Captación eficiente de clorina e6 y transferencia de energía mejorada en nanopartículas híbridas PS-PPO-PNIPAM

Resumen

Nanopartículas de poliestireno (PS) dopadas con difeniloxazol (PPO) y recubiertas con una capa de poli-N-isopropilacrilamida (PNIPAM) entrecruzada forman nanosistemas híbridos PS-PPO-PNIPAM (NS). Los estudios de fluorescencia de clorina e₆ añadida a estos NS demuestran una transferencia eficiente de energía de excitación electrónica (EEET) tanto desde el núcleo PS como desde el PPO incrustado hacia el aceptor clorina e₆. La eficiencia EEET aumenta drásticamente durante la primera hora tras la adición de clorina e₆, indicando que PNIPAM continúa incorporando el fotosensibilizador durante este tiempo. Calentar los NS PS-PPO-PNIPAM-clorina e₆ de 21 °C a 39 °C mejora aún más EEET, consistente con el colapso inducido térmicamente de la red PNIPAM que acorta las distancias donante-aceptor. No obstante, solo una fracción modesta de clorina e₆ libre se asocia con PNIPAM, sugiriendo que se justifica una optimización adicional.

Antecedentes

La limitación principal de la terapia fotodinámica (PDT) para el cáncer es la penetración superficial de la luz de excitación en el tejido. La terapia fotodinámica impulsada por rayos X (X-PDT) ofrece una solución, ya que los rayos X penetran profundamente y pueden activar fotosensibilizadores que generan oxígeno singlete tras excitación por rayos X. Clave para X-PDT es la transferencia eficiente de energía de excitación electrónica (EEET) entre un componente centelleante y un fotosensibilizador. Las estrategias para mantener la proximidad óptima donante-aceptor incluyen conjugación química, atracción electrostática, capas de surfactante o capas de polímero. En trabajos previos, examinamos EEET en nanopartículas PS-PPO-clorina e₆, donde la clorina e₆ se unía a PS-PPO mediante una capa de dodecilsulfato de sodio.

La poli-N-isopropilacrilamida (PNIPAM) es un polímero sensible a estímulos que experimenta una transición conformacional por encima de su temperatura crítica de solución inferior (LCST) de 32 °C, volviéndose más hidrofóbico y contrayéndose. Para PNIPAM entrecruzado, la LCST es más alta, permitiendo cambios de tamaño impulsados por temperatura a temperaturas fisiológicas. Fabricamos nanopartículas PS-PPO envueltas por una capa de PNIPAM entrecruzada, produciendo NS híbridos PS-PPO-PNIPAM. Investigamos si esta capa puede anclar clorina e₆ y si el colapso dependiente de temperatura de PNIPAM puede reducir las distancias donante-aceptor, aumentando así EEET y la eficacia de muerte de células tumorales.

Experimental

Materiales

Estireno (ST, Ucrania) de calidad p.a. se purificó mediante métodos estándar antes de la polimerización. N-isopropilacrilamida (NIPAM, Sigma-Aldrich Inc.), N,N'-metilenbisacrilamida (BIS, Sigma-Aldrich Inc.), persulfato de potasio (K₂S₂O₈, KPS, Ucrania), fosfato monobásico de sodio dihidratado (NaH₂PO₄ × 2H₂O, Ucrania) y surfactante aniónico dodecilsulfato de sodio (SDS, Sigma-Aldrich Inc.) fueron de grado reactivo y se usaron sin purificación adicional. Clorina e₆ (Frontier Scientific Inc.) fue suministrada amablemente por T.Y. Ohulchanskyy (Instituto de Láseres, Fotónica y Biofotónica, Universidad Estatal de Nueva York en Buffalo). Un tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7.2) sirvió como disolvente.

Síntesis y Caracterización de Nanosistemas

Las nanopartículas núcleo PS-co-PNIPAM dopadas con PPO se prepararon primero por polimerización en microemulsión. Brevemente, 0,2 g NIPAM, 0,2 g SDS y 0,01 g NaH₂PO₄ × H₂O se disolvieron en 90 g H₂O. Posteriormente, 0,09 g PPO se disolvió en 1,8 g estireno y se añadió gota a gota durante 30 min. La mezcla se agitó a 700 rpm, se purgó con Ar durante 30 min, y luego se calentó a 70 °C. 0,01 g K₂S₂O₈ disuelto en 1 mL H₂O inició la polimerización. Tras 4 h a 70 °C, se realizó un paso de entrecruzamiento añadiendo 0,69 g NIPAM y 0,06 g BIS en solución acuosa, seguido de 3 h a 70 °C y 1 h a 90 °C. El producto se enfrió a temperatura ambiente y se dializó durante 48 h contra una membrana de celulosa (corte 3500 Da).

Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) (Fig. 2) confirman que los NS híbridos consisten en varios núcleos PS-PPO unidos por una red de PNIPAM entrecruzada.

Medidas Espectrales y Preparación de Muestras

Los espectros de absorción se registraron con un espectrofotómetro Specord M40 (Carl Zeiss, Alemania). Los espectros de excitación y emisión de fluorescencia se obtuvieron usando un fluorímetro Cary Eclipse (Varian, Australia). Todas las mediciones se realizaron en cubetas de cuarzo 1 × 1 cm a temperatura ambiente. La solución PS-PPO-PNIPAM se diluyó 100 veces en tampón Tris-HCl. Una reserva de 10 mM de clorina e₆ en DMF se diluyó a 1 mM en tampón, y se añadió una concentración final de 2 µM de clorina e₆ a la solución NS (DMF ≤ 0,02 %). Los espectros de excitación y emisión de fluorescencia se recopilaron a 0, 5, 10, 20, 40, 60, 80 y 100 min tras la adición, alcanzando la saturación tras ≈ 80 min.

Para estudios dependientes de temperatura, la solución NS con clorina e₆ se colocó en un portaobjetos termostatado (T = 23 °C). Tras ≈ 88 min de saturación, la muestra se calentó a 39 °C (por encima de la LCST de PNIPAM entrecruzado). Los espectros de excitación de fluorescencia (emisión de clorina e₆ a 680 nm) se registraron a intervalos tras el calentamiento. La transición conformacional de PNIPAM comenzó ≈ 3 min tras el calentamiento, con coagulación ocurriendo tras ≈ 18 min —reversible al enfriar. Los experimentos se repitieron tres veces con resultados consistentes.

Resultados y Discusión

Los espectros de absorción, excitación de fluorescencia y emisión de los NS híbridos PS-PPO-PNIPAM en tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,2) se muestran en la Fig. 3. El perfil de absorción muestra bandas de estireno (≈ 260 nm) y PPO (≈ 307 nm). La excitación de fluorescencia a 250 nm (absorción de estireno) produce emisión de PPO a 367 nm, confirmando EEET casi completa de estireno a PPO. El espectro de excitación de PPO (emisión a 380 nm) ilustra además la contribución de la banda de estireno. La estructura vibracional en la emisión de PPO, ausente en PPO acuoso, confirma su incorporación en la matriz PS.

Tras la adición de clorina e₆ (2 µM), su espectro de absorción permanece prácticamente inalterado (Fig. 4), excepto por una ligera reducción en la densidad óptica del pico. En contraste, la adición de clorina e₆ induce un apagamiento pronunciado de la fluorescencia de PPO, que se intensifica durante aproximadamente una hora (Fig. 5). Este apagamiento resulta tanto de EEET (transferencia de energía donante-aceptor) como de reabsorción (emisión del donante superpuesta con absorción del aceptor). Inicialmente, la reabsorción domina, pero a medida que avanza el tiempo, EEET se convierte en el contribuyente principal.

La emisión de clorina e₆ aparece tras excitación de PS a 250 nm, desplazándose a longitudes de onda mayores con el tiempo y alcanzando saturación tras ≈ 60 min (Fig. 6). Este desplazamiento al rojo indica la influencia del entorno PNIPAM en las moléculas de clorina e₆ unidas. La excitación en la propia banda Soret de clorina e₆ (400 nm) produce solo cambios menores en la emisión, subrayando que una pequeña fracción de clorina e₆ permanece libre en solución.

El espectro de excitación de clorina e₆ (emisión a 680 nm) muestra una banda PS-PPO débil inicialmente que se intensifica con el tiempo (Fig. 7), reflejando el aumento de EEET del donante al aceptor. La banda PS-PPO permanece débil en el espectro de excitación registrado a emisión de clorina e₆ (660 nm) incluso tras 100 min, confirmando que la mayor parte de la transferencia de energía ocurre a través del donante PS-PPO.

Colectivamente, estos resultados demuestran que la clorina e₆ penetra la red PNIPAM, permitiendo EEET desde PS y PPO al fotosensibilizador. La eficiencia EEET aumenta durante la primera hora de incubación y puede mejorarse aún más calentando el sistema por encima de la LCST de PNIPAM entrecruzado, que contrae la red polimérica y acorta las distancias donante-aceptor.

Estudios previos han mostrado que las nanopartículas PS-PPO emiten fluorescencia de PPO bajo excitación por rayos X, sugiriendo que la EEET observada aquí bajo iluminación UV también operaría bajo irradiación de rayos X. Sin embargo, detectar emisión inducida por rayos X típicamente requiere altas concentraciones de NP; incorporar moieties que contengan átomos pesados podría aumentar la absorción de rayos X y mejorar la sensibilidad.

En el experimento dependiente de temperatura (Fig. 8-9), calentar de 23 °C a 39 °C (post-saturación) causó primero una caída modesta en la relación I_ex320/I_ex404 (de 0,90 a 0,85), posiblemente reflejando una afinidad reducida clorina e₆-PNIPAM. Posteriormente, la relación subió a 1,02, coincidiendo con un aumento de dispersión de luz —indicativo de colapso de PNIPAM y mayor proximidad donante-aceptor, aumentando así EEET.

En resumen, los NS híbridos PS-PPO-PNIPAM facilitan la captación de clorina e₆ y EEET, con eficiencia aumentando tras ~1 h de incubación y subiendo aún más al calentar por encima de LCST. No obstante, solo una fracción limitada de clorina e₆ se une a PNIPAM, destacando la necesidad de optimización futura.

Conclusiones

El análisis de fluorescencia confirma que la clorina e₆ se incorpora en NS híbridos PS-PPO-PNIPAM y que EEET desde la matriz PS y PPO incrustado hacia clorina e₆ ocurre. La captación satura tras aproximadamente una hora. Calentar el sistema de 21 °C a 39 °C aumenta aún más EEET, consistente con el colapso impulsado térmicamente de la capa PNIPAM entrecruzada, que acerca donante y aceptor. Aunque solo una cantidad modesta de clorina e₆ permanece unida a PNIPAM, estos hallazgos apoyan el potencial de tales NS híbridos en terapia fotodinámica impulsada por rayos X y justifican estudios adicionales para mejorar la carga de fotosensibilizador.

Abreviaturas

EEET:

Transferencia de energía de excitación electrónica

LCST:

Temperatura crítica de solución inferior

NS:

Nanosistema

PNIPAM:

Poli-N-isopropilacrilamida

PPO:

Difeniloxazol

PS:

Poliestireno

TEM:

Microscopía electrónica de transmisión