Nanoadsorbentes fluorescentes SnO₂/SiO₂ para captura de alta eficiencia de proteínas etiquetadas con GST

Resumen

Reportamos una plataforma de nanoesferas de sílice funcionalizadas con tiol (SiO₂-SH) sintetizada hidrotérmicamente de forma facil, que posteriormente se decora con puntos cuánticos (QDs) de SnO₂. Las nanoesferas compuestas SnO₂/SiO₂ (NSs) resultantes muestran una fluorescencia fuerte, responsiva a luz visible, permitiendo el seguimiento en tiempo real de la captura de proteínas. La funcionalización con glutatión reducido (GSH) convierte las NSs en SnO₂/SiO₂-GSH, que se unen específicamente a proteínas etiquetadas con glutatión S-transferasa (GST). Al aplicarse a lisados de E. coli, los nanoadsorbentes exhiben adsorción inespecífica insignificante, una capacidad de unión de proteína de 7,4 mg g⁻¹, y retienen el estado redox y la actividad peroxidasa de la glutatión peroxidasa 3 (GPX3) aislada. Estas propiedades posicionan a las NSs SnO₂/SiO₂-GSH como una herramienta prometedora para la purificación rápida y de alto rendimiento de proteínas etiquetadas con GST.

Antecedentes

La purificación eficiente de proteínas sustenta avances en metabolismo de fármacos, biología estructural y desarrollo de vacunas. Los métodos cromatográficos y de precipitación tradicionales son laboriosos y a menudo comprometen la integridad de la proteína. La purificación por afinidad, explotando la interacción natural entre GST y su ligando, sigue siendo el estándar de oro para proteínas recombinantes que portan una etiqueta GST. Sin embargo, las resinas de afinidad GST convencionales (p. ej., Glutathione Sepharose 4B) sufren de capacidad de unión limitada, alto costo y falta de reporte visual intrínseco.

Los nanomateriales pueden superar estas limitaciones ofreciendo alta área superficial, química ajustable y, cuando se diseñan apropiadamente, firmas ópticas. Los QDs de SnO₂ son atractivos para bioaplicaciones: son químicamente estables, biocompatibles, y exhiben fluorescencia inducida por defectos que puede aprovecharse para imagen. Al anclar QDs de SnO₂ sobre nanoesferas de sílice, creamos una plataforma de doble función que acopla captura por afinidad con monitoreo por fluorescencia.

Experimental

Materiales y Procedimientos Generales

Todos los reactivos fueron de grado analítico y se usaron sin purificación adicional. Reactivos clave incluyen CTAB, SnCl₄·5H₂O, TEOS, MPS y GSH. Los QDs de SnO₂ se prepararon mediante un método hidrotérmico, seguido de unión superficial a NSs SiO₂-SH y posterior conjugación con GSH.

Síntesis de Puntos Cuánticos SnO₂

SnCl₄·5H₂O (3,5 g) se disolvió en 50 mL H₂O; amoníaco (5 mL) se añadió para precipitar Sn(OH)₄, que se lavó y redispersó en 30 mL H₂O. El pH se ajustó a 12 con NH₄OH 2 M, luego se transfirió a un autoclave revestido de Teflón y se calentó a 150 °C durante 24 h. El producto resultante se recolectó, lavó con etanol-isopropanol (1:1), y se secó para obtener QDs de SnO₂ (~5 nm de diámetro).

Fabricación de Nanoesferas SnO₂/SiO₂-SH

QDs de SnO₂ (0,2 g) y CTAB (0,09 g) se dispersaron en una mezcla agua-etanol (42,5 mL + 7 mL). Se añadió TEA (2,7 mL), seguido de TEOS (3,5 mL) y MPS (0,35 mL) bajo agitación a 60 °C durante 5 h. La mezcla se centrifugó, lavó con etanol-HCl y agua, y redispersó para producir NSs SnO₂/SiO₂-SH (~460 nm de diámetro).

Funcionalización con GSH

NSs SnO₂/SiO₂-SH (4 mL, 0,12 g mL⁻¹) se incubaron con GSH (16,7 mg mL⁻¹) en PBS (pH 7,4) a 37 °C durante 24 h. Tras centrifugación y lavado, las NSs SnO₂/SiO₂-GSH se almacenaron en 25 % etanol a 4 °C.

Captura por Afinidad de Proteínas Etiquetadas con GST

GPX3, OST1 y ABI2 etiquetados con GST se expresaron en E. coli BL21(DE3) a partir de constructos pGEX-6p1. Lisados celulares (pH 7,4, 0,01 M) se mezclaron con NSs SnO₂/SiO₂-GSH (1 mL) y rotaron a 4 °C durante 2 h. Tras centrifugación y lavado, las proteínas unidas se eluyeron con GSH 0,5 M, cuantificaron por ensayo BCA, y analizaron por SDS-PAGE.

Ensayo de Actividad GPX3

GPX3 purificado se des-etiquetó con proteasa PreScission y se ensayó para actividad peroxidasa monitoreando consumo de NADPH a 340 nm en presencia de tioredoxina, reductasa de tioredoxina y H₂O₂.

Análisis de Estado Redox

Muestras de GPX3 se trataron con H₂O₂ y DTT, luego se resolvieron en SDS-PAGE no reductor al 15 % para diferenciar formas oxidadas y reducidas.

Caracterización

Morfología y composición se examinaron por TEM (JEM-2010) y SEM (JSM 5600LV). Patrones XRD se registraron en un difractómetro X'Pert Philips. Los espectros de fluorescencia se midieron con un espectrómetro FluoroSENS (excitación 260 nm). La pureza de proteína se evaluó por SDS-PAGE (Power PAC 300). Los ensayos BCA se realizaron con el kit Beijing CoWin.

Resultados y Discusión

Morfología, Cristalinidad y Fluorescencia de los Nanoadsorbentes

Los QDs de SnO₂ mostraron una morfología esférica monodispersa de ~5 nm con un espaciado de red de 0,29 nm (plano 110), confirmando su alta cristalinidad (Fig. 1). XRD coincidió con la fase casiterita (JCPDS 41-1445). Las NSs compuestas SnO₂/SiO₂-GSH retuvieron una forma esférica (~430 nm) con una superficie moderadamente rugosa, como se ve en imágenes SEM y TEM (Fig. 2). La presencia de QDs de SnO₂ en SiO₂ se confirma por TEM (Fig. 2c,d).

El análisis de fluorescencia reveló un pico de emisión fuerte a 368 nm, atribuible a vacancias de oxígeno en SnO₂ (Fig. 3b). La imagen de fluorescencia de las NSs tras captura de proteína (Fig. 3c) demostró luminiscencia intacta, permitiendo el seguimiento visual de complejos unidos.

Eficiencia de Captura de Proteína

SDS-PAGE de GST-GPX3 capturado por NSs SnO₂/SiO₂-GSH mostró enriquecimiento claro de la proteína objetivo (Fig. 4a). El aumento de concentraciones de GSH de elución (10–100 mM) liberó progresivamente la proteína unida, confirmando la especificidad de la interacción GSH-GST. Los nanoadsorbentes exhibieron unión inespecífica insignificante al lisado total de E. coli.

Las pruebas de reutilizabilidad revelaron que las NSs mantuvieron su capacidad de unión en tres ciclos consecutivos de captura (Fig. 4b), subrayando su robustez.

Extender el enfoque a otras proteínas etiquetadas con GST (OST1, ABI2) produjo resultados comparables (Fig. 5). Las capacidades de unión fueron 7,4 mg g⁻¹ (GPX3), 7,1 mg g⁻¹ (OST1) y 6,8 mg g⁻¹ (ABI2), superando a la resina comercial Glutathione Sepharose 4B (7,1, 6,9, 5,6 mg mL⁻¹, respectivamente).

Preservación del Estado Redox y Actividad de GPX3

Tras la remoción de GST, GPX3 retuvo tanto formas oxidadas como reducidas, como evidencian migraciones distintas en SDS-PAGE no reductor (Fig. 6a). El ensayo de actividad peroxidasa (Fig. 6b) demostró que GPX3 aislado vía NSs SnO₂/SiO₂-GSH exhibió actividad comparable a la obtenida con resina comercial, confirmando que el nanoadsorbente preserva la función enzimática.

Conclusiones

Hemos desarrollado un nanoadsorbente fluorescente de puntos cuánticos SnO₂ protegidos por sílice que captura proteínas etiquetadas con GST con alta especificidad y capacidad mientras preserva su estado redox nativo y actividad enzimática. La robusta reutilizabilidad de la plataforma, su rendimiento de unión superior y su fluorescencia intrínseca la convierten en una alternativa atractiva a las resinas de afinidad convencionales para purificación rápida de proteínas.

Abreviaturas

ABI2:

ABA insensitive 2

CTAB:

Bromuro de hexadeciltrimetilamonio

DTT:

Ditiotreitol

GPX3:

Glutatión peroxidasa 3

GSH:

Glutatión reducido

GST-tagged:

Etiquetado con glutatión S-transferasa

MPS:

3-Mercaptopropil-trimetoxisilano

NADPH:

Dinucleótido de adenina fosfato de dihidronicotinamida

OST1:

Open stomata 1

QDs:

Puntos cuánticos

SDS-PAGE:

Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio

SEM:

Microscopía electrónica de barrido

SiO₂-SH NSs:

Nanoesferas de sílice funcionalizadas con tiol

SnCl₄:

Cloruro de estaño (IV)

TEA:

Trietilamina

TEM:

Microscopía electrónica de transmisión

TEOS:

Ortosilicato de tetraetilo

XRD:

Difracción de rayos X