Uso de nanopartículas de Au altamente biocompatibles @ PEG como un nuevo agente de contraste para la obtención de imágenes de tomografía computarizada in vivo

Métodos

Todos los protocolos experimentales, incluidos los detalles relevantes, fueron aprobados por el Comité de Ética Regional de la Universidad Médica de Jinzhou en la provincia de Liaoning, China.

Materiales e instrumentos

Los kits de prueba LDH y ROS se adquirieron del Instituto de Bioingeniería de Nanjing, China, y los kits de tinción Calcein-AM / PI de Shanghai Dongren Chemical Technology Co., Ltd., China. Se adquirieron otros agentes químicos y disolventes de Sigma-Aldrich. Todas las secciones se evaluaron utilizando un microscopio de fluorescencia (DMI4000B, Leica, Wetzlar, Alemania). Las características de las nanopartículas sintetizadas se evaluaron con un microscopio electrónico de transmisión (TEM). Se utilizó una tomografía computarizada en espiral de 256 filas y 512 cortes (Philips, Alemania) y los parámetros de imagen fueron los siguientes:grosor de corte, 0,625 mm; voltaje del tubo, 100 Kvp; y corriente de tubo, 100 mA.

Síntesis de AuNC @ PEG

Se prepararon nanocajas de Au mediante una simple reacción de sustitución galvánica entre nanocubos de Ag y HAuCl ₄ solución, según un estudio anterior [29, 30]. Normalmente, se prepararon nanocubos de Ag de 25 nm en dietilenglicol y se utilizaron como plantillas para la síntesis de nanocajas de Au de 30 nm. Luego, se añadió SH-PEG (PM 2000, 10 mg disueltos en 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS)) a la solución de AuNC (pH 8,0, 6,55 nM, 6 ml) y se agitó durante la noche en la oscuridad bajo nitrógeno. proteccion. Después de lavar los AuNC @ PEG tres veces más, se dispersaron en una solución acuosa.

Evaluación de la toxicidad in vitro

En este estudio, se utilizaron colorimetría MTT, método de fuga de LDH, ensayo de concentración de ROS intracelular y tinción con Calceína-AM / PI para detectar la toxicidad de los AuNC @ PEG sintetizados in vitro. Las células HUVEC se inocularon en placas de 96 pocillos con una densidad de 1 × 10 ⁴ /bien. Se utilizó el medio RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% y penicilina (100 μg / mL) y estreptomicina. Luego, las células se cultivaron a 37 ° C y en una incubadora de dióxido de carbono al 5% durante 12 h. Luego, se agregó el medio con AuNC @ PEG a diferentes concentraciones (10, 20, 50, 100, 200, 500 y 1000 μg / mL) para cultivo adicional. Después de 24 h, se obtuvo el ensayo MTT. El medio de cultivo sin nanopartículas se utilizó como control en cada grupo.

Luego, se determinó el contenido de lactato deshidrogenasa (LDH) liberada de las células HUVEC tratadas con AuNC @ PEG a diferentes concentraciones para evaluar la toxicidad in vitro. Las células se inocularon de forma similar a MTT y luego se trataron con AuNC @ PEG a diferentes concentraciones (10, 20, 50, 100, 200, 500 y 1000 μg / ml) durante 24 h. Luego, el sobrenadante se separó, se centrifugó y se transfirió a una placa limpia de 96 pocillos. La actividad de LDH en el medio de cultivo se evaluó de acuerdo con las instrucciones del fabricante y la absorbancia se determinó utilizando un instrumento de etiquetado enzimático (450 nm).

Basado en el principio de medir la concentración de ROS intracelular usando el kit ROS, DCFH se oxidó a diclorofluoresceína (DCF), que es una sustancia fluorescente verde fuerte DCF, en presencia de 2 ', 7'-diclorofluoresceína (DCFH-DA). Las células HUVEC se cultivaron en placas de 24 pocillos durante 12 h, se trataron con AuNC @ PEG a diferentes concentraciones (50, 100, 200 y 500 μg / mL) durante 24 h, y se incubaron con DCFH-DA a 37 ° C durante 40 min. Las células tratadas con peróxido de hidrógeno (H ₂ O ₂ ) se utilizaron como control positivo. La intensidad de fluorescencia de las células se observó utilizando un microscopio de fluorescencia (λex, 485 nm; λem, 525 nm). Antes de la evaluación, se utilizó un medio sin suero y sin hielo tres veces para el lavado.

Para la tinción viva / muerta, las células HUVEC se inocularon en placas de 24 pocillos y se cultivaron durante 12 h. Luego, las células se trataron con AuNC @ PEG a diferentes concentraciones (10, 20, 50, 100, 200, 500 y 1000 μg / mL) durante 24 h. Después de la digestión con tripsina-EDTA mediante centrifugación, las células se lavaron con PBS (pH =7,4); luego, la suspensión celular preparada se mezcló con el reactivo Calceína-AM / PI preconfigurado y se cultivó a 37ºC durante 15 min. Para detectar la toxicidad de AuNC @ PEG, se evaluó el número de células muertas mediante microscopía de fluorescencia.

Modelo animal

Todos los procedimientos de experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los criterios establecidos por el Comité de Uso y Protección Animal de la Universidad Médica de Jinzhou. Después del experimento, los animales fueron sacrificados de acuerdo con principios humanitarios. En este estudio, se utilizaron ratas Sprague Dawley adultas que pesaban 250-300 g (compradas en el Centro Animal de la Universidad Médica de Jinzhou). En este experimento, todos los animales se dividieron aleatoriamente en grupos. Se administró una solución de hidrato de cloral (10% en peso) a través de la cavidad abdominal; luego, todos los materiales se inyectaron a través de la vena de la cola.

Imágenes de tomografía computarizada in vitro e in vivo

Para la obtención de imágenes de tomografía computarizada in vitro, se colocaron AuNC @ PEG a diferentes concentraciones y soluciones de yodo en tubos de EP y se dispusieron en el orden correcto, y se realizó una tomografía computarizada de adelante hacia atrás. En la tomografía computarizada in vivo, después de administrar la anestesia, se escaneó a los animales de la cabeza a la cola, con el centro de la cavidad abdominal como punto de referencia. La posición de los animales no cambiaba todo el tiempo. Todos los datos originales (imagen de 0,625 mm) se transmitieron a la estación de trabajo de Philips para su análisis mediante tomografía computarizada.

Evaluación de la toxicidad in vivo

El análisis hematológico se realizó utilizando la técnica estándar de extracción de sangre en la vena safena. Los tejidos del corazón, hígado, bazo, pulmón y riñón de las ratas se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 48 horas y se incluyeron en parafina después de la deshidratación. La sección de parafina tenía un grosor de 5 µm y se montó en un portaobjetos de vidrio. Luego se realizó la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) y el análisis se realizó bajo un microscopio.

Análisis estadístico

Los datos se analizaron mediante un análisis de varianza unidireccional y P valor se utilizó como índice. A P valor <0.05 se consideró estadísticamente significativo, expresado por el valor promedio de SD.

Resultados y discusión

Síntesis y caracterización de las AuNC @ PEG

La funcionalización de la superficie y el control del tamaño son dos factores clave para el desarrollo de un agente de nanocontraste de alto rendimiento [ 15]. La estructura y los caracteres de AuNC @ PEG se determinaron mediante TEM y DLS. La Fig. 1a mostró los resultados de que el tamaño de AuNC @ PEGs era de alrededor de 40 nm con alta uniformidad; Mientras tanto, el radio de hidratación de AuNC @ PEG también se utilizó para probar la dispersión en la solución, como se muestra en la Fig.1b, el radio de hidratación de AuNC @ PEG fue de aproximadamente 50 nm, lo que muestra que los AuNC @ PEG eran muy estables sin ninguna agregación. . Los AuNC @ PEG tienen un tamaño más pequeño y una inercia biológica relativamente buena, que son mejores para aplicaciones de nanomedicina. Además, la estructura de la jaula hueca indica grandes áreas de superficie específicas internas y externas y una mejor capacidad de obtención de imágenes de tomografía computarizada, y las paredes metálicas circundantes brindan protección adicional para las cargas útiles durante su procesamiento, transporte y almacenamiento. Con su estructura obvia de núcleo-caparazón, el exterior estaba cubierto con PEG de aplicabilidad biológica, que puede mejorar efectivamente la biocompatibilidad y escapar de la captura de macrófagos.

Imágenes TEM de AuNC @ PEG ( a ) y DLS de AuNC @ PEGs ( b )

Seguridad y estabilidad de AuNC @ PEGs in vitro

Antes de usar AuNC @ PEG para imágenes in vivo, evaluamos su seguridad y estabilidad. El efecto de AuNC @ PEG sobre la viabilidad de las células HUVEC se detectó usando el ensayo MTT (Fig. 2a). Las células se trataron con AuNC @ PEG a diferentes concentraciones (10, 20, 50, 100, 200, 500 y 1000 μg / mL) durante 24 h. Los resultados del ensayo MTT mostraron que la tasa de supervivencia celular de AuNC @ PEG fue similar a la del grupo de control y tuvo una biocompatibilidad favorable cuando la concentración de AuNC @ PEG alcanzó 200 μg / mL. La tasa de supervivencia celular a una concentración de 1000 μg / ml todavía era> 75%.

Evaluación MTT de la viabilidad de células HUVEC cultivadas con diferentes concentraciones de AuNC @ PEG durante 24 h ( a ). Evaluación de la lactato deshidrogenasa en el sobrenadante inducida por AuNC @ PEG con LDH ( b ). Examen de imágenes de fluorescencia de 24 h de células cultivadas con AuNC @ PEG a diferentes concentraciones (H ₂ O ₂ (I), 0 μg / mL (II), 50 μg / mL (III), 100 μg / mL (IV), 200 μg / mL (V) y 500 μg / mL (VI)) por el método ROS ( c ). * P <0.05, *** P <0,001. Las barras de escala son de 100 μm

Además, el ensayo de LDH también se utilizó para evaluar la biocompatibilidad de AuNC @ PEG in vitro. En las células normales, no se permite que la LDH atraviese la membrana celular. Cuando se daña la membrana celular, la LDH se libera a través de la membrana celular [ 31]. Por tanto, evaluamos la seguridad de AuNC @ PEG midiendo el contenido de LDH en el sobrenadante celular (Fig. 2b) mediante el tratamiento de células con AuNC @ PEG a diferentes concentraciones durante 24 h. Los resultados mostraron que el nivel de LDH liberado por las células aumentó ligeramente en comparación con las células de control no expuestas cuando la concentración de AuNC @ PEG fue <200 μg / mL, y fue significativamente más baja que la del grupo de control positivo (H ₂ O ₂ ), que fue consistente con los resultados del ensayo MTT, y se encontró que 200 μg / mL de AuNC @ PEG como concentración óptima tienen una buena citocompatibilidad.

Además, se realizaron pruebas de estrés oxidativo y evaluación de la tinción por inmunofluorescencia de células vivas / muertas (Calceína-AM / PI) para detectar la toxicidad de AuNC @ PEG in vitro. El estrés oxidativo es una condición dañina para todos los sistemas de vida, y el exceso de especies reactivas de oxígeno (ROS) puede causar estrés oxidativo [32, 33]. Por lo tanto, medimos el nivel de ROS en las células. Después de 24 h de inducción por AuNC @ PEG a diferentes concentraciones, la intensidad de fluorescencia verde de las células inducidas a una concentración de 50-200 μg / mL no difirió significativamente de la del grupo de control, y fue significativamente menor que la de el grupo de control positivo (Fig. 2c). La intensidad de la fluorescencia fue proporcional al nivel de ROS. Como se muestra en la Fig. 3, la tasa de supervivencia de las células HUVEC a una concentración de 0-200 μg / mL fue> 90% (Fig. 3a-f). Los resultados mencionados anteriormente validaron que los AuNC @ PEG a una concentración de 200 μg / ml son estables y tienen una buena compatibilidad celular, y pueden ser agentes de contraste clínicos prometedores.

Imágenes de microscopía de fluorescencia de tinciones vivas y muertas. Tasa de supervivencia de las células HUVEC tratadas con AuNC @ PEG a diferentes concentraciones (0 μg / mL ( a ), 10 μg / ml ( b ), 20 μg / ml ( c ), 50 μg / ml ( d ), 100 μg / ml ( e ), 200 μg / ml ( f ), 500 μg / ml ( g ) y 1000 μg / ml ( h )) durante 24 h. La fluorescencia verde representa células vivas y la fluorescencia roja representa células muertas. Las barras de escala son 100 μm

Imagen de tomografía computarizada in vitro y determinación del valor de CT

Para evaluar la viabilidad de las AuNC @ PEG en las imágenes de tomografía computarizada, comparamos las mejoras de contraste de diferentes concentraciones molares (AuNC @ PEG) con el uso clínico de un agente de contraste (yodo). Se obtuvieron imágenes de TC y se midieron los valores de TC. Los AuNC @ PEG se compararon con agentes de formación de imágenes de yodo en concentraciones similares (50, 100, 200, 500 y 1000 μg / ml). Los resultados mostraron que el valor de CT se mejoró con el aumento de la concentración (Fig. 4a), y de acuerdo con el análisis de los valores de CT de AuNC @ PEG y el agente de contraste de yodo (Fig. 4b), el coeficiente de absorción de AuNC @ PEG fue mejor que el de los agentes de contraste a base de yodo en concentraciones similares, lo que indica que el uso de AuNC @ PEG para imágenes de tomografía computarizada es mejor.

Comparación de los resultados de la tomografía computarizada in vitro entre AuNC @ PEG y agente de contraste a base de yodo. A medida que aumenta la concentración, aumenta la intensidad de la atenuación de los rayos X ( a ). Comparación de los valores de Hu entre AuNC @ PEG y agentes de contraste a base de yodo ( b ). *** P <0,001

Imágenes de tomografía computarizada en vivo

Debido a la capacidad de alto contraste de los AuNC @ PEG, comparamos además la calidad de imagen de los AuNC @ PEG con la de los agentes de yodo in vivo. Se inyectaron 200 microlitros de AuNC @ PEG (200 μg / ml) a través de la vena de la cola de las ratas. El tiempo de la angiografía del grupo de sangre en AuNC @ PEG se evaluó mediante exploración de puntos de tiempo continuo antes de la inyección (0 min) y después de la inyección (10, 20, 30, 40, 60 y 90 min). Luego, a las ratas del grupo de control se les inyectó medio de contraste de yodo a una concentración apropiada. La dosis de inyección y el tiempo de exploración fueron similares a los de AuNC @ PEG. Tras la inyección de un medio de contraste, observamos simultáneamente el realce de contraste del riñón (Fig. 5) y el llenado de la vejiga (SI Fig. 1). Los resultados mostraron que el riñón en el grupo AuNC @ PEGs alcanzó el pico a los 30 min y se excretó por completo a los 90 min y que en el grupo de agentes de contraste a base de yodo alcanzó el pico a los 20 min y se excretó por completo a los 60 min. Luego, observamos que la vejiga se fue llenando gradualmente de medio de contraste con el tiempo. Este hallazgo mostró que el tiempo de la angiografía del grupo sanguíneo de AuNC @ PEG fue mejor que el del agente de contraste a base de yodo. El tiempo de circulación sanguínea más prolongado de los AuNC @ PEG puede proporcionar un mejor diagnóstico, y el AuNC @ PEG tiene mejores perspectivas de desarrollo.

Imágenes de TC in vivo de las ratas en diferentes momentos después de la inyección de AuNC @ PEG

Seguridad de AuNC @ PEG en vivo

Como se muestra en la Fig.6a, los parámetros estándar de los análisis rutinarios de sangre y función hepática y renal se reflejaron por el nivel de hemoglobina, la concentración de hemoglobina corpuscular media, el volumen corpuscular medio, el recuento de plaquetas, el recuento de glóbulos rojos, el recuento de glóbulos blancos, la concentración de albúmina, nivel de alanina aminotransferasa, nivel de aspartato aminotransferasa y nivel de creatinina. En el análisis estadístico, no se observaron diferencias significativas entre el AuNC @ PEG, el agente de contraste de yodo y los grupos de control ( P > 0,05). Además, los órganos (corazón, hígado, bazo, pulmón y riñón) de las ratas se analizaron histológicamente, como se muestra en la Fig. 6b, 24 h después de la inyección de AuNC @ PEG (200 μg / ml); rebanado; y teñido (H&E). En comparación con el grupo de control (no inyectado con nanomateriales), no se encontraron cambios morfológicos obvios ni lesiones como se muestra bajo el microscopio. Los resultados mencionados anteriormente confirmaron aún más la seguridad y confiabilidad de los AuNC @ PEG in vivo.

Evaluación de la toxicidad in vivo de AuNC @ PEG. Rutina sanguínea y función hepática y renal:nivel de hemoglobina (I), concentración media de hemoglobina corpuscular (II), volumen corpuscular medio (III), plaquetas (IV), recuento de glóbulos rojos (V), recuento de glóbulos blancos (VI), concentración de albúmina (VII), nivel de alanina aminotransferasa (VIII), nivel de aspartato aminotransferasa (IX) y nivel de creatinina (X) ( a ). La tinción de H&E se realizó en los órganos (corazón, hígado, bazo, pulmón y riñón) de ratas normales y en las que recibieron AuNC @ PEG durante 24 h ( b ). Las barras de escala de b son de 100 μm

Conclusión

Hemos desarrollado AuNC @ PEG, un nuevo tipo de agente de contraste para tomografía computarizada, con características como tamaño pequeño, alto contraste, tiempo de retención sanguíneo prolongado y bajo riesgo de toxicidad. Las evaluaciones de toxicidad in vitro e in vivo mostraron que los AuNC @ PEG tenían una buena biocompatibilidad y un bajo riesgo de efectos secundarios. El rendimiento de las imágenes de la tomografía computarizada in vitro e in vivo mostró que los AuNC @ PEG tienen un coeficiente de absorción de rayos X más alto y un tiempo de angiografía de la acumulación de sangre más prolongado que los agentes de imagen tradicionales basados ​​en yodo. Además, los AuNC @ PEG son superiores a los agentes de formación de imágenes basados ​​en yodo, y el uso de AuNC @ PEG es práctico. Todos estos resultados mostraron que los AuNC @ PEG tienen un coeficiente de absorción de rayos X más alto que los agentes de contraste tradicionales a base de yodo y que el rendimiento de imagen de los AuNC @ PEG era mayor que el de los agentes de contraste tradicionales a base de yodo. Por lo tanto, los AuNC @ PEG funcionalizados sintetizados en este estudio tienen un gran potencial para la aplicación clínica en la tomografía computarizada.

Disponibilidad de datos y materiales

Los datos en bruto / procesados ​​necesarios para reproducir estos hallazgos no se pueden compartir en este momento, ya que los datos también forman parte de una investigación y desarrollo en curso.

Abreviaturas

CT:

Tomografía computarizada

DCF:

Diclorofluoresceína

DCFH:

Diclorofluorescina

H ₂ O ₂ :

Peróxido de hidrógeno

LDH:

Lactato deshidrogenasa

MTT:

Bromuro de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio

PBS:

Solución salina tamponada con fosfato

PEG:

Polietilenglicol

ROS:

Especies reactivas de oxígeno

TEM:

Microscopio electrónico de transmisión

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