Evaluación de la seguridad de nanotransportadores liposomales administrados intratimpánicamente en el oído interno de rata

Resumen

Los nanotransportadores liposomales (LPNs) ofrecen alta carga de fármaco y captación eficiente en el oído interno tras administración intratimpánica mínimamente invasiva. Sin embargo, su biocompatibilidad en este órgano sensible no había sido evaluada sistemáticamente. En este estudio, LPNs —con o sin ácido gadolinio-tetra-azaciclododecano-tetra-acético (Gd-DOTA)— se inyectaron transtimpánicamente en ratas Sprague-Dawley. La resonancia magnética realzada con gadolinio (Gd-MRI) rastreó la distribución de LPNs e integridad de barreras, mientras que las respuestas auditivas del tronco encefálico (ABR) midieron la función auditiva. Marcadores inflamatorios (glicosaminoglicanos, ácido hialurónico, CD44, TLR2) y apoptosis (TUNEL) se cuantificaron en tejidos cocleares. Los resultados mostraron entrada eficiente de LPNs al oído interno sin alterar barreras del oído medio o interno, sin pérdida auditiva y sin elevación de marcadores inflamatorios o apoptóticos. Por tanto, la administración transtimpánica de LPNs es segura para la cóclea de rata y promete tratar la hipoacusia neurosensorial.

Antecedentes

Los LPNs son la plataforma nanoterapeútica más antigua en clínica, usada exitosamente para cáncer, enfermedades infecciosas, inflamación y dolor. Su alta capacidad de carga y captación probada en el oído interno los hacen atractivos para terapia otológica. La administración intratimpánica es un enfoque racional y dirigido que limita la exposición sistémica y ya se emplea clínicamente para enfermedad de Ménière y hipoacusia neurosensorial súbita. Si bien trabajos previos demostraron LPNs funcionalizados con péptidos llegando a la cóclea, el perfil de seguridad de LPNs en el oído interno —especialmente respecto a función de barrera, inflamación y viabilidad celular— permanecía desconocido. Este estudio cubre ese vacío evaluando la biocompatibilidad de LPNs en el oído interno de rata usando Gd-MRI, ABR y análisis histológicos completos.

El ácido hialurónico (AH) es componente mayor de matriz extracelular que une CD44 y TLR2/4, iniciando vías inflamatorias. La acumulación de AH se ha vinculado a aumento de permeabilidad e inflamación en varios tejidos, incluyendo cóclea, donde nanopartículas de plata (AgNPs) indujeron acumulación de AH. Por tanto, AH, CD44 y TLR2 se examinaron como marcadores inflamatorios críticos.

El objetivo fue determinar si LPNs transtimpánicos comprometen integridad de barrera del oído interno, inducen inflamación o causan pérdida auditiva. Gd-MRI evaluó función de barrera, ABR midió umbrales auditivos, e inmunohistoquímica cuantificó AH, CD44, TLR2 y fragmentación de ADN apoptótico.

Resultados

LPNs no causaron cambios funcionales en la cóclea de rata

Gd-MRI demostró que LPNs entraron eficientemente a la cóclea, con señal fuerte en escala vestibular y timpani dentro de 3 h post-inyección (Fig. 2c-f). A 6 h, la distribución de señal se volvió homogénea en toda la cóclea, indicando equilibración completa (Fig. 2e-f). La integridad de barreras sangre-perilinfa y sangre-endolinfa permaneció intacta, reflejada por intensidades de señal comparables entre oídos tratados y no tratados (Tabla 1). Los umbrales ABR para clics y ráfagas tonales (2-32 kHz) no mostraron cambio significativo a 2, 4 o 7 días post-inyección, confirmando función auditiva preservada (Fig. 3).

LPNs no indujeron acumulación de glicosaminoglicanos en la cóclea de rata

La tinción de ácido periódico-Schiff reveló ningún aumento de glicosaminoglicanos en estructuras cocleares (limbo espiral, pared ósea, estría vascular) tras tratamiento con LPN o LPN-Gd comparado con controles de agua desionizada (Figs. 5, 6). La cuantificación confirmó ninguna diferencia estadísticamente significativa (p > 0,05).

Impacto menor en secreción de ácido hialurónico por LPNs

Inmunofluorescencia detectó AH principalmente en células ganglionares espirales, células basales estriales, células del surco externo y células endoteliales capilares (Fig. 7). Mientras la intensidad de AH en fibroblastos del ligamento espiral disminuyó ligeramente tras administración de LPN o LPN-Gd, este cambio no se tradujo en permeabilidad de barrera alterada ni pérdida auditiva (Fig. 8).

Expresión de CD44 permaneció inalterada tras exposición a LPNs

Células CD44-positivas fueron abundantes en capa basal estrial, ligamento espiral, células de Deiters y endotelio capilar en todos los grupos, sin diferencias significativas en intensidad de tinción o conteos celulares entre oídos tratados y control (Figs. 9, 10).

Expresión de TLR2 no afectada por LPNs

Inmunorreactividad TLR2 fue alta en células basales estriales, fibroblastos del ligamento espiral y endotelio pero no difirió entre oídos tratados con LPN, LPN-Gd y agua (Figs. 11, 12).

Sin aumento de apoptosis coclear tras administración de LPNs

Tinción TUNEL reveló núcleos apoptóticos dispersos en toda la cóclea en todos los grupos, sin elevación en cohortes LPN o LPN-Gd comparado con controles (Fig. 13). La apoptosis ocasional observada en platillo del estribo y nicho de ventana oval se considera parte del recambio celular normal.

Discusión

Nuestros datos demuestran que LPNs intratimpánicos llegan eficientemente al oído interno, atravesando tanto vías de ventana oval como redonda, sin comprometer barreras sangre-perilinfa o sangre-endolinfa. La ausencia de cambios en umbrales auditivos y ausencia de marcadores inflamatorios o apoptóticos confirman que LPNs son bien tolerados en la cóclea de rata. La ligera reducción en secreción de AH de fibroblastos del ligamento espiral parece clínicamente irrelevante, reflejando probable cambio hacia AH de alto peso molecular antiinflamatorio sin inducir cambios de permeabilidad. Estos hallazgos se alinean con reportes previos que LPNs de 95 nm son más eficientes para entrega al oído interno y que LPNs mayores (110-115 nm) mantienen seguridad.

Importante, el estudio confirma que LPNs no activan el eje inflamatorio TLR2/CD44, vía clave implicada en lesión coclear por especies reactivas de oxígeno y toxinas mitocondriales. Por tanto, LPNs representan un vehículo seguro para entrega dirigida de fármacos al oído interno, apoyando su potencial aplicación clínica en hipoacusia neurosensorial y otras condiciones otológicas.

Conclusiones

La administración transtimpánica de nanotransportadores liposomales es segura para el oído interno de rata, preservando integridad de barrera, función auditiva y homeostasis celular. LPNs prometen como plataforma de entrega de fármacos para futuras terapias del oído interno.

Métodos

Materiales

Lípidos (esfingosina, SOPC, DSPE-PEG-2000), colorantes fluorescentes (DiI, TRITC-DHPE), Gd-DOTA (DOTAREM) y nanopartículas de plata (AgNPs) se obtuvieron de proveedores comerciales. Pureza de lípidos verificada por cromatografía en capa fina; concentraciones determinadas gravimétricamente.

Preparación y Caracterización de LPNs

LPNs unilamelares (~110 nm) encapsulando 500 mM Gd-DOTA (LPN-Gd) y LPNs en blanco (~115 nm) se prepararon por método de hidratación de película delgada descrito previamente. Distribución de tamaño y potencial zeta se midieron por dispersión dinámica de luz.

Administración de LPNs

Bajo anestesia con isoflurano, 50 µl de LPN o LPN-Gd se inyectaron transtimpánicamente en el oído medio izquierdo vía microscopio quirúrgico. El oído contralateral recibió agua desionizada como control negativo. Los animales se posicionaron con el oído inyectado hacia arriba por 15 min post-inyección.

Evaluación de Función de Barrera Biológica Usando Gd-MRI

Gd-MRI se realizó en escáner Bruker 4,7 T usando protocolo RARE. Contraste se administró intravenosamente 2 h antes de imagen. Puntos de tiempo de imagen variaron de 5 h a 8 días post-inyección para capturar cambios agudos y subagudos.

Respuesta Auditiva del Tronco Encefálico (ABR)

Umbrales ABR para clics y ráfagas tonales (2-32 kHz) se registraron en basal, 2, 4 y 7 días post-inyección usando montaje de electrodos estándar y cámara atenuada de sonido.

Análisis Histológicos e Inmunofluorescencia

Tras ABR final, cócleas se colectaron, descalcificaron y seccionaron. Tinciones hematoxilina-eosina y ácido periódico-Schiff evaluaron inflamación y contenido de glicosaminoglicanos. Inmunofluorescencia para AH, CD44, TLR2 se realizó en criosecciones, y imagen confocal cuantificó intensidades de señal. Apoptosis se detectó por marcado TUNEL.

Análisis Estadístico

Datos se analizaron con SPSS 20. ANOVA unidireccional y pruebas Kruskal-Wallis compararon cambios ABR e intensidades de tinción; pruebas LSD post-hoc siguieron hallazgos significativos. p < 0,05 se consideró significativo.