotubulares. Se emplearon análisis XRD y TEM para identificar aún más la TaO _x cristalinidad de nanotubos. Como se muestra en los espectros XRD de la Fig. 3a, solo se observan picos relacionados con la lámina de Ta (tarjeta JCPDS n. ° 04–0788), lo que sugiere que TaO _{x as-anodizado} los nanotubos son posiblemente una fase amorfa. La Figura 3b muestra una imagen TEM representativa tomada de un TaO _{x de 90 nm de diámetro} nanotubos desprendidos de la muestra anodizada, revelando una estructura nanotubular bien definida. El patrón de difracción impecable en el recuadro confirma que el TaO _x los nanotubos no son cristalinos.

Imágenes SEM que muestran la a Ta superficie de lámina y TaO autoorganizado _x nanotubos con diámetros de b 20, c 35, d 65 y e 90 nm, respectivamente

Imágenes SEM que muestran las secciones transversales de TaO _x nanotubos con diámetros de a 20, b 35, c 65 y d 90 nm, respectivamente

un Espectros XRD de TaO anodizado _x nanotubos de diferentes diámetros y b Imagen TEM tomada de un TaO _{x anodizado} nanotubo con un diámetro de 90 nm. El recuadro también muestra el patrón de difracción correspondiente

El estudio anterior informó que la unión celular, la propagación y la organización citoesquelética son significativamente mejores en superficies hidrófilas en comparación con las superficies hidrófobas [28]. Das y col. indicó además que un ángulo de contacto bajo implica una alta energía superficial, que también es un factor crucial que contribuye a una mejor unión de la celda [29]. Por lo tanto, es esencial comprender la influencia de TaO _x topografía de nanotubos en la humectabilidad de la superficie. Como se muestra en la Fig.4, todos los TaO _{x anodizados} Los nanotubos son altamente hidrófilos ya que sus ángulos de contacto son mucho más pequeños que 90 °. Además, se encontró que sus ángulos de contacto disminuían monótonamente al disminuir el diámetro de los nanotubos a 35 nm y luego aumentaban inversamente a medida que el diámetro disminuye a 20 nm. También encontramos que el TaO _x Las muestras de nanotubos muestran una tendencia similar cuando se usa agua o medio de cultivo como líquidos de prueba. Intentamos explicar el comportamiento de humectabilidad observado basándonos en la ley de Wenzel, que describe el pequeño ángulo de contacto en materiales hidrófilos [30]. En el modelo de Wenzel, un aumento de la rugosidad de la superficie en el material hidrófilo dará como resultado un ángulo de contacto más pequeño y el agua llenará las ranuras debajo de la gota. Aquí, usamos el factor de rugosidad, es decir, el área de superficie física de nanotubos por unidad de área proyectada, para evaluar la rugosidad geométrica de TaO _x muestras de nanotubos [31]. Como se muestra en la Fig.5, con diámetro interior D , espesor de pared W y longitud de nanotubos L , el factor de rugosidad puramente geométrico G se puede calcular como [4π L { D + W } / {√3 (D + 2 W) ² }] + 1 . Este cálculo asume que todas las superficies de los nanotubos son perfectamente lisas. Los factores de rugosidad calculados para todas las muestras de nanotubos se resumen en la tabla de la Fig.5. Excepto la muestra de 20 nm de diámetro, los nanotubos de diámetro más pequeño tienen la rugosidad geométrica más grande y, por lo tanto, se cree que exhiben una mejor hidrofilia según el modelo de Wenzel. Esta inferencia es consistente con nuestro resultado de que el ángulo de contacto disminuye al disminuir el diámetro de los nanotubos a 35 nm. También explica bien que los nanotubos de 20 nm de diámetro que exhiben una superficie nanotubular relativamente poco clara muestran una rugosidad geométrica más pequeña y una hidrofilia más pobre que otros.

un - j Imágenes ópticas que muestran gotas de agua y medio de cultivo en la a , f Ta foil superficie y TaO autoorganizado _x nanotubos con diámetros de b , g 20, c , h 35, d, i 65 y e , j 90 nm, respectivamente. Los ángulos de contacto se indican en las imágenes

Diagrama esquemático de una estructura nanotubular idealizada con diámetro interior D , espesor de pared W y longitud de nanotubos L . Los factores de rugosidad calculados para todas las muestras de nanotubos en este estudio se resumen en la tabla

El comportamiento de las células de fibroblastos humanos en respuesta a la lámina plana de Ta y TaO _x Se estudiaron más a fondo las matrices de nanotubos. Para evaluar la unión de las células de fibroblastos en el TaO _x nanotubos, la actina del citoesqueleto se tiñó con rodamina faloidina para expresar fluorescencia roja y los núcleos se tiñeron con DAPI para expresar fluorescencia azul. La inmunotinción de actina muestra una morfología de contacto de material celular distinguible para la lámina plana de Ta y TaO _x nanotubos de diferentes diámetros (ver Fig. 6). Es bien sabido que las células deben adherirse primero a la superficie del material y luego extenderse para una mayor división celular. Una mejor adhesión celular puede provocar una mayor activación de las cascadas de señalización intracelular a través de la integrina acoplada al citoesqueleto de actina [32,33,34]. Se utilizó FE-SEM para la observación detallada de la adhesión celular (ver Fig. 7). Los fibroblastos en el diámetro de 35 nm revelan una excelente adhesión celular con una morfología aplanada alargada. Por otro lado, esos fibroblastos en la lámina de Ta y TaO de 90 nm de diámetro _x Los nanotubos muestran células menos adheridas y falta de extensión celular hasta cierto punto. El área de cobertura de las células en los nanotubos se estimó adicionalmente utilizando el software ImageJ y se anotó en estas imágenes SEM. De manera similar a la tendencia de los ángulos de contacto, se encontró que el área de cobertura disminuye monótonamente al disminuir el diámetro de los nanotubos a 35 nm y luego aumenta inversamente a medida que el diámetro disminuye a 20 nm. El TaO _{x de 35 nm de diámetro} de hecho, el nanotubo muestra el área de cobertura celular más grande. Se sabe que las células reconocen las características de la superficie cuando se ha detectado un sitio adecuado para la adhesión. Se supone que las células pueden estabilizar sus contactos en el TaO _x nanotubos mediante la formación de adherencias focales y fibras de actina maduras, seguidas por el reclutamiento de microtúbulos de tubulina [35]. El citoesqueleto de actina está vinculado a las integrinas que se encuentran dentro de las adherencias. Nuestros hallazgos sugieren que el citoesqueleto en los nanotubos de 35 nm de diámetro podría formarse mejor que los de la lámina plana de Ta u otro TaO _x matrices de nanotubos.

Imágenes de microscopía de fluorescencia de la unión de las células de fibroblastos en la a Ta foil y TaO autoorganizado _x nanotubos con diámetros de b 20, c 35, d 65 y e 90 nm, respectivamente. La fluorescencia roja indica filamento de actina de proteína citoesquelética y la fluorescencia azul indica núcleos

un - e Imágenes SEM que muestran la adhesión celular y la proliferación de células de fibroblastos humanos en a Ta foil superficie y TaO autoorganizado _x nanotubos con diámetros de b 20, c 35, d 65 y e 90 nm, respectivamente. Las áreas de cobertura de las células en las muestras estimadas por el software ImageJ se indican en las imágenes

El ensayo WST-1 se empleó para evaluar más a fondo la proliferación de células de fibroblastos en la TaO _x nanotubos con diferentes diámetros. La Figura 8 muestra la comparación de densidades ópticas medidas a partir de los resultados del ensayo WST-1. Encontramos que la proliferación celular es más alta para TaO _{x de 35 nm de diámetro} muestra de nanotubos. Sin embargo, no hay una diferencia significativa entre el grupo Ta y TaO _x matrices de nanotubos. Además, la proliferación celular y la humectabilidad de la superficie exhiben una tendencia casi similar con la TaO _x Diámetros de nanotubos. Esta observación sugiere que no solo el diámetro de los nanotubos sino también la humectabilidad de la superficie influye fuertemente en la adhesión celular y la siguiente extensión. En otras palabras, en comparación con los nanotubos de 35 nm de diámetro, los de 20 nm de diámetro pueden dar más puntos focales para las células de fibroblastos, pero su hidrofilicidad más pobre elimina algunos contactos focales efectivos y por lo tanto impide la unión celular. Finalmente, el TaO _{x de 35 nm de diámetro} Los nanotubos revelan la mayor biocompatibilidad entre todas las muestras.

Densidades ópticas (QD) medidas después del cultivo de células de fibroblastos humanos en la lámina de Ta y TaO autoorganizado _x nanotubos de diferentes diámetros. Los valores de DO con sus desviaciones estándar se enumeran como una tabla adjunta

Conclusiones

En conclusión, este trabajo estudia la biocompatibilidad de TaO _{x anodizado} nanotubos con diferentes diámetros de nanotubos. Todo TaO anodizado _x Se identificó que los nanotubos eran principalmente de fase amorfa. Discutimos la transición en la humectabilidad de la superficie con TaO _x Diámetros de nanotubos basados ​​en el modelo de Wenzel. La evaluación de biocompatibilidad in vitro indica además que las células de fibroblastos exhiben un comportamiento obvio dependiente de la humectabilidad en la TaO _x matrices de nanotubos. El TaO _{x de 35 nm de diámetro} Las matrices de nanotubos revelan la mejor biocompatibilidad entre todas las muestras de nanotubos. Esta mejora podría atribuirse a puntos focales altamente densos proporcionados por TaO _x nanotubos debido a la mayor hidrofilia de la superficie. Este estudio demuestra que la biocompatibilidad en Ta se puede mejorar formando TaO _x matrices de nanotubos con un diámetro de nanotubos y una rugosidad geométrica adecuados.

Película WS2 de gran superficie con grandes dominios individuales producidos por deposición de vapor químico Efecto del electrodo ITO pulverizado de ángulo oblicuo en estructuras de células solares de perovskita MAPbI3