Descubrimiento de Macromoléculas Específicas de Genotipo de E. coli mediante Mapeo Nanomecánico AFM

Resumen

La categorización de cepas microbianas se basa convencionalmente en métodos moleculares, y rara vez se estudian las características morfológicas en las cepas bacterianas. En esta investigación, revelamos las estructuras macromoleculares de la superficie bacteriana mediante mapeo mecánico AFM, cuya resolución no solo estaba determinada por el tamaño nanométrico de la punta sino también por las propiedades mecánicas de la muestra. Esta técnica permitió el estudio a nanoescala de estructuras membranosas de cepas microbianas con preparación de muestra simple y entornos de trabajo flexibles, superando las múltiples restricciones de la microscopía electrónica y métodos analíticos bioquímicos que requieren marcadores. Las macromoléculas características ubicadas en la superficie celular se consideraron como proteínas de capa superficial y se encontró que son específicas a los genotipos de Escherichia coli, a partir de los cuales se caracterizaron los tamaños moleculares promediados con diámetros que van de 38 a 66 nm, y las formas moleculares eran reniformes o redondas. En conclusión, las estructuras macromoleculares de superficie tienen características únicas que se vinculan al genotipo de E. coli, lo que sugiere que los efectos genómicos en las morfologías celulares pueden identificarse rápidamente usando mapeo mecánico AFM.

Introducción

Debido a la resolución inferior de la microscopía óptica y el entorno de trabajo restringido de la microscopía electrónica, los investigadores en el campo microbiano rara vez consideran usar la apariencia de las células bacterianas, sino que adoptan métodos analíticos moleculares o químicos para la identificación de fragmentos genómicos, expresión de proteínas, etc. No sorprende que esos métodos tengan una serie de inconvenientes, incluyendo ser laboriosos y consumir mucho tiempo, por lo que se necesitan enfoques más directos, eficientes y flexibles. Inventado en 1982 por Binnig et al., el microscopio de fuerza atómica (AFM) está diseñado para usar una sonda a nanoescala monitorizada por un haz láser para la observación de la superficie de una muestra con resolución nanoscópica o incluso atómica. Al imaginar la morfología mediante una punta de sonda física, esta técnica supera el límite de resolución y las restricciones ambientales de ambas microscopías óptica y electrónica y tiene una serie de ventajas, como preparación de muestra simple y entornos de trabajo flexibles en aire ambiente o condiciones de fluido. Aún, con respecto a estudios microbianos, las aplicaciones actuales de AFM principalmente implican imaginar cualitativamente las morfologías estáticas o dinámicas de células bacterianas o la expresión de flagelos y pili, mientras que pocos estudios se han centrado en la ultraestructura de superficie de células microbianas y el análisis cuantitativo de propiedades celulares.

En esta investigación, se seleccionó AFM para el estudio de superficie de células Escherichia coli (E. coli), y las formas y dimensiones de la bacteria individual se observaron por imágenes de topografía y fase AFM. Además, el mapeo mecánico simultáneo reveló información biomecánica adicional sobre los componentes de superficie, donde pequeñas diferencias en las características adhesivas entre las macromoléculas y la matriz circundante pudieron detectarse durante cada contacto físico entre la punta y la muestra. Aplicando tales técnicas avanzadas a los campos microbianos, examinamos tres genotipos de E. coli que contenían una cepa de laboratorio y dos cepas patógenas humanas para la identificación de macromoléculas de superficie. Los resultados mostraron que la técnica podía ofrecer una resolución de imagen que excede la escala de la punta AFM al detectar la distribución mecánica de la muestra. En conclusión, sugerimos que tal desarrollo en ciencia de superficies no solo proporcionaría a investigadores que trabajan en campos microbianos detalles de la apariencia celular, sino que también contribuiría a nuestro conocimiento de las características de superficie de otros sistemas bio- o nanomateriales.

Métodos

Muestras Microbianas

Las tres cepas de E. coli probadas en esta investigación fueron aisladas clínicamente y proporcionadas por el laboratorio del Prof. Ching-Hao Teng en el Instituto de Medicina Molecular, Universidad Nacional Cheng Kung. MG1655 es la cepa intestinal y de laboratorio tipo salvaje de E. coli K-12, y las otras dos cepas son patógenos humanos—CFT073, la principal causa de infecciones del tracto urinario, y RS218, asociada con meningitis neonatal en lactantes.

Sustrato Funcionalizado

Se aplicaron dos pasos de modificaciones de superficie para el enlace covalente entre la superficie sólida y las células microbianas. Primero, una solución de 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES, Sigma-Aldrich Co. LLC, USA) se usó para formar una capa inicial funcionalizada con NH₂ en la superficie, donde el recubrimiento APTES estable contribuyó a los enlaces Si-O estables—Si proporcionado por APTES y O de la superficie oxidada. Poseyendo dos funciones COOH, el glutaraldehído se combina a la función NH₂ de APTES con un COOH y trabaja con el NH₂ en la superficie bacteriana con el otro COOH.

Los sustratos limpios se sumergieron en solución APTES, con una mezcla de 5 % APTES en etanol, por una hora y se enjuagaron con etanol y agua ddH₂O. Las láminas se secaron usando corriente de nitrógeno y luego se colocaron en solución de glutaraldehído, 2 % en PBS, durante la noche, y se lavaron con PBS.

Preparación de Muestras

Colonias individuales de las cepas de E. coli se seleccionaron de placas de agar de caldo lisogénico (LB) e incubaron en caldo LB. Después de tiempos de cultivo de 12 h, la solución bacteriana se diluyó 1:100 en caldo LB fresco pre-equilibrado. Después de otras 12 h para cultivo microbiano, la solución bacteriana se sometió a centrifugación a 1500×g (4000 rpm) por 3 min y se resuspendió en caldo LB, repitiendo este proceso dos veces. Doscientos microlitros de la solución bacteriana se depositaron sobre el sustrato funcionalizado y se dejaron reposar por 30 min. La muestra se sumergió luego en agua destilada dos veces para eliminar células no adheridas e inmediatamente se imagenó bajo AFM en aire ambiente.

Caracterización AFM

Se seleccionó un instrumento AFM (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, USA) y una sonda de nitruro de silicio con constante de resorte calibrada de 0,7 N/m y radio de punta de 10 nm para el examen de superficie de especímenes microbianos. La velocidad de barrido AFM y píxeles de línea fueron 0,5 Hz y 256 líneas, respectivamente, para tamaño de barrido de 10 μm para la primera detección de topografía, y los parámetros se establecieron luego como 0,3 Hz y 512 líneas para tamaño de barrido de 2 μm para observación detallada. El modo PeakForce nanomecánico cuantitativo (QNM) se usó para el mapeo nanomecánico, donde las propiedades adhesivas de la superficie se calcularon a partir de la fuerza atractiva máxima entre las curvas de fuerza-distancia de retracción.

Nuestro estudio previo en Streptococcus mutans mostró la evolución mecánica en superficie bacteriana por 2 h, monitoreada por mapeo mecánico AFM continuo, y las muestras microbianas se verificaron para permanecer vivas dentro de tal duración. Para asegurar la viabilidad de las muestras de E. coli usadas en este trabajo, se realizaron pre-estudios en las muestras bacterianas, y el cambio continuo en adhesión de superficie por 4 h implicó que las células permanecen vivas por al menos 4 h después de la preparación de la muestra (mostrado en Archivo adicional 1). Consecuentemente, las muestras microbianas probadas en este trabajo fueron medidas por AFM dentro de 2 h después de la preparación del espécimen. Todos los genotipos de E. coli se cultivaron individualmente y en diferentes momentos, y las mediciones AFM se realizaron inmediatamente después de la preparación del espécimen. En otras palabras, las muestras bacterianas no estaban alineadas esperando el examen, por lo que los efectos del tiempo de espera en las diferencias entre cepas de E. coli se minimizaron. Los datos cuantitativos para cada cepa de E. coli se recopilaron de las mediciones tomadas dentro de 2 h en este estudio.

Análisis Estadístico

Prism (GraphPad Software, USA) se usó para el análisis estadístico en este trabajo. Longitudes celulares y tamaños de macromoléculas se presentaron como valores medios junto con el error estándar de la media (SEM). Las comparaciones múltiples entre genotipos de E. coli se procesaron usando análisis de varianza unidireccional ordinario (ANOVA). Se seleccionó el nivel de confianza del 95 % (p < 0,05), y los asteriscos indican el grado de diferencia significativa encontrada. El número de muestra n de cada cepa fue > 40.

Resultados y Discusión

Ultraestructura de Superficie por Mapeo Múltiple

Al escanear con AFM a una escala de observación de 10 μm en una muestra bacteriana, se pudieron ver varias células individuales de E. coli MG1655, y la forma celular en tres dimensiones se pudo observar desde la imagen topográfica (Fig. 1a); los contornos claros de las células mostrados en dos dimensiones se obtuvieron por la imagen de error de deflexión (Fig. 1b), y se pudieron encontrar varios túbulos junto a las células bacterianas. Los filamentos ondulados (Fig. 1c) eran consistentes con la apariencia de flagelos microbianos reportada en otro trabajo, lo que confirmó tal hallazgo como flagelos, y los pili más cortos y parecidos a pelo también se pudieron ver. Al disminuir el área de observación de la sonda para el estudio detallado de células microbianas individuales, la topografía mostró una ligera diferencia en la dirección vertical entre superficies celulares, como se muestra en Fig. 1d, y la imagen de error de deflexión parecía proporcionar más información morfológica mientras que el ruido ambiental recogido era demasiado para investigar la ultraestructura de la superficie celular (Fig. 1e). Cuando se midieron las propiedades biomecánicas simultáneas del espécimen durante el contacto entre la punta y el objeto probado, se encontró que la superficie bacteriana estaba realmente compuesta de una gran cantidad de macromoléculas con forma y tamaño específicos, como fue revelado por el mapeo de fuerza adhesiva (Fig. 1f); así, la resolución morfológica en imágenes topográficas y de error de deflexión se mejoró aún más con información biomecánica.

En la Fig. 2a, la expresión de flagelos por E. coli MG1655 se pudo ver evidentemente, donde el tamaño de filamentos era similar a los de la Fig. 1b, con propiedades de adhesión relativamente menores que el sustrato. Además, la superficie bacteriana se encontró compuesta de componentes circulares que se caracterizaron como menos adhesivos en comparación con la matriz circundante. Esta observación es similar a nuestros hallazgos previos en capas de tejido de piel de ratón, y los granos recurrentes y comparables se consideraron macromoléculas, cuya estructura es más densa y consistente que las vistas en la región intermolecular, por lo que las diferencias en el rendimiento de adhesión pudieron detectarse fácilmente. La capa más externa del envoltorio celular en bacterias Gram-negativas es una capa de proteínas de auto-ensamblaje, como se ilustra en la Fig. 2b, que se conoce como proteína de capa superficial (S-layer). Las estructuras de S-layer se midieron tradicionalmente por microscopía electrónica mientras que los requisitos de entornos de vacío y recubrimiento conductor perdieron la información nativa y en tiempo real sobre las proteínas. Aunque algunas investigaciones extrajeron las proteínas de S-layer y las reensamblaron sobre sustrato de mica para el escaneo AFM, los resultados carecían del rendimiento in situ y en tiempo real de la estructura de S-layer. Basándonos en la arquitectura celular y algunas imágenes previas de superficie microbiana por microscopía electrónica, consideramos las macromoléculas observadas como proteínas de S-layer.

Comparando las mediciones AFM y microscopía electrónica de transmisión (TEM), la primera tiene varias ventajas sobre la segunda, como preparación de muestra más simple, requisitos experimentales menos restrictivos, y aplicaciones de imagen más amigables biológicamente. La selección de TEM en el campo biológico generalmente se selecciona debido a su capacidad para ver organelos intercelulares y la imagen de ultra-resolución (típicamente nanómetro o sub-nanómetro) que puede obtenerse. El mapeo de adhesión AFM en el trabajo actual mejoró la resolución de características y presentó los arreglos de macromoléculas de superficie de una manera que no dependía del tamaño de la punta, sino de la estructura intrínseca de la muestra misma. Además, este enfoque permite resolución nanoscópica de superficie microbiana a lo largo de un área de decenas de micrómetros cuadrados.

Diferencias en Características Morfológicas Manipuladas Genómicamente

Después de observar la ultraestructura de superficie de células E. coli MG1655, un tema de interés es cómo se arreglan las macromoléculas en otras cepas. Los patógenos humanos E. coli CFT073 y RS218 fueron así examinados por AFM con los mismos parámetros experimentales, y no hubo diferencias significativas en formas y dimensiones celulares entre estos tres genotipos a tamaño de característica de 10 μm, visto en Fig. 3a–c. El mapeo de fuerza adhesiva se usó para identificar las proteínas de S-layer, y estructuras disímiles con varias formas y tamaños fueron detectadas entre las diferentes cepas de E. coli, como se muestra en Fig. 3d–f. Para facilitar la comparación, las imágenes detalladas de mapeo de adhesión de las cepas de E. coli se mostraron en Fig. 3g–i. Las macromoléculas de superficie se caracterizaron como teniendo forma redonda en células MG1655 y RS218, aunque diámetros moleculares diferentes, que fueron 38 ± 1,1 nm (n = 80) para MG1655 y 58 ± 2,7 nm (n = 46) para RS218. Por otro lado, las células CFT073 poseían una forma única de proteínas de S-layer, que eran reniformes con la diferencia de longitud entre dos puntos finales de 66 ± 3,2 nm (n = 44). Después de analizar los tamaños de las proteínas de S-layer de estos tres genotipos para comparaciones múltiples, los resultados demostraron las diferencias significativas entre estas cepas (Fig. 4).

Las S-layers microbianas se reporta que juegan roles importantes en muchas funciones, que contienen proteger células de entornos severos, ataques de fagocitosis y bacterias depredadoras. Además, las S-layers también sirven como adhesinas que permiten la colonización efectiva. Las estructuras de S-layer han sido bien estudiadas por TEM y categorizadas en varios tipos de red con el espacio entre centro-a-centro en el rango de 4–35 nm. La variación entre nuestros resultados AFM y reportes TEM de la literatura se pensó como las diferentes metodologías de imagen, donde TEM da la morfología 2D de estructura de S-layer y AFM captura la topografía 3D que incluye las múltiples influencias contribuidas por la radiancia y rugosidad celular y la geometría de la sonda AFM.

Diferentes tipos de estructuras de S-layer se pensó originalmente posibles para usar sus diversas características taxonómicas para distinguir entre especies bacterianas, aunque luego se encontró que incluso para una sola especie, las cepas microbianas podían poseer diferentes redes de proteínas. Mientras algunos estudios investigaron el papel de la S-layer en formación de filamentos, los tipos de proteínas en membranas celulares y las diversidades genómicas en tamaño entre genotipos de E. coli, las diferencias en proteínas de S-layer rara vez se han notado. Los resultados del estudio actual revelaron las diferencias en características morfológicas entre E. coli MG1655, CFT073 y RS218 y sugieren que las apariencias de las macromoléculas de superficie eran probablemente específicas a genotipos individuales de E. coli.

Conclusiones

En este trabajo, información nanoestructural específica genómica sobre la superficie bacteriana fue detectada por mapeo mecánico AFM, que distinguió las diferencias adhesivas entre las macromoléculas y la matriz circundante. Las macromoléculas de superficie de las células microbianas se consideraron como las proteínas de capa superficial, según la arquitectura molecular de microbios Gram-negativos. Los arreglos y tamaños de esas macromoléculas se encontraron específicos a los genotipos de E. coli probados con formas y tamaños distintos, con estas diferencias mostradas como significativas por análisis estadístico. En conclusión, consideramos que la estructura de S-layer bacteriana es dependiente del genoma y puede ser el método potencial para el diagnóstico rápido de enfermedades asociadas a microbios o cepas microbianas. Para implementar la aplicación práctica de la característica de S-layer, se requiere el examen de más genotipos bacterianos para el catálogo complementario. Actualmente estamos estableciendo la base de datos conectando características morfológicas bacterianas y los rendimientos fisiológicos/patológicos y creemos que será un progreso prometedor para la aplicación práctica del examen AFM.

Abreviaturas

AFM:

Microscopio de fuerza atómica

ANOVA:

Análisis de varianza unidireccional

APTES:

3-Aminopropiltrietoxisilano

LB:

Caldo lisogénico

QNM:

Nanomecánico cuantitativo

S-layer:

Capa superficial

TEM:

Microscopía electrónica de transmisión