Biosensor electroquímico salival de cortisol basado en nanoflakes de disulfuro de estaño

Introducción

El cortisol, una hormona esteroidea, es secretada por el sistema hipotalámico-pituitario-suprarrenal (HPA). Es un conocido biomarcador de estrés psicológico y, por lo tanto, se denomina "hormona del estrés" [1, 2]. Los niveles de cortisol siguen un ritmo circadiano durante un ciclo de 24 h; los niveles más altos se observan temprano en la mañana y los niveles se reducen progresivamente por la noche [3, 4, 5, 6]. Los niveles excesivos de cortisol pueden causar la enfermedad de Cushing, con síntomas de obesidad central, estrías moradas y debilidad muscular proximal. Sin embargo, niveles reducidos de cortisol pueden conducir a la enfermedad de Addison, con fatiga crónica, malestar, anorexia, hipotensión postural e hipoglucemia [7,8,9]. Por lo tanto, mantener un equilibrio adecuado de cortisol es esencial para la salud humana.

Se ha desarrollado un creciente interés en la medición del cortisol como precursor de eventos médicos y psicológicamente relevantes, entre los cuales la aflicción más reciente es el trastorno de estrés postraumático (TEPT). La importancia de la función aberrante del eje HPA en el PTSD es indiscutible; por lo tanto, los métodos de evaluación tradicionales aún pueden proporcionar abundante evidencia e información [10, 11, 12, 13, 14]. Recientemente, muchos estudios han informado de la importancia de la detección de cortisol y han identificado correlaciones con diferentes enfermedades [15,16,17,18]. Varios estudios han confirmado que el cortisol está relacionado con el trastorno del espectro autista [19], la depresión [20], la ideación suicida [21], la adversidad infantil y los trastornos externalizantes [22].

Aunque identificar los niveles de cortisol representa una herramienta de diagnóstico importante, las técnicas de detección de cortisol de laboratorio rutinarias como la cromatografía [23, 24], el radioinmunoensayo [25], el inmunoensayo electroquimioluminiscente [26,27,28], el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas [28, 29] ], la resonancia de plasmón de superficie [1, 30, 31] y la microbalanza de cristal de cuarzo [32] implican un tiempo de análisis extenso, son costosas y no se pueden implementar en entornos de punto de atención (POC) [33]. Por lo tanto, actualmente existe la necesidad de una determinación sensible, eficiente y en tiempo real de los niveles de cortisol.

En los últimos años, los métodos de inmunoensayo electroquímico, que se establecen en el reconocimiento molecular específico entre antígenos y anticuerpos, han surgido como una tecnología prometedora debido a características destacadas, como la participación de dispositivos simples, análisis rápido, pruebas de POC de bajo costo y sin etiqueta, alta sensibilidad y bajos umbrales de detección de cortisol en biofluidos [34, 35]. Los cambios de potencial eléctrico se atribuyen a variaciones en la concentración de reacciones electroquímicas redox en el electrodo. El cortisol secretado finalmente ingresa al sistema circulatorio y se puede encontrar en varios biofluidos como el líquido intersticial [36], la sangre [37], la orina [38], el sudor [39] y la saliva [40]. Las ventajas de la detección electroquímica de cortisol salival, que es un método no invasivo, con fácil recolección, manipulación y almacenamiento de muestras, han mejorado su potencial para su aplicación en sensores POC para la medición en tiempo real [41].

Un biosensor ideal debe tener límites de detección bajos, selectividad rápida y alta sensibilidad. Para fabricar un inmunosensor, la matriz inmovilizadora elegida debe poseer una alta funcionalidad superficial, una alta carga de biomoléculas y una baja resistencia al transporte de electrones, con una alta tasa de transferencia de electrones [42]. Sin embargo, los nanomateriales de sulfuro metálico rara vez se han sugerido para la inmovilización de proteínas para la biodetección electroquímica. Por lo tanto, aquí, se seleccionó el disulfuro de estaño como una matriz inmovilizadora potencial para el desarrollo de inmunosensores con el fin de detectar el cortisol presente en la saliva.

Los materiales nano bidimensionales (2D) han atraído abundantes intereses de investigación en la última década. Hay una variedad de tipos de materiales 2D que van desde semiconductores a metales y desde inorgánicos a orgánicos [43, 44, 45, 46] y compuestos relacionados [47, 48, 49, 50]. El descubrimiento, la fabricación y la investigación del material nano 2D son corrientes predominantes en varios campos. Nano disulfuro de estaño 2D (SnS ₂ ), un semiconductor de tipo n con una banda prohibida de 2,18 a 2,44 eV [51, 52], está formado por átomos de Sn intercalados entre dos capas de átomos de azufre (S) dispuestos hexagonalmente y estrechamente, con capas S adyacentes unidas por un débil van der Fuerzas de Waals [53]. Debido a sus intrigantes propiedades eléctricas, alta movilidad del portador, buena estabilidad química, bajo costo y propiedades ópticas [54], SnS ₂ se ha convertido en un material prometedor para diversas aplicaciones en células solares y dispositivos optoelectrónicos [55, 56], como electrodos en baterías de iones de litio [57, 58], sensores de gas y monitores de glucosa [59, 60]. La selección del material del electrodo es un factor clave importante para mejorar el rendimiento al proporcionar un área de reacción grande y un microambiente favorable para facilitar la transferencia de electrones entre la enzima y la superficie del electrodo.

En este trabajo, los biosensores se fabricaron utilizando SnS ₂ como la matriz inmovilizadora para detectar cortisol. Los resultados de los estudios de voltamperometría diferencial de pulsos (DPV) relacionados con la detección electroquímica muestran una alta sensibilidad de 0,0103 mA / Mcm ² y la concentración de detección más baja de 100 pM.

Materiales y métodos

Materiales

Hidrocortisona (cortisol), anticuerpo anti-cortisol de conejo (anti-cortisol, C-M _ab ), hexacianoferrato de potasio (II), hexacianoferrato de potasio (III), β-estradiol, testosterona, progesterona y corticosterona se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). La albúmina de suero bovino (BSA) se obtuvo de PanReac. Cloruro de estaño (IV) pentahidratado (SnCl ₄ ^. 5H ₂ O) y tioacetamida (C ₂ H ₅ NS) fueron suministrados por Showa (Japón) y Alfa Aesar (Reino Unido). Solución salina tamponada con fosfato (PBS) preparada con NaCl, KCl, Na ₂ HPO ₄ y KH ₂ PO ₄ se adquirieron de Sigma-Aldrich. La alúmina micropulida se obtuvo de Buehler (Reino Unido). Todos los demás productos químicos eran de calidad analítica y se utilizaron sin purificación adicional. El kit de ELISA de cortisol saliva (Cat # SA E-6000) se adquirió en LDN (Alemania).

Síntesis de disulfuro de estaño

Polvos de SnCl ₄ · 5H ₂ O y C ₂ H ₅ Se mezclaron NS en 70 ml de agua desionizada y se ajustó el pH a 7,4. Se calentó un reactor de autoclave hidrotermal que contenía los reactivos desde temperatura ambiente a 200 ^° C en 1 h, y se mantiene a 200 ^° C durante 11 h. Luego, el SnS ₂ resultante El polvo se lavó con agua desionizada y etanol a 6000 rpm durante 15 min y finalmente se secó al aire a 80 ^° C. Este método hidrotermal se aplicó con éxito para la síntesis de SnS ₂ .

Caracterización de materiales

Se utilizó difracción de rayos X (XRD, PANalytical, Países Bajos) para investigar la fase cristalina de SnS ₂ hexagonal 2D copos. Se utilizó microscopía electrónica de barrido por emisión de campo multifuncional (FE-SEM, Zeiss, Alemania) para obtener imágenes de la morfología de la superficie de los materiales. Se utilizó microscopía electrónica de transmisión de pistola de emisión de campo (FEG-TEM, Tecnai, EE. UU.) Para discernir la microestructura de SnS ₂ , y se utilizó difracción de área seleccionada (SAED, Tecnai) para obtener patrones de cristal.

Fabricación de BSA / C-M _ab / SnS ₂ / Biosensores GCE

Los electrodos de carbono vítreo (GCE) se pulieron primero con una suspensión de alúmina y luego se pulieron gotas de una mezcla de 5 M SnS ₂ se depositaron sobre la superficie de las ECG pretratadas. Se prepararon soluciones de anticuerpo anti-cortisol (1 mg / mL) y BSA (1%) en PBS. SnS ₂ A continuación, se decoró / GCE con las soluciones de anticuerpo y BSA en secuencia. El BSA / C-M _ab fabricado / SnS ₂ / Los biosensores GCE se almacenaron en refrigeración a 4 ^° C cuando no esté en uso. El concepto de investigación y la configuración del sistema de detección se ilustran en la Fig. 1.

Concepto de investigación y configuración del sistema de detección

Análisis electroquímico

Fabricado BSA / C-M _ab / SnS ₂ / Las ECG se caracterizaron mediante espectroscopia de impedancia electroquímica (EIS) y voltamperometría cíclica (CV) para comparar sus comportamientos electroactivos. Los estudios de respuesta electroquímica en función de la concentración de cortisol se realizaron utilizando CV y ​​voltamperometría de pulso diferencial (DPV). Todos los experimentos se realizaron utilizando un sistema de tres electrodos con un GCE como electrodo de trabajo, un alambre de Pt como electrodo auxiliar y un electrodo de calomelanos saturado como electrodo de referencia en PBS 10 mM (pH 7,4) que contiene Fe (CN ) ₆ ^{3- / 4-} . Las mediciones electroquímicas se realizaron en una estación de trabajo electroquímica de la serie Modelo CHI6114E (CH Instruments, EE. UU.). Las mediciones de CV y ​​DPV se llevaron a cabo entre - 0,4 V y 1,0 V a una velocidad de exploración de 10 mV / s, a menos que se especifique lo contrario.

Recolección de muestras de saliva y detección electroquímica

Se recogió una muestra de saliva (2 ml) de dos sujetos voluntarios sanos alrededor del mediodía para validar el BSA / C-M _ab desarrollado / SnS ₂ / GCE. Las muestras de saliva se obtuvieron sin ningún tipo de filtración y se almacenaron inicialmente a -20 ° C para mantener las características biológicas. Antes de la detección, las muestras de saliva se descongelaron a temperatura ambiente y se centrifugaron a 3500 rpm durante 15 minutos para recoger el sobrenadante para la medición. La saliva separada se almacenó a -20 ° C. El BSA / C-M _ab / SnS ₂ / GCE se utilizó para la detección electroquímica de concentraciones de cortisol en muestras de saliva. La detección de cortisol mediante análisis electroquímico con BSA / C-M _ab / SnS ₂ / GCE se comparó con el del kit de cortisol ELISA disponible comercialmente mencionado anteriormente.

Estudio de interferencias

El efecto inhibidor de posibles agentes de confusión, como otras hormonas esteroides, sobre BSA / C-M _ab / SnS ₂ / La especificidad de GCE se investigó colocando el biosensor en las siguientes soluciones diferentes:β-estradiol 100 nM, testosterona 100 nM, progesterona 100 nM y corticosterona 100 nM, durante 10 minutos y luego escaneado por CV. La velocidad de exploración fue de 10 mV / sy el rango de exploración fue de - 0,4 V a 0,6 V.

Detección de cortisol salival por ELISA

Se realizó un ELISA en las muestras de saliva de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para establecer una curva de calibración para las mediciones de cortisol, el ensayo se realizó en una placa de titulación de 96 pocillos que contenía seis concentraciones de cortisol estándar conocidas (0.0, 0.1, 0.4, 1.7, 7.0 y 30 ng / mL) para determinar la absorbancia de cada pocillo. a 450 nm. La curva de calibración se ajustó con una línea de tendencia para obtener una ecuación para el cálculo de muestras desconocidas.

Resultados y discusión

Análisis de materiales de SnS ₂

Como se ve en el patrón XRD en la Fig. 2a, el producto tal como se sintetizó muestra solo los picos XRD correspondientes a la fase hexagonal SnS ₂ (Tarjeta JCPDS n. ° 89-2358). La Figura 2b, c ilustra las imágenes FE-SEM del SnS ₂ sintetizado que tiene una morfología uniforme en forma de escamas con un tamaño de aproximadamente 300 nm. La Figura 2d – f muestra las imágenes FEG-TEM y SAED de SnS ₂ , en el que se identifican espacios de franjas de celosía de 0,167 nm y 0,316 nm para SnS ₂ hexagonales como una estructura monocristalina. El apilamiento de nanoflakes es de menos de 10 capas con un espesor total de menos de 10 nm.

un Patrón XRD de SnS ₂ . Imágenes FE-SEM de SnS ₂ nanoflakes se tomaron con aumentos de ( b ) × 250.000 y ( c ) × 100.000. d Imágenes FEG-TEM de SnS ₂ nanoflakes. e FEG-TEM transversal de SnS ₂ nanoflakes e imagen FEG-TEM ampliada. f Imagen SAED de SnS ₂ nanoflakes

Respuestas electroquímicas del electrodo

La corriente de oxidación puede aumentar considerablemente mediante la adición de disulfuro de estaño. Como se muestra en la Fig. 3a, b, la magnitud de la corriente de oxidación reducida de SnS ₂ / GCE a C-M _ab / SnS ₂ / GCE, seguido de BSA / C-M _ab / SnS ₂ / GCE, a medida que aumentaba el valor de la resistencia de transferencia de carga. Por tanto, los resultados indican que las propiedades del sensor se modificaron en el electrodo. Inicialmente, BSA / C-M _ab / SnS ₂ / GCE se estudió variando la velocidad de exploración de 10 mV / sa 100 mV / s, como se muestra en la Fig. 3c. El cambio en la respuesta de la corriente con la velocidad de exploración, como se muestra en la Fig. 3d, muestra que la corriente de oxidación aumentó linealmente con la velocidad de exploración y siguió la relación: I =0.5156 υ – 0.0319 ( R ² =0.9985) en oxidación y I =0.6758υ – 0.0288 ( R ² =0,9997) en reducción. Sin embargo, la casi linealidad para el incremento en la corriente máxima con una velocidad de exploración en aumento con picos redox bien definidos indica un proceso de superficie controlada, con transferencia de electrones estable.

un Estudio de respuesta CV del electrodo GCE (curva a), SnS ₂ / Electrodo GCE (curva b), C-M _ab / SnS ₂ / Electrodo GCE (curva c), BSA / C-M _ab / SnS ₂ / Electrodo GCE (curva d). b Estudio de respuesta EIS del GCE, SnS ₂ / GCE, C-M _ab / SnS ₂ / GCE y BSA / C-M _ab / SnS ₂ / Electrodos GCE. Recuadro:el circuito equivalente correspondiente. c Mayor magnitud de la corriente de respuesta de oxidación de BSA / C-M _ab / SnS ₂ / Electrodo GCE con mayor frecuencia de exploración de 10 mV / sa 100 mV / s. d La magnitud actual aumentó con el aumento de la velocidad de exploración. e Estudios CV de BSA / C-M _ab / SnS ₂ / Electrodo GCE en función de la concentración de cortisol que varía de 100 pM a 100 μM. f Curva de linealidad para la respuesta actual con diferentes concentraciones de cortisol. g Estudios DPV de BSA / C-M _ab / SnS ₂ / Electrodo GCE en función de la concentración de cortisol que varía de 100 pM a 100 μM. h Curva de linealidad para la respuesta actual con diferentes concentraciones de cortisol

La corriente disminuyó al aumentar la concentración de cortisol en el rango de 100 pM a 100 µM. La diferencia en la corriente se correlacionó directamente con la concentración de cortisol que se detecta. Se obtuvieron valores actuales y picos de oxidación bien separados para BSA / C-M _ab / SnS ₂ / Electrodos GCE, como se muestra en la Fig. 3e, f. El cambio de corriente con el logaritmo de concentración fue casi lineal. Está claro que la reducción del coeficiente de regresión lineal es mejor para CV. Por lo tanto, se realizaron más mediciones con un DPV más específico y preciso. Los resultados de tales estudios de DPV indicaron que la magnitud de la respuesta actual disminuyó con la adición de cortisol, como se ilustra en la Fig. 3g. Una curva de calibración presentada en la Fig. 3h traza la magnitud de la respuesta actual y el logaritmo de la concentración de cortisol, y se encontró que es linealmente dependiente y sigue la ecuación: y =- 0.0103 x + 0,0443; R ² =0,9979. Este sensor exhibió un rango de detección entre 100 pM a 100 μM, con un límite de detección de 100 pM y una sensibilidad de 0.0103 mA / Mcm ² ( R ² =0,9979).

Estudio de estabilidad del almacenamiento

También se llevaron a cabo estudios de CV para estudiar la vida útil de BSA / C-M _ab / SnS ₂ / GCE a intervalos de 1 día a 1 semana. Para comparar dos condiciones de conservación, una condición era almacenar los electrodos secos al vacío, mientras que la otra era almacenar los electrodos a 4 ° C. La estabilidad del pico redox de los electrodos a 4 ° C y al vacío se muestran en la Fig. 4a, c, respectivamente. Está claro que la condición de conservación a 4 ° C fue mejor que la del vacío. La Figura 4b, d muestra que el valor de estabilidad del electrodo fue del 82% con los electrodos almacenados al vacío durante 7 días, mientras que el valor de estabilidad del electrodo fue del 91% con los electrodos almacenados a 4 ° C. Se puede observar que la estabilidad de los electrodos almacenados a 4 ° C fue mayor que la de los electrodos almacenados al vacío. La pérdida de actividad del electrodo posiblemente se debió a la degradación de la actividad del anticuerpo cortisol al vacío. La estabilidad de almacenamiento es un tema crucial para el sensor enzimático. Se puede introducir una capa protectora en el diseño futuro del electrodo.

Estabilidad de pico redox de BSA / C-M _ab / SnS ₂ / Electrodo GCE con diferentes condiciones de conservación ( a y b ) al vacío ( c y d ) a 4 ° C durante 7 días

Estudio de interferencias

Los resultados de los estudios CV de BSA / C-M _ab / SnS ₂ / GCE para medir posibles agentes de confusión, como β-estradiol (100 nM), testosterona (100 nM), progesterona (100 nM) y corticosterona (100 nM) con respecto al cortisol (10 nM), se muestran en la Fig. 5a. En comparación con el cambio en la respuesta de la señal de cortisol, los efectos de la interferencia fueron menos del 5% del resultado para el cortisol, lo que sugiere que tales interferencias potenciales pueden ignorarse convenientemente.

un Estudio de interferencia con β-estradiol (100 nM), testosterona (100 nM), progesterona (100 nM) y corticosterona (100 nM) con respecto al cortisol (1 0 nM). b Comparación de las mediciones de cortisol salival mediante ELISA y métodos electroquímicos

Detección de cortisol salival mediante ELISA y métodos electroquímicos

Mediciones de muestras de cortisol salival realizadas con ELISA y BSA / C-M _ab / SnS ₂ / Electrodo GCE se resumen en la Tabla 1 y la Fig. 5b. Las concentraciones de cortisol determinadas mediante ELISA fueron 1,105 × 10 ⁻⁸ M y 3.998 × 10 ⁻⁹ M. Los resultados calculados de cortisol mediante la medición electroquímica fueron 1.046 × 10 ⁻⁸ M y 3.911 × 10 ⁻⁹ M. Se logró una buena correlación con estas dos técnicas, mostrando resultados comparables con solo una diferencia de 2-5%. Por lo tanto, los resultados demuestran que este BSA / C-M _ab / SnS ₂ / GCE se puede emplear para la detección electroquímica de cortisol en fluidos biológicamente relevantes como la saliva.

Comparación con otros estudios

Los resultados de este estudio se compararon con otros estudios que involucraron sensores electroquímicos de cortisol salival reportados en la literatura para obtener una mejor comprensión del rendimiento de este BSA / C-M _ab / SnS ₂ / GCE. Las tablas 2 y 3 muestran comparaciones de los resultados obtenidos utilizando electrodos sin oro en la detección de cortisol. Hay tres ventajas principales del presente trabajo. Primero, los materiales tienen un costo mucho menor que los dispositivos presentados en otros estudios. En segundo lugar, el proceso de preparación fue relativamente simple y rápido. Finalmente, el límite de detección fue similar al reportado en otra literatura o, de hecho, incluso mejor que los reportados, mientras que el rango de detección objetivo para el cortisol salival se obtiene fácilmente.

Conclusiones

Se ha aplicado con éxito un método hidrotermal para la síntesis de SnS ₂ . Las propiedades de SnS ₂ se caracterizaron por XRD, FE-SEM, FEG-TEM y SAED. Las respuestas electroquímicas del electrodo en función de las concentraciones de cortisol se determinaron utilizando CV y ​​DPV. Nuestro sensor de cortisol exhibió un rango de detección de 100 pM a 100 μM, un límite de detección de 100 pM y una sensibilidad de 0.0103 mA / Mcm ² ( R ² =0,9979). Los parámetros de detección obtenidos estaban en rangos fisiológicos normales. El impacto de la interferencia potencial fue inferior al 5%, lo que indica una buena especificidad de este sensor. Las pruebas de estabilidad demostraron que la actividad del sensor almacenado a 4 ° C era mejor que al vacío. Los resultados de este electrodo para la medición de cortisol en muestras de saliva fueron consistentes con ELISA. Por lo tanto, el análisis electroquímico con este BSA / C-M _ab / SnS ₂ / El electrodo GCE puede reemplazar los métodos de inmunoensayo más tradicionales que consumen mucho tiempo.

Disponibilidad de datos y materiales

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado.

Abreviaturas

2D:

Bidimensional

BSA:

Albúmina de suero bovino

C-M _ab :

Anticuerpo cortisol

CV:

Voltamperometría cíclica

DPV:

Voltamperometría diferencial de pulsos

EIS:

Espectroscopia de impedancia electroquímica

ELISA:

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

FEG-TEM:

Microscopio electrónico de transmisión con pistola de emisión de campo

FE-SEM:

Microscopio electrónico de barrido por emisión de campo

GCE:

Electrodos de carbono vítreo

HPA:

Hipotalámico-pituitario-suprarrenal

PBS:

Solución salina tamponada con fosfato

POC:

Punto de atención

PTSD:

Trastorno de estrés postraumático

SAED:

Difracción de área seleccionada

XRD:

Difracción de rayos X

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