Nanopartículas biodegradables multimodo sensibles al microambiente de tumores para la obtención de imágenes específicas del cáncer de mama

Resumen

Los agentes de contraste de ultrasonido (EE. UU.) Llenos de gas colapsan fácilmente en el cuerpo y el gas puede desbordarse fácilmente, lo que limita la eficacia de las imágenes de EE. UU. Para abordar este problema, se desarrolló un sistema multimodo generador de gas inyectable que lleva el agente de contraste negativo para RM Fe ₃ O ₄ , el tinte fluorescente Cy5.5 y el CO ₂ donante liberador (Na ₂ CO ₃ ). Las nanopartículas pueden generar continuamente dióxido de carbono (CO ₂ ) gas en el tejido tumoral ácido en el cuerpo, lo que le da al tumor una fuerte señal de eco bajo imágenes ultrasónicas. Además, las nanopartículas confieren excelentes efectos para la resonancia magnética y la imagen de fluorescencia del tejido tumoral. Los resultados indican que este sistema NP sensible al pH proporciona buenos efectos en la resonancia magnética / ecografía / imágenes fluorescentes. Este estudio proporciona una referencia útil para la obtención de imágenes de tumores multimodo.

Introducción

En la práctica clínica, las microburbujas se aplican principalmente como agentes de contraste de ultrasonido para la obtención de imágenes en tiempo real de varios órganos y vasos sanguíneos [1, 2, 3]. Los agentes de contraste de ultrasonido tradicionales generalmente consisten en materiales como lípidos o proteínas que encierran aire o gases perfluorocarbonados. Las especies de gas encapsuladas en las microesferas tienen baja estabilidad en la sangre y una vida media corta debido a la rápida difusión de los defectos de las microburbujas [4, 5, 6]. Además, debido a que el tamaño de partícula de las microburbujas llenas de gas suele ser grande (aproximadamente de 1 a 8 µm), es difícil que las microburbujas penetren en el entorno del tumor huésped por extravasación de tejido. Por lo tanto, la aplicación actual de burbujas de tamaño micrométrico en imágenes intravasculares es limitada [7]. Los agentes de contraste ecográficos ideales deben presentar generalmente un tamaño óptimo para su transporte a través del espacio vascular tisular, una duración adecuada del efecto acústico, una buena focalización y biocompatibilidad, y una fácil excreción del cuerpo [8, 9]. El concepto de “nanopartículas generadoras de gas” se propuso en una investigación anterior, y tales nanopartículas tienen el potencial para su uso en imágenes de contraste de ultrasonido [10, 11, 12]. Estas nanopartículas generadoras de gas son superiores en rendimiento a las microburbujas llenas de gas actuales, y el gas generado continuamente permite imágenes de ultrasonido intensas. Las nanopartículas generadoras de gas pueden mejorar la permeación y la retención, y pueden circular de manera estable en la sangre y acumularse eficazmente en el tejido tumoral [13, 14].

Sigue siendo un desafío detectar tumores diminutos y ocultos mediante métodos de imagen tradicionales, como la resonancia magnética (RM), la tomografía computarizada (TC) y la ecografía, que están limitados por tiempos de adquisición prolongados, altas dosis de radiación y poca sensibilidad [15 , dieciséis]. Es necesario integrar diferentes métodos de imagen y desarrollar tecnología de imagen multimodal para lograr una sinergia integrada para la detección temprana del cáncer [17, 18, 19]. Óxido de hierro superparamagnético (Fe ₃ O ₄ ) Las nanopartículas se pueden utilizar como agentes de contraste de resonancia magnética negativa en imágenes ponderadas en T2 [20, 21]. Fe ₃ O ₄ tiene propiedades generales atractivas, que incluyen un tamaño de partícula pequeño, una fuerte penetrabilidad, una alta magnetización, un buen metabolismo y una toxicidad relativamente baja [22, 23]. Fe ₃ O ₄ Los agentes de contraste para el diagnóstico por resonancia magnética del cáncer en estadio temprano se han estudiado ampliamente debido a su alta relajación y contraste [24, 25, 26]. Además, las imágenes de fluorescencia en tiempo real tienen una resolución excelente y pueden ser un método valioso para definir la estadificación del tumor, guiar la resección del tumor y monitorear los efectos del tratamiento [27, 28].

En este documento, estas nanopartículas están encapsuladas principalmente por ácido poli (láctico-co-glicólico) (PLGA), que ha sido aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) para su uso como material bioseguro [29, 30]. Las partículas de PLGA se modifican con péptido RGD para permitir la unión a la integrina αvβ3 en la superficie de las células de cáncer de mama y con Cy5.5 como colorante fluorescente para imágenes in vivo, y se encapsulan con Fe ₃ O ₄ para actuar como un agente de contraste T2 negativo en MRI (Esquema 1a). Debido a la glucólisis regulada al alza en el tejido tumoral, que podría producir más ácido láctico y protones en el entorno extracelular, el pH de los tejidos tumorales (6,8–7,2) es más bajo que el de los tejidos normales (pH 7,4) [31,32,33]. . Por lo tanto, diseñamos el carbonato de sodio (Na ₂ CO ₃ ) en el PLGA para producir CO ₂ burbujas en el pH más bajo de los tejidos tumorales para la obtención de imágenes por ultrasonido. Para verificar su prometedora aplicación en la obtención de imágenes de tumores, se caracterizaron sistemáticamente las propiedades integrales de estas nanopartículas multimodo para la obtención de imágenes in vitro, incluida su citotoxicidad, especificidad de focalización y biodistribución en el tejido tumoral, mediante tres modos de obtención de imágenes.

un Diagramas esquemáticos de la función en Fe ₃ O ₄ / Na ₂ CO ₃ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD NP a través de la acumulación dirigida en el tumor y la generación de CO ₂ burbujas en los tejidos ácidos del tumor, seguidas de imágenes de RM / US / FI de triple modalidad del cáncer de mama. b Ilustración esquemática de la preparación del Fe ₃ O ₄ / Na ₂ CO ₃ @ NP PLGA / Cy5.5 / cRGD.

Resultados y discusión

Síntesis y caracterización de Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NP

Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ Los NP de @ PLGA / Cy5.5 / RGD se diseñaron como agentes de contraste multimodo dirigidos a RGD al encapsular un polímero biocompatible de PLGA con Fe ₃ O ₄ y Na ₂ CO ₃ y un agente dirigido a la integrina a través de un enlace químico biodegradable (esquema 1b).

Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión mostraron que el Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ Las NP de @ PLGA / Cy5.5 / RGD eran esferas transparentes con partículas de óxido de hierro uniformemente dispersas visibles en la cáscara (Fig. 1a). El tamaño hidrodinámico medio de las NP se midió como 117,6 nm mediante dispersión dinámica de la luz y el índice de polidispersidad medio fue 0,234 (Fig. 1b). Se confirmó mediante mediciones de potencial zeta que la carga superficial de los NP era de - 21,7 mV (Fig. 1c). La medición del espectro de fluorescencia reveló que el Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD tenía la longitud de onda de emisión máxima a 685 nm, lo que indica que Cy5.5 se encapsuló con éxito en el núcleo de PLGA (Fig. 1d). Los valores de magnetización de saturación para Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD y Fe ₃ gratis O ₄ Los NP fueron iguales a 32,6 y 42,5 emu / g, respectivamente (Fig. 1e). Estos hallazgos indicaron la característica superparamagnética de las nanopartículas a temperatura ambiente. El espectro FITR de Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD mostró que la vibración de estiramiento N-H y el pico de absorción de –OH aparecieron alrededor de 3432 cm ⁻¹ . Además, encontramos una mejora (1628 cm ⁻¹ ) de la vibración de estiramiento C =O. En comparación con el de los NP no objetivo, el pico característico (el carboxilo) a 1735 cm ⁻¹ de los NP objetivo se redujo significativamente. Los resultados mostraron la unión entre el grupo carboxilo en la superficie de la microesfera y el grupo amino en el péptido RGD. Unión in vitro de Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NP se muestra en la Fig. 1f.

Imágenes TEM ( a ) Distribuciones de tamaño ( b ) Potencial Zeta ( c ) de Fe ₃ O ₄ / Na ₂ CO ₃ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD NPs. d Espectro de emisión de fluorescencia de Fe ₃ O ₄ / Na ₂ CO ₃ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD y Fe ₃ O ₄ / Na ₂ CO ₃ @ NP PLGA / cRGD. e Curvas de histéresis magnética de Fe ₃ O ₄ / Na ₂ CO ₃ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD NP y Fe ₃ O ₄ NP. f El FTIR de los espectros de Fe ₃ objetivo O ₄ / Na ₂ CO ₃ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD y NP PLGA no dirigidas

Unión in vitro de Na2CO3/Fe3O4@PLGA/Cy5.5/RGD NP

La integrina αvβ3 generalmente se expresa altamente en las células endoteliales tumorales del cáncer de mama y puede promover la metástasis tumoral [33,34,35,36]. La inmunofluorescencia celular para la expresión de la integrina αv en las células MDA-MB-231 fue mucho mayor que en las células MCF-7; Las células A549 sirvieron como controles positivos (Fig. 2a). La captación celular de NP fue estudiada por CLSM (Fig. 2b). El Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ Las NP de @ PLGA / Cy5.5 / RGD mostraron una tasa de unión mucho más alta a las células MD-MB-231 que las NP no dirigidas. Las imágenes de fluorescencia también revelaron que Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ Las NP de @ PLGA / Cy5.5 / RGD se unieron al citoplasma celular y las imágenes fusionadas mostraron las mismas ubicaciones que la expresión de la integrina αv [37, 38].

un Imágenes de fluorescencia confocal con expresión de integrina αv en células MB231, A549 y Mcf-7. El azul y el verde representan fluorescencia DAPI y αv, respectivamente. b Imágenes de fluorescencia confocal de células MB231 incubadas con Fe ₃ dirigido O ₄ / Na ₂ CO ₃ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD NP y NP no objetivo. Azul, rojo y verde representan fluorescencia DAPI, Cy5.5 y α v, respectivamente. c Viabilidad relativa de las células MB231 incubadas con diferentes concentraciones de Fe ₃ O ₄ / Na ₂ CO ₃ @ NP PLGA / Cy5.5 / cRGD

Ensayo de citotoxicidad

La citotoxicidad in vitro del Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ Las NP de @ PLGA / Cy5.5 / RGD se estimaron en células MDA-MB-231 usando un ensayo CCK8, mientras que las células A549 y MCF-7 tratadas con NP se usaron como controles (Fig. 2c). En el rango de concentraciones de Fe de 5-80 μg / mL, la viabilidad celular de las células A549 y MB231 no se redujo significativamente, y ambas estaban por encima del 70%. Por el contrario, las células MCF-7 mostraron una disminución significativa en la viabilidad celular de aproximadamente el 50% a concentraciones de Fe superiores a 40 μg / ml. Los resultados de CCK8 demostraron que Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ Los NP de @ PLGA / Cy5.5 / RGD mostraron una citotoxicidad significativamente menor en las células MDA-MB-231 en un rango de concentración determinado.

Imágenes de contraste in vitro

Usamos un maniquí de gel de agar para estudiar el rendimiento del Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NP in vitro a diferentes valores de pH (Fig. 3a). Las imágenes de contraste de ultrasonido de Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ Los NP de @ PLGA / Cy5.5 / RGD mejoraron significativamente a un pH débilmente ácido (pH 6,8) en comparación con pH 7,2, probablemente porque el pH 7,2 no produce suficiente CO ₂ burbujas para imágenes de ultrasonido. Por el contrario, cuando las NP se encontraban en un entorno débilmente ácido, se podían generar suficientes burbujas para la obtención de imágenes por ultrasonido. Esta característica es relevante para los tumores, que exhiben una alta heterogeneidad tisular y diversos niveles de pH (pH 6,8-7,2) in vivo [32, 39, 40]. Luego se analizó la intensidad de la señal de la imagen de ultrasonido (Fig. 3b). Las relaciones de intensidad de la señal de los grupos NP no objetivo (pH =7), NP no objetivo (PH =5), NP objetivo (PH =7) y NP objetivo (PH =5) en relación con la intensidad de la señal del el grupo en blanco fueron 112%, 145%, 167% y 178 ± 4%, respectivamente, lo que indica claramente que el grupo NP objetivo (PH =5) tenía la señal de EE. UU. más fuerte.

un Imágenes ultrasónicas de NP objetivo y NP no objetivo registradas a diferentes valores de pH (7,2 y 6,8), PBS como control. b La tasa de intensidad de la señal se calcula por muestra / blanco, la muestra representa la intensidad del eco de los NP objetivo y no objetivo, y el blanco representa la intensidad del eco de PBS. c Imágenes de RM ponderadas en T2 de Fe ₃ O ₄ / Na ₂ CO ₃ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD NPs con diferentes concentraciones de Fe (0.0625, 0.125, 0.25, 0.5 y 1 mM). d Las relatividades transversales (r2) fueron 19,597 mM ⁻¹ s ⁻¹ para Fe ₃ O ₄ / Na ₂ CO ₃ @ NP PLGA / Cy5.5 / cRGD

Para el estudio de resonancia magnética in vitro, como la concentración de Fe en el Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD aumentaron los NP, la intensidad de la señal ponderada en T2 mostró una disminución significativa, lo que indica la posibilidad de que estos NP se utilicen como agentes de contraste de RM T2 (Fig. 3c). La tasa de relajación transversal (r2) de Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ Se calculó que los NP de @ PLGA / Cy5.5 / RGD eran 19.597 mM ⁻¹ s ⁻¹ . Aunque la tasa de relajación transversal (r2) de Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs es más bajo que el de muchos otros agentes superparamagnéticos de MRI, la composición de Fe ₃ O ₄ puede aumentar el r2, que era 2,94 veces mayor que el r2 de las partículas de SPIO utilizadas clínicamente.

Imagen de contraste de ultrasonido de Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NP

Para demostrar el potencial del Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NP para imágenes de ultrasonido en tumores, administramos una inyección de Na ₂ en la vena de la cola CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NP a ratones desnudos de xenoinjerto de cáncer de mama y monitorizó las imágenes de ultrasonido en función del tiempo (Fig. 4a). Antes de la inyección, se registraron imágenes del tumor, el hígado y el área subcutánea. Inmediatamente después de la inyección, el área de los tejidos tumorales no mostró ninguna mejora de contraste. Se observó realce del área del tumor comenzando 30 min después de la inyección y duró 90 min. Los resultados de la ecografía in vivo mostraron que el Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ Los NP de @ PLGA / Cy5.5 / RGD generaron suficientes burbujas en los tejidos tumorales ácidos para producir una reflectividad ecogénica para la obtención de imágenes por ultrasonido. Como control, también obtuvimos imágenes del hígado y los tejidos subcutáneos en diferentes momentos después de la inyección de los NP objetivo. Durante todo el período de observación, no se encontró ninguna mejora significativa en el área de inyección subcutánea, y la mejora en el hígado, que disminuyó con el tiempo, fue significativamente menor que la de los tumores (Fig. 4b). Este resultado indica que Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD Los NP que circulan en el cuerpo a pH fisiológico no producen una cantidad sustancial de CO ₂ burbujas para mejorar el contraste del ultrasonido.

un Imágenes de ultrasonido in vivo de tumores, hígados y áreas subcutáneas en diferentes momentos después de la inyección de Fe ₃ O ₄ / Na ₂ CO ₃ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD NPs. b La tasa de intensidad del eco en función del tiempo se calcula por tejido / blanco, el tejido representa la intensidad del eco del tumor, el hígado o el área subcutánea, el blanco representa la intensidad del eco antes de la inyección

Resonancia magnética de Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NP

Para la resonancia magnética in vivo, para demostrar que los NP se pueden usar para obtener imágenes específicas de tumores, Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ Se inyectaron NP de @ PLGA / Cy5.5 / RGD directamente en tumores y músculos. Los resultados mostraron que el área tumoral exhibió una disminución significativa en el contraste T2-MR después de la inyección de los NP diana, y la intensidad de la señal disminuyó significativamente de 8875 a los 0 min a 5972 a los 120 min después de la inyección (Fig. 5a, b). Sin embargo, con la misma cantidad de nanopartículas inyectadas, el área del músculo subcutáneo mostró una disminución de la señal de T2 mucho menor. Este hallazgo demuestra la eficacia de Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs con agentes de contraste T2-MR hipersensibles dirigidos a integrinas para su uso en imágenes dirigidas a tumores. En el grupo de inyección en la vena de la cola, las imágenes de T2-MR también mostraron una disminución obvia del contraste en el tumor a las 24 h posteriores a la inyección, lo que demuestra la alta acumulación tumoral de Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs (Fig. 5c, d). Además, se observaron señales de T2 disminuidas en el hígado y los riñones, lo que indica que los iones de hierro en las NP podrían eliminarse rápidamente del cuerpo. Por lo tanto, la resonancia magnética reveló que el Fe ₃ envuelto en PLGA O ₄ Las nanopartículas exhibieron un direccionamiento tumoral pasivo eficiente a través del efecto de permeabilidad y retención mejoradas (EPR), especialmente el direccionamiento mediado por RGD, pero podrían descomponerse y excretarse rápidamente in vivo.

un Imágenes de RM-T2 in vivo de tejidos subcutáneos normales y tumorales antes y después de la inyección de Fe ₃ O ₄ / Na ₂ CO ₃ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD NPs. b Intensidad de señal promedio en músculo y tumor para inyección de Fe ₃ O ₄ / Na ₂ CO ₃ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD NPs. c Imágenes de T2-MR en axiales y coronales de ratones portadores de tumores MDA-MB-231 antes y después de la inyección intravenosa de Fe ₃ O ₄ / Na ₂ CO ₃ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD NPs. d La relación de intensidad de la señal se calcula por tejido / músculo, el tejido representa la intensidad de la señal del tumor, el hígado y el riñón antes y después de la inyección de los NP objetivo, el músculo representa la intensidad de la señal del músculo al mismo tiempo

Imágenes e histología de fluorescencia

Se inyectaron por vía intravenosa 200 microlitros de NP en ratones para obtener imágenes de fluorescencia in vivo. En el grupo inyectado con NP dirigidas a RGD, la señal de fluorescencia de Cy5.5 aumentó gradualmente en el área del tumor y alcanzó un pico 4 h después de la inyección, lo que indica que Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ Los NP de @ PLGA / Cy5.5 / RGD pueden acumularse eficazmente en el tumor. En el grupo no dirigido, los NP se distribuyeron por todo el cuerpo después de la inyección y se aclararon rápidamente, y no se acumularon en el tumor durante un largo período de tiempo (Fig. 6a). A continuación, se diseccionaron los ratones y se recogieron los órganos principales y los tumores para obtener imágenes de fluorescencia in vitro, que revelaron una alta captación tumoral de las NP diana (Fig. 6b, c). La intensidad de fluorescencia de Cy5.5 en los tumores de ratones inyectados con NP dirigidas fue 1,5 veces mayor que en ratones inyectados con NP no objetivo.

un Imágenes de fluorescencia de fluorescencia in vivo de animales a las 0, 0.5, 1, 2 y 3 h después de la inyección después de la inyección de NP dirigidas y no dirigidas. b Imágenes de fluorescencia ex vivo de tumores y órganos principales (hígado, bazo, pulmón, corazón y riñón) recogidas de animales. c Intensidad de fluorescencia promedio de varios órganos y tumores

Además, el direccionamiento específico del tumor de Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ Las NP de @ PLGA / Cy5.5 / RGD se verificaron mediante formación de imágenes de fluorescencia de tejido de secciones de tumor congeladas (Fig. 7a). La tinción por inmunofluorescencia de secciones tumorales con anticuerpos contra las integrinas αv y β3 reveló una expresión significativa de la integrina αvβ3 en los tejidos tumorales. La fluorescencia de las integrinas αv y β3 se fusionó con la fluorescencia Cy5.5 de Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs para obtener una imagen de inmunotinción que revele la colocalización. Los resultados de inmunofluorescencia en los tejidos tumorales indicaron que el Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ Las NP de @ PLGA / Cy5.5 / RGD se unen específicamente a la integrina αvβ3 en el cáncer de mama maligno MB231. Además, la tinción H&E de Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ Las NP de @ PLGA / Cy5.5 / RGD en comparación con el grupo no dirigido mostraron que todas las secciones de tejido de órganos tenían una morfología patológica normal y ninguna respuesta al daño histopatológico (Fig. 7b). Todos los resultados de la citotoxicidad y el análisis histológico anteriores indicaron que el Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ Los NP de @ PLGA / Cy5.5 / RGD no indujeron toxicidad significativa en los tejidos de los órganos principales in vivo, y su buena biocompatibilidad se puede atribuir razonablemente a PLGA.

un Imágenes fluorescentes de secciones congeladas de tumores MDA-MB-231 de ratones inyectados con NP dirigidas y no dirigidas. Verde, rojo, violeta y azul representan fluorescencia αv, β3, Cy5.5 y DAPI, respectivamente. b Cortes tumorales teñidos con H &E recolectados de ratones después de la inyección de NP dirigidas y no dirigidas

Conclusiones

En conclusión, los resultados anteriores demuestran un enfoque creativo y exitoso para la resonancia magnética del cáncer de mama a través de una focalización magnética y un sistema de generación de gas que se activa en el microambiente del tumor. Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ Los NP de @ PLGA / Cy5.5 / RGD exhiben un rendimiento de imagen excelente y una buena biocompatibilidad en los modos de imagen por resonancia magnética / ultrasonido / fluorescente. Nuestro trabajo muestra el gran potencial para el diagnóstico de tumores con imágenes multimodales mejoradas.

Materiales y métodos

Materiales

Se adquirieron poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) (lactida:glicólido =75:25, Mw =20.000), colorante Cyanine5.5 y alcohol polivinílico (PVA) de Sigma-Aldrich Company (Shanghai, China). El péptido RGD fue sintetizado a medida por GenicBio BioTech Co. Ltd. (Shanghai, China). Fe ₃ O ₄ nanopartículas y carbonato de sodio (Na ₂ CO ₃ ) se adquirieron de Xian Ruixi Biological Technology Co. Ltd. (Henan, China). Diclorometano (CH ₂ Cl ₂ ) y dimetilsulfóxido (DMSO) se obtuvieron de Solarbio Company (Beijing, China). Todos los productos químicos eran de calidad analítica.

Síntesis de nanopartículas Fe3O4/Na2CO3@PLGA/Cy5.5/cRGD

Primero, se mezclaron 12,5 mg de PLGA y 0,25 ml de cloroformo. Luego, 5 μL de Cy5.5, 15 μL de nanopartículas magnéticas modificadas con ácido oleico dispersas en cloroformo (OA @ Fe ₃ O ₄ , 10 mg / mL), 5 μL de carbonato de sodio (Na ₂ CO ₃ ) y se añadieron en secuencia 1,5 ml de solución de PVA al 1% y se emulsionaron con un procesador ultrasónico durante 2 min. Luego, se agregaron 12.5 mL de solución de PVA al 0.3% y se agitó durante 3-4 ha temperatura ambiente, y se agregaron 12.5 mL de solución de PVA al 0.4% para agitar (500 rpm / min) durante la noche para eliminar el solvente orgánico residual. La solución anterior se sometió a varios lavados de ultrafiltración con ddH ₂ O y luego se diluyó con tampón PB (pH =7,4) hasta un volumen final de 1,25 mL. A continuación, se añadieron 0,25 mg de EDC y 1,25 mg de NHS a la solución mixta anterior. La mezcla se agitó durante 30 min a 25ºC y luego, se lavó tres veces con ultrafiltración y se resuspendió en solución tampón PB (pH =7,4). A continuación, se añadieron 1,25 mg de cRGD a la solución y se agitó a 4ºC durante la noche. Para eliminar EDC, NHS y cualquier cRGD residual, la solución transparente se filtró mediante un tubo de ultrafiltración. Finalmente, Fe ₃ O ₄ / Na ₂ CO ₃ Los NP de @ PLGA / Cy5.5 / cRGD se resuspendieron en 1,25 ml de agua desionizada y se almacenaron a 4 ° C.

Caracterización de nanopartículas

Los diámetros dinámicos y el potencial zeta de las nanopartículas se midieron con un Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, Reino Unido). La morfología de las nanopartículas se obtuvo utilizando un microscopio electrónico de transmisión FEI Tecnai F20. La carga de Cy5.5 se registró mediante un espectrómetro de fluorescencia Hitachi F-7000. La FTIR se realizó usando un espectrómetro infrarrojo de transformada de Fourier (Alpha II, Bruker, Suiza). Se aplicó un magnetómetro de muestra vibrante (VSM, Lake Shore 7410) para determinar la curva de histéresis de las nanopartículas y el Fe ₃ libre O ₄ .

Células y animales

Las células MDA-MB-231 de cáncer de mama humano fueron amablemente proporcionadas por el Banco de Células Madre de la Academia de Ciencias de China. Las células se mantuvieron a 37 ° C en 95% de aire y 5% de CO ₂ . Se adquirieron ratones hembra BALB / c (4 semanas) de Shanghai Slaccas Laboratory Animal Co. Ltd. y se mantuvieron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad Médica de Guangxi. Los experimentos con animales fueron seguidos con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio, publicada por el Comité de Ética Animal del Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad Médica de Guangxi. Se trasplantaron células de cáncer de mama MDA-MB-231 en el flanco derecho de ratones BALB / c (2 × 106 en 200 μl de células por ratón) y se dejaron crecer durante 10 a 14 días (diámetro medio de 5 mm) antes de la obtención de imágenes.

Expresión celular de la integrina αv

Se llevó a cabo inmunofluorescencia celular para confirmar la alta expresión de integrina αv en células MDA-MB-231. Se utilizaron células A549 y MCF-7 como controles. Las células se sembraron en placas de cultivo con fondo de vidrio de 35 mm (MatTek, EE. UU.) A 2 × 10 ⁴ células mL ⁻¹ durante 24 h. Después de la incubación, las células se fijaron durante 20 min a temperatura ambiente con paraformaldehído al 4%. Luego, se incubaron con anticuerpo monoclonal anti-integrina αv de conejo (ab179475, Abcam) a 4 ° C durante la noche y anticuerpo anti-IgG de conejo durante 1 ha temperatura ambiente. Finalmente, las células se tiñeron con DAPI. Las imágenes se adquirieron mediante microscopía de barrido láser confocal (TCS SP8, Leica, Alemania).

Para evaluar la eficacia de focalización de las nanopartículas, se realizó un estudio de captación celular utilizando microscopía de barrido láser confocal (CLSM). Las células se sembraron en placas de cultivo con fondo de vidrio de 35 mm (MatTek, EE. UU.) A 2 × 10 ⁴ células mL ⁻¹ durante 24 h. Luego, las células se incubaron con NP dirigidas a RGD (30 μg mL ⁻¹ , 0,5 ml) a pH 7,4 durante 2 h, y se utilizaron NP no dirigidas como controles. Después de la incubación, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 20 min y luego se incubaron con anticuerpo αv. Mediante colocalización, verificamos la unión dirigida de las nanopartículas a la integrina en las células.

Ensayo CCK8

La biocompatibilidad de Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ Las nanopartículas de @ PLGA / Cy5.5 / RGD se evaluaron mediante un estudio de citotoxicidad. Se sembraron células MDA-MB-231, A549 y MCF-7 en placas de 96 pocillos a 5 × 10 ³ células mL ⁻¹ durante 24 h. Luego, 0.1 mL de Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ Se añadió a cada pocillo una suspensión de PLGA / Cy5.5 / RGD NP a concentraciones de Fe de 5, 10, 20, 40 y 80 μg / ml y se incubó durante 24 h. Finalmente, se agregaron 10 μL de solución de CCK8 y la suspensión se incubó durante 1 h más. Los resultados se determinaron mediante un lector de microplacas (Thermo Scientific, EE. UU.) A 450 nm.

Imágenes por ultrasonido con contraste mejorado

La formación de imágenes por ultrasonido de nanopartículas se realizó utilizando un sistema de ultrasonido Vevo 2100 (Fujifilm Visual Sonics Inc., Canadá). Las NP dirigidas y no dirigidas a RGD se agregaron al modelo de agarosa y se usó PBS como control. Las imágenes se registraron en modo B y modo CEUS con diferentes tampones de pH de 7,2 y 6,8. Se dibujó el área de interés y se midió el valor medio de gris en imágenes en modo B.

Para la obtención de imágenes por ultrasonido in vivo, los ratones se anestesiaron con isoflurano al 2% (Hebei Yipin Pharmaceutical Co., Ltd., China) y la temperatura corporal se mantuvo a 37 ° C con una almohadilla térmica. Se inyectó un total de 200 μL de NP dirigidas a RGD a través de la vena de la cola. Los animales de control recibieron una inyección subcutánea con la misma cantidad de NP. Las imágenes ultrasónicas se registraron utilizando un transductor de 7 MHz para adquirir continuamente imágenes ecográficas de los tumores, hígados y áreas subcutáneas. La zona de enfoque acústico se colocó en el centro del tumor con la sección transversal más grande y se obtuvo un campo de visión que contenía el tumor y su tejido adyacente.

Imágenes por resonancia magnética

Exámenes de resonancia magnética de Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ Las NP de @ PLGA / Cy5.5 / RGD se realizaron utilizando un 3.0 T MR (GE Healthcare, EE. UU.) Y una bobina animal (RF TECH LIMITED, China). Se escanearon NP con diferentes concentraciones de Fe de 0,031, 0,063, 0,125, 0,25, 0,5 y 1 mM en tubos Eppendorf de 1 ml y se utilizó PBS como control. Se realizó RM T2 para cada tubo utilizando una secuencia FSE ponderada en T2 (grosor de corte de 3 mm, TR / TE 2000 / 74,4 ms, FOV de 8 × 8 cm y matriz de 320 × 256). Las relaxividades (r2) se calcularon mediante un ajuste lineal del tiempo de relajación inverso en función de la concentración de Fe.

Para la resonancia magnética in vivo, los ratones se dividieron aleatoriamente en dos grupos ( n =3) para la exploración por RM que recibió (1) inyección local de Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NP dentro de músculos subcutáneos y tejidos tumorales o (2) inyección de Na ₂ en la vena de la cola CO ₃ / Fe ₃ O ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NP. Se tomaron imágenes de referencia de los ratones antes de la inyección de las nanopartículas. Para el grupo uno, se inyectó la misma cantidad de NP en los tejidos subcutáneos y tumorales, y se realizó una exploración por resonancia magnética cada 30 minutos para registrar la transición de señal de los tejidos. Para el grupo dos, las imágenes del tumor se realizaron en las posiciones axial y coronal, y los parámetros de RM fueron los mismos que los utilizados para las imágenes in vitro. Se midió la intensidad de la señal (SI) en la región de interés (ROI) y se comparó con las señales del tejido en diferentes momentos antes y después de la inyección.

Imágenes de fluorescencia tumoral

Para obtener imágenes de fluorescencia in vivo, se utilizó un sistema de imágenes de fluorescencia in vivo (FX PRO, Bruker, Suiza) para escanear, y los ratones se dividieron al azar en dos grupos ( n =3):(1) PN dirigidos a RGD y (2) PN no dirigidos. Las imágenes se capturaron cada 30 minutos durante un período de 4 h después de la inyección. Posteriormente, se recolectaron y tomaron imágenes de importantes órganos y tumores, y se observó la distribución de fluorescencia en los órganos del cuerpo. El análisis cuantitativo de la intensidad de la fluorescencia se realizó utilizando un software de imágenes moleculares (Bruker, Suiza). Estos órganos importantes luego se sometieron a tinción H&E para evaluar la toxicidad del tejido. Las secciones de tumor congeladas también se sometieron a inmunotinción por fluorescencia con anticuerpos contra la integrina αv y la integrina β3.