Micro-ambientes ácidos en liposomas mejoran significativamente la estabilidad y eficacia anticancerígena de curcumina

Resumen

Los liposomas ofrecen una plataforma versátil para administrar compuestos bioactivos, yet la inestabilidad intrínseca de fármacos sensibles al pH en condiciones fisiológicas sigue siendo un desafío. Diseñamos una formulación liposomal que crea un micro-ambiente ácido dentro de su núcleo acuoso, protegiendo así la carga encapsulada. Se fabricaron liposomas cargados con curcumina (Cur-LPs) con valores de pH interno de 2,5, 5,0 y 7,4, todos exhibiendo tamaños de partícula comparables (~300 nm), polidispersidad estrecha (<0,2) y perfiles de liberación in vitro similares. Notablemente, la integridad química de la curcumina en 50 % suero fetal bovino y su citotoxicidad contra células HepG2 dependieron fuertemente del pH interno: Cur-LP-2,5 > Cur-LP-5,0 > Cur-LP-7,4. Estos hallazgos demuestran que un núcleo ácido dentro de liposomas es una estrategia práctica y eficiente para estabilizar terapéuticos sensibles al pH.

Antecedentes

Las vesículas lipídicas artificiales, o liposomas, emulan membranas celulares con una bicapa fosfolipídica rodeando un interior acuoso, ofreciendo alta carga de fármaco, biodegradabilidad y biocompatibilidad [1-5]. Su arquitectura anfifílica permite solubilizar fármacos hidrofóbicos mientras los protege del medio extracelular hostil [6-9]. La modificación superficial prolonga aún más la circulación sistémica o dirige cargas a tejidos específicos [10-14], y varias formulaciones liposomales han logrado aprobación clínica [15-18].

A pesar de estas ventajas, administrar fármacos inestables a pH neutro sigue siendo problemático. Los liposomas convencionales se preparan típicamente en tampón fosfato-salino (PBS) a pH 7,4, exponiendo así cargas sensibles al pH a un ambiente desfavorable. La curcumina, un polifenol lipofílico con potentes propiedades antiinflamatorias y anticancerígenas, ejemplifica este problema: su pobre solubilidad acuosa y degradación mediada por pH limitan su traducción clínica [19-23]. Por tanto, crear un micro-ambiente ácido dentro del núcleo liposomal podría preservar la integridad de tales fármacos.

En este estudio, aprovechamos el compartimento acuoso interno de los liposomas para generar un gradiente de acidez ajustable y evaluamos su impacto en encapsulación, estabilidad y actividad anticancerígena de la curcumina.

Métodos

Materiales

Fosfatidilcolina de lecitina de soja (grado inyección) se obtuvo de Shanghai Tai-Wei Pharmaceutical Co., Ltd.; colesterol de Amresco; poloxamer 188 (F68) donado por BASF (China); curcumina (≥ 98 %) de Sigma; suero fetal bovino (FBS) de HyClone. Todos los reactivos fueron de grado analítico.

Preparación de liposomas cargados con curcumina

Los Cur-LPs se produjeron vía método de evaporación de película delgada [27,28] con modificaciones. Fosfolípidos (75 mg) y colesterol (5 mg) se disolvieron en 0,5 mL etanol conteniendo 2 mg/mL curcumina. La solución se mezcló con 5 mL PBS 0,001 M (pH 2,5, 5,0 o 7,4) conteniendo 1 % (p/v) F68 para estrechar distribución de tamaño. Tras 1 min agitación magnética a 35 °C, la mezcla se evaporó bajo vacío y en oscuridad durante 30 min para remover etanol. La centrifugación posterior a baja velocidad (3 000 rpm, 5 min) removió curcumina libre; el pellet se centrifugó luego a alta velocidad (16 000 rpm, 10 min) y resuspendió en PBS (pH 7,4). Las formulaciones resultantes se designaron Cur-LP-2,5, Cur-LP-5,0 y Cur-LP-7,4; liposomas en blanco se prepararon idénticamente.

Caracterización

La dispersión dinámica de luz (DLS) midió tamaño hidrodinámico e índice de polidispersidad (PDI); el potencial zeta se evaluó por dispersión de luz electroforética (ELS) usando Malvern Zetasizer Nano ZS90 a 25 °C. La eficiencia de encapsulación (EE) se calculó via fluorescencia tras separar curcumina encapsulada de libre por centrifugación de alta velocidad [29].

Microscopía electrónica de barrido

Imágenes SEM (FEI INSPECT F) se obtuvieron tras dilución 100x en agua destilada, depósito por gota en vidrio, secado al aire y recubrimiento de oro.

Estabilidad física

La estabilidad coloidal se evaluó monitorizando cambios de tamaño y transmitancia (550 nm) durante 72 h a 37 °C. La agregación (termodinámica) y sedimentación (cinética) se cuantificaron respectivamente.

Liberación in vitro

La liberación de curcumina desde Cur-LPs se midió usando bolsa de diálisis 10 kDa en PBS (pH 7,4, 0,1 % Tween 80) a 37 °C con agitación 100 rpm. Las muestras se recolectaron en intervalos predeterminados, se reemplazaron con medio fresco, y analizaron por fluorescencia (Ex 458 nm, Em 548 nm).

Estabilidad química en suero

Los Cur-LPs (diluidos 10x) se mezclaron con 1 mL 50 % FBS e incubaron a 37 °C, 100 rpm. En tiempos establecidos, alícuotas se extrajeron, mezclaron con etanol, centrifugaron, y la curcumina remanente se cuantificó por fluorescencia.

Eficacia anticancerígena in vitro

Células HepG2 se sembraron a 10 000 células/pocillo en placas de 96 pocillos, cultivadas 24 h en PRIM-1640 + 10 % FBS, lavadas con PBS, y luego tratadas con 4 µg/mL curcumina (libre o encapsulada) en medio libre de suero. La viabilidad celular se evaluó tras 1 y 3 días usando ensayo CCK-8. La viabilidad se expresó como % relativo a control sin tratamiento.

Estadísticas

Los datos se presentan como media ± DE (n = 3). La prueba t de Student bilateral determinó significancia; p < 0,05 se consideró significativo.

Resultados y discusión

Caracterización de liposomas

Todos los Cur-LPs exhibieron tamaños de partícula similares (~300 nm) y PDI < 0,2 (Figura 1a). Los potenciales zeta fueron más negativos para Cur-LP-5,0 y Cur-LP-2,5 (~ −18 mV) comparado con Cur-LP-7,4 (−9 mV), reflejando la influencia de la acidez interna en la carga superficial (Figura 1b). La EE mayor observada para Cur-LP-2,5 (74 %) versus Cur-LP-5,0 (45 %) y Cur-LP-7,4 (64 %) sugiere que interiores acidificados mejoran la carga de curcumina, posiblemente debido a dinámicas de solubilidad alteradas a pH bajo [33].

La obtención de imágenes SEM confirmó morfología esférica en todas las formulaciones (Figura 2). Agregación menor se notó para Cur-LP-7,4, consistente con su menor potencial zeta, y los diámetros SEM observados fueron menores que valores DLS debido a efectos de deshidratación.

Estabilidad física

Durante 72 h a 37 °C, ninguna formulación mostró aumento significativo de tamaño o cambio de transmitancia (< 10 %), indicando robusta estabilidad termodinámica y cinética independientemente del pH interno (Figura 3).

Liberación in vitro

La curcumina liberó rápidamente de solución libre (> 80 % en 6 h), confirmando la membrana de diálisis no impedía difusión. Los Cur-LPs mostraron liberación sostenida, casi de orden cero, con ~30 % liberación acumulada en 72 h (Figura 4). La regresión lineal (R² > 0,99) subrayó la cinética de liberación consistente, una característica ventajosa para mantener niveles terapéuticos.

Efecto del pH interno en estabilidad química

La incubación en suero reveló dependencia pronunciada de pH: tras 6 h, Cur-LP-2,5 retuvo 55 % de curcumina, comparado con 43 % (Cur-LP-5,0) y 34 % (Cur-LP-7,4) (Figura 5). Esta tendencia refleja la conocida sensibilidad al pH de curcumina libre [26]. El núcleo ácido probablemente suprime actividad enzimática y protege la curcumina dentro de la bicapa lipídica, que, contrariamente a lo esperado, es permeada por un pequeño volumen acuoso que puede influir en la estabilidad del fármaco.

Eficacia anticancerígena in vitro

Los liposomas en blanco promovieron modestamente la proliferación de HepG2 a 1 día, sugiriendo efecto nutricional [27]. La curcumina libre exhibió citotoxicidad limitada debido a pobre solubilidad. En contraste, los Cur-LPs inhibieron significativamente el crecimiento celular de manera dependiente del pH: tras 1 día, viabilidad fue 80 % (Cur-LP-2,5 y Cur-LP-5,0) versus 90 % (Cur-LP-7,4); tras 3 días, la viabilidad cayó a 24 % (Cur-LP-2,5), 21 % (Cur-LP-5,0) y 39 % (Cur-LP-7,4) (Figura 6). El rendimiento superior de Cur-LP-2,5 se alinea con su mayor EE y estabilidad.

Conclusiones

Modular la acidez interna de los liposomas ofrece una estrategia sencilla pero poderosa para mejorar la estabilidad química y eficacia terapéutica de fármacos sensibles al pH, incluso para moléculas hidrofóbicas que residen en la bicapa lipídica. El micro-ambiente ácido creado en Cur-LP-2,5 no solo preservó la curcumina contra degradación en suero sino que también amplificó su actividad anticancerígena en células HepG2. Este enfoque puede extenderse fácilmente a otros terapéuticos lábiles, potencialmente mejorando su rendimiento clínico.