Entrega de ARNip catiónico basado en micelas para una terapia génica eficaz contra el cáncer de colon

Resumen

La terapia génica basada en ARN de pequeña interferencia (ARNip) ha proporcionado una estrategia alternativa para la terapia del cáncer. Uno de los componentes clave del proceso de terapia génica es el sistema de administración. Como un nuevo vector génico no viral, DMP, preparado mediante la modificación de la micela mPEG-PCL con lípido DOTAP catiónico, se ha preparado y aplicado con éxito en un estudio de terapia génica de cáncer de colon basado en ADN plasmídico. Sin embargo, se desconoce su potencial en la entrega de ARNip. En este estudio, se optimizó el proceso de preparación de DMP y se estudiaron las eficacias anticancerígenas de los complejos DMP / siMcl1 y DMP / siBcl-xl en un modelo de cáncer de colon de ratón. Nuestros resultados demostraron que los ARNip administrados con micelas catiónicas DMP podrían inhibir eficazmente el crecimiento de células de cáncer de colon C26 in vitro . Mientras tanto, la administración intratumoral de los complejos DMP / siMcl1 y DMP / siBcl-xl obviamente suprimió el modelo de tumor subcutáneo in vivo. Estos resultados sugieren que el complejo DMP / ARNip es un candidato potencial para la terapia génica del cáncer.

Introducción

El cáncer es un importante problema de salud pública mundial. El cáncer de colon es un tumor maligno común que afecta a más de un millón de personas en todo el mundo cada año [1]. La terapia génica se ha aplicado como método para tratar tumores sólidos y tumores sanguíneos [2, 3]. La clave de la terapia génica del cáncer depende del sistema de administración de genes seguro y eficaz [4, 5]. Los vectores no virales, incluidos los lípidos catiónicos, las nanoemulsiones de lípidos, las nanopartículas de lípidos sólidos y los vectores basados en polímeros han ganado más atención que los vectores virales por sus posibles ventajas en la entrega de genes:se preparan fácilmente, provocan una menor respuesta inmune, poseen una menor toxicidad y mejor biocompatibilidad [6, 7]. La nanotecnología proporciona un medio novedoso para el estudio de vectores no virales con ventajas que incluyen biocompatibilidad, biodegradabilidad, seguridad y capacidad de focalización, etc. [2, 8]. Allí, un gran número de portadores de nanopartículas que tienen una carga positiva alta pueden combinarse con el fármaco de ácido nucleico aniónico por efecto de carga eléctrica, lo que muestra una perspectiva de aplicación amplia y brillante en la terapia génica [9, 10].

Como tipo de copolímero de polímero, que posee biodegradabilidad y biocompatibilidad, los copolímeros de PEG / PCL muestran aplicaciones prometedoras en los sistemas de administración de fármacos [11,12,13]. Sobre la base de las micelas MPEG-PCL, utilizamos DOTAP anfifílico para modificar el copolímero MPEG-PCL en un solo paso, creando las micelas híbridas DOTAP y MPEG-PCL catiónicas autoensambladas (DMP) [14,15,16,17]. Estas micelas muestran una perspectiva prometedora en la administración de fármacos químicos y fármacos genéticos con excelente estabilidad y seguridad. Por ejemplo, DMP se ha utilizado para administrar el gen suicida survivinT34A y curcumina para la terapia del cáncer de colon [14, 18]. Sin embargo, los estudios previos se limitaron a la transmisión de ADN plasmídico, y hasta ahora no había ningún informe sobre la administración de micelas de DMP para otras formas de terapia génica, lo que limitaba la aplicación de las micelas de DMP en la terapia génica.

La interferencia genética basada en ARNip también es una parte esencial de la terapia génica además de los genes terapéuticos del ADN plasmídico. Como miembro esencial del gen-fármaco, el ARNip es una pequeña molécula de ARN bicatenario. Los fármacos anticancerosos de ARNip utilizan mecanismos de ARNi endógeno para silenciar la expresión de oncogén. Debido a las ventajas significativas, como la estabilidad mejorada y la eficacia del silenciamiento, el ARNip tiene el potencial de desarrollarse en aplicaciones terapéuticas contra el cáncer [19]. En comparación con el gran peso molecular del ADN plasmídico, el ARNip tiene una mayor eficacia de transfección, lo que es particularmente adecuado para el punto de dirección de genes específicos en la terapia génica. Por lo tanto, podría ser una buena opción para la terapia génica. Actualmente, se han probado en ensayos clínicos múltiples fármacos de tratamiento de ARNip basados en vectores no virales, como CALAA-01 basado en nanopartículas de polipolímero de cationes de ciclodextrina y ALN-TTR02 basado en lípidos [2]. Sin embargo, la terapia génica basada en ARNip sigue siendo necesaria para desarrollar un nuevo punto de dirección de ARNip y buscar portadores de administración de ARNip seguros, eficaces y altamente específicos.

En este estudio, intentamos utilizar micelas de DMP para administrar ARNip para estudiar la eficiencia y seguridad de las micelas de DMP para administrar ARNip. Usamos ARNip Bcl-xl y ARNip Mcl1 como diana terapéutica, buscando su efecto antitumoral para el tratamiento del cáncer de colon in vitro e in vivo. El gen Bcl-xl y el gen Mcl1 son miembros de la familia Bcl-2 del gen antiapoptótico y desempeñaron un papel vital en la inhibición de la apoptosis [20, 21]. Suponemos que las micelas DMP sintéticas pueden entregar ARNip Bcl-xl y ARNip Mcl1 de manera eficaz y segura. El siRNA Bcl-xl y el siRNA Mcl1 pueden inhibir la expresión del gen Bcl-xl y del gen Mcl1, induciendo la apoptosis de las células C26 y luego logrando un efecto terapéutico de inhibición del crecimiento de las células C26.

Materiales y método

Materiales

El metil sulfato de N- [1- (2,3-dioleoiloxi) propil] -N, N, N-trimetilamonio (DOTAP) se adquirió de Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, EE.UU.). El copolímero dibloque MPEG-PCL con un peso molecular diseñado de 4000 fue sintetizado de acuerdo con nuestros informes anteriores [22]. El Mn del copolímero MPEG-PCL fue 4050. El medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) y el bromuro de 3- (4,5-dimetiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolio (MTT) se obtuvieron de Sigma-Aldrich (EE. UU.) ) y se utiliza sin purificación adicional. El diclorometano y otros disolventes orgánicos se adquirieron en ChengDu Kelang Chemical Co., Ltd. (Chengdu, P. R. China). Se adquirieron células C26 (adenocarcinoma de colon murino) y células 293 T (HEK 293 T / 17) de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE. UU.). Las células se cultivaron en DMEM complementado con suero de ternero fetal al 10%, incubando a 37 ° C con CO ₂ al 5%. -Ambiente de aire humidificado.

Preparación de micelas DMP

Para seleccionar un mejor proceso de preparación de DMP, se prepararon micelas de DMP en tres disolventes orgánicos, cada disolvente con tres dosis diferentes de DOTAP. En cuanto al disolvente, se eligieron para estudiar diclorometano, cloroformo y acetato de etilo, y las dosis de DOTAP incluyeron 5 mg, 10 mg y 20 mg. Se disolvieron conjuntamente DOTAP y MPEG-PCL en el disolvente orgánico y luego se evaporaron mediante una bomba de vacío para formar una película seca. Posteriormente, la película seca se rehidrató en agua destilada. Finalmente, las micelas de DMP preparadas se almacenaron a 4 ° C.

Caracterización de micelas DMP

El tamaño de partícula y el potencial zeta de las micelas de DMP se determinaron mediante un medidor Zeta Nano ZS (Malvern Instruments, Worcestershire, Reino Unido) y se mantuvieron a 25 ° C durante el proceso de medición. Todos los resultados fueron la media de tres carreras. La estabilidad de las micelas de DMP se evaluó cualitativamente. Los agregados de micelas de DMP se examinaron a simple vista. La presencia de precipitación indicó inestabilidad de las micelas de DMP, mientras que una solución uniformemente transparente sugiere estabilidad.

Gel retardante

Se mezclaron ARNip Scramble (DMP / Scramble siARN) con 2 µl de tampón de carga, se cargaron en gel de agarosa al 1% y se separaron por electroforesis a 140 V durante 10 min. Se combinaron 0,2 µg de ARNip Scramble con 1, 2, 3, 4, 5 y 6 µg de micelas de DMP. El gel se tiñó con el visor dorado y las bandas correspondientes al ARNip Scramble se visualizaron bajo luz ultravioleta.

Citotoxicidad de las micelas de DMP

La citotoxicidad de las micelas de DMP en las células 293 T y las células C26 se evaluó mediante el método MTT. Brevemente, las células 293T y las células C26 se sembraron en placas a una densidad de 1,2 × 10 ³ células por pocillo en 100 μl de medio DMEM que contiene 10% de FBS (suero fetal bovino) en placa de 96 pocillos y se cultivaron durante 24 h. A continuación, las células se expusieron a una serie de micelas de DMP o PEI25K a diferentes concentraciones durante 72 horas. La viabilidad de las células se midió usando un ensayo MTT. Los resultados fueron la media de seis ejecuciones de prueba.

Transfección in vitro

Veinticuatro horas antes de la transfección, las células C26 se sembraron en una placa de 24 pocillos a una densidad de 5 × 10 ⁴ células por pocillo en 0,5 ml de medio DMEM que contiene FBS al 10% (suero bovino fetal). En el momento de la transfección, el medio de cada pocillo se reemplazó con 0,5 ml de medio que contenía 0%, 10%, 20% y 30% de FBS y FAM (carboxifluoresceína) suministrado con DMP (siRNA de DMP / FAM) y PEI- Se pipetearon en cada pocillo ARNip de FAM administrado (ARNip de PEI / FAM) que contenía 1 μg de ARNip en medio sin suero, y la relación de masa de ARNip de DMP / FAM y ARNip de PEI25K / FAM fue 30:1 y 2:1. Veinticuatro horas después, las células transferidas se observaron al microscopio y la actividad de luciferasa se midió mediante citometría de flujo (Epics Elite ESP, EE. UU.)

In vivo silenciamiento de genes

El ratón Bcl-xl, Mcl1-1, el ARNip Scramble y el ARNip de control negativo marcado con ARNip se compraron a GenePharma Co., Ltd (Shanghai, P. R. China) en forma recocida, desalada y desprotegida.

Para determinar el nivel de ARNm de Bcl-xl, se extrajo el ARN total de las células C26 usando el reactivo TRIzol ™ (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) Y se sintetizaron los ADNc individuales con un ensayo de transcriptasa inversa SuperScript II (Invitrogen). La PCR cuantitativa en tiempo real se realizó con un kit universal de PCR cuantitativa SYBR GreenER SuperMix (Invitrogen). Los cebadores de PCR fueron sintetizados por TSINGKE Biological Technology (Chengdu, P. R. China).

Estudio antiproliferación

Las capacidades antiproliferación de las células DMP / siBcl-xl y DMP / siMcl1 a C26 se evaluaron mediante el método MTT. Brevemente, las células C26 se colocaron en placas a una densidad de 1,2 × 10 ³ células por pocillo en 100 μl de DMEM que contiene FBS al 10% en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante 24 h. A continuación, las células se expusieron a una serie de DMP / siBcl-xl y DMP / siMcl1 a diferentes concentraciones durante 72 h. La viabilidad de las células se midió utilizando el método MTT. Los resultados fueron la media de seis ejecuciones de prueba.

Estudio de formación de clones

Las células C26 se sembraron en una placa de 6 pocillos a una densidad de 10 ³ células por pocillo en 2 ml de medio DMEM que contiene FBS al 10%. Veinticuatro horas más tarde, las células se expusieron a una serie de micelas de DMP o ARNip DMP / Scramble y DMP / siBcl-xl y DMP / siMcl1 a diferentes concentraciones. Cuando las células crecieron hasta convertirse en un clon visible a simple vista, se terminó el cultivo y se siguió de enjuague, fijación y teñido. Se contó directamente el número de clones y se calculó la tasa de inhibición.

In vitro estudio de apoptosis

La apoptosis celular se observó mediante tinción con isotiocianato de fluoresceína-anexina V (FITC) y yoduro de propidio. Brevemente, se sembraron células C26 en placas de seis pocillos y se expusieron a una serie de micelas de DMP, ARNip DMP / Scramble, DMP / siBcl-xl y DMP / siMcl1 durante 72 horas. Luego, las células se sometieron a tinción con anexina V-FITC y yoduro de propidio.

Estudio in vivo de xenoinjerto tumoral

Se inocularon ratones BALB / c de 6 a 8 semanas de edad con 5 × 10 ⁶ Células C26 en flanco derecho. Se inyectaron intratumoralmente complejos DMP / ARNip equivalentes a 10 μg de ARNip cada dos días durante 5 tratamientos, ya que el volumen del tumor alcanzó los 100 mm ³ . Los ratones que recibieron una cantidad equivalente de solución salina normal o DMP se consideraron como grupo de control. Se midió el tamaño del tumor y se controló el peso del animal cada 2 días hasta que se sacrificaron todos los animales. El volumen del tumor se calculó como (1/2 × largo × ancho [2]).

Análisis histológico

Los tejidos extirpados se fijaron en una solución de formalina tamponada neutra al 4% durante más de 24 horas y se incluyeron en parafina. Se tiñeron secciones de los tejidos (3-5 μm) con hematoxilina y eosina. Este análisis se realizó siguiendo el protocolo del fabricante y las muestras se examinaron con un microscopio de fluorescencia (× 400).

Se usó un kit TUNEL disponible comercialmente (Promega, Madison, WI) para analizar los efectos apoptóticos en tejidos tumorales de xenoinjerto de melanoma de ratón C26. Este análisis se realizó siguiendo el protocolo del fabricante.

Análisis estadístico

Los datos se expresaron como el valor medio ± DE. El análisis estadístico se realizó con análisis de varianza unidireccional (ANOVA) utilizando el software SPSS. Para todos los resultados, P ≤ 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados

Estudio del proceso de preparación

Para obtener una eficiencia de transfección efectiva y una baja citotoxicidad para la entrega de ARNip, estudiamos diferentes procesos de preparación para las micelas de DMP como se muestra en la Tabla 1. En nuestro estudio, con respecto a los solventes, las micelas de DMP preparadas por acetato de etilo fueron muy inestables y el tiempo estable de las micelas de DMP no fue más de 10 min. Y las micelas de DMP preparadas con diclorometano y cloroformo tenían una excelente estabilidad y podían permanecer estables durante 96 horas, excepto la DMP preparada con cloroformo con una dosis de 20 mg de DOTAP. Más importante aún, también tenían el tamaño, el potencial zeta y el PDI adecuados. Sin embargo, comparando la eficacia de transfección inicial, la eficacia de transfección de las micelas de DMP preparadas con diclorometano fue mayor que la de las micelas de DMP preparadas con cloroformo. Así que seleccionamos diclorometano para preparar micelas de DMP.

Las micelas de DMP preparadas con tres dosis de DOTAP no tenían diferencias aparentes en tamaño, potencial zeta y PDI, pero las micelas de DMP preparadas con una dosis de 20 mg de DOTAP tenían la mayor eficacia de transfección en tres dosis de DOTAP. A través de las comparaciones anteriores, seleccionamos un proceso de preparación basado en DOTAP y MPEG-PCL (Fig. 1a) para preparar micelas de DMP con excelente estabilidad y alta eficiencia de transfección. El esquema de preparación de las micelas DMP se presenta en la Fig. 1b.

un Estructura molecular de DOTAP y MPEG-PCL. b Esquema de preparación de micelas de DMP. c Espectro de distribución de tamaño de las micelas de DMP. d espectro de potencial zeta de las micelas de DMP. e Ensayo de retardo de ARNip. f Citotoxicidad de las micelas de DMP en células 293T. g citotoxicidad de las micelas de DMP en las células C26

Caracterización de micelas de DMP

Como se presenta en la Fig. 1c, el espectro de distribución del tamaño de partícula indicó que las micelas de DMP tenían un tamaño nanométrico (PDI =0,315) con un tamaño de partícula medio de 144,8 nm, lo que sugiere que tenía una distribución de tamaño de partícula muy estrecha. El espectro de potencial zeta de DMP se presentó en la Fig. 1d con un potencial zeta de 46,4 mV. La estabilidad de las micelas DMP se evaluó cualitativamente.

Para evaluar la capacidad de unión de DMP con ARNip, se realizó un ensayo de retardo en gel y los resultados se muestran en la Fig. 1e. Cuando la relación de masa de DMP a ARNip fue ≥ 30, se logró el retardo completo de ARNip Scramble. El ARNip aniónico Scramble se absorbió en la superficie de DMP debido a la interacción electrostática, formando un complejo DMP / ARNip.

La citotoxicidad de las micelas de DMP en células C26 y células 293T se evaluó mediante el método MTT. Como se muestra en la Fig. 1f yg, PEI25K mostró una alta toxicidad en las células 293T, con IC ₅₀ 0,83 μg / ml. Las micelas de DMP, sin embargo, eran mucho menos tóxicas y el IC ₅₀ de DMP fue de 3,7 μg / ml. El IC ₅₀ de micelas de DMP fue de 0,497 mg / ml en células C26. Sin embargo, PEI25K mostró una toxicidad tremenda, con IC ₅₀ <0,1 μg. Por lo tanto, las micelas de DMP tenían una citotoxicidad más baja que la PEI25K y podrían usarse para administrar ARNip a las células C26 de manera segura.

In vitro transfección

Además de la caracterización biofísica, comparamos la eficiencia de transfección de las micelas de DMP con la de PEI25K (agente de transfección "estándar de oro") in vitro . Como se muestra en la Fig.2, en medio que contiene 0%, 10%, 20% y 30% de transfección de FBS, las micelas de DMP tuvieron una eficiencia de transfección de 85,47 ± 1,01%, 81,57 ± 2,04%, 75,29 ± 1,20% y 71,64 ± 1,59% y PEI tuvo una eficacia de transfección de 86,38 ± 2,92%. Hubo poca diferencia en la eficacia de la transfección entre el grupo de suero y el grupo sin suero. Y las eficiencias de transfección del grupo de suero y del grupo sin suero fueron similares a la eficiencia de transfección de PEI. Además, las imágenes de la Fig. 2a presentan una observación directa de la capacidad de transfección de las micelas de DMP con un gen indicador basado en FAM. A partir de la imagen, la morfología de bodega del grupo PEI había cambiado en comparación con los grupos DMP, lo que demostró que PEI tenía una alta citotoxicidad, mientras que las micelas de DMP tenían una baja citotoxicidad.

Eficiencia de transfección de micelas DMP. un Imagen de células C26 transfectadas ( b , c ) eficiencia de transfección de micelas de DMP en medio que contiene 0%, 10%, 20% y 30% de FBS y PEI25K, contados por citometría de flujo

Actividad anticáncer in vitro

En el proceso de la terapia génica, el ARNip juega un papel vital. Por lo tanto, diseñamos un ARNip dirigido a Bcl-xl y un ARNip dirigido a Mcl1 para estudiar su actividad anticancerígena. Para evaluar la capacidad de interferencia de ARNip de Bcl-xl y ARNip de Mcl1, confirmamos la capacidad de interferencia de ARNip de Bcl-xl y ARNip de Mcl1 por qPCR. Según nuestros resultados (Fig. 3), el nivel de ARNm del grupo DMP / siMcl1 fue menor que el de los grupos de control (Fig. 3a). Y el nivel de ARNm de los grupos DMP / siBcl-xl fue más bajo que el de los grupos de control (Fig. 3b). Se ha demostrado bien que DMP / siBcl-xl y DMP / siMCL1 reducen eficazmente el nivel de ARNm relevante.

un El nivel de ARNm de Bcl-xl obviamente reducido por DMP / siMcl1. b Nivel de ARNm de Mcl1 obviamente reducido por DMP / siBcl-xl. c Imágenes de la formación de clones después del tratamiento con DMP / siBcl-xl o DMP / siMcl1 a diferentes concentraciones. d El número de clones después del tratamiento con DMP / siBcl-xl de diferente concentración de ARNip. e Capacidad anticancerosa de DMP / siBcl-xl y DMP / siMcl1 con concentraciones de ARNip de 50 nM y 100 nM en células C26 in vitro. f La tasa de inhibición de la formación de clones después del tratamiento con DMP / siMcl1 de diferente concentración de siMcl1. g la tasa de inhibición de la formación de clones después del tratamiento con DMP / siBcl-xl de diferente concentración de siBcl-xl

Además, se utilizaron micelas de DMP para administrar ARNip en células C26 para estudiar que DMP / siBcl-xl y DMP / siMcl1 pueden inhibir el crecimiento de células C26. La viabilidad de las células C26 se determinó mediante el método MTT. Los resultados mostraron que las tasas de supervivencia celular de DMP / siBcl-xl (50 nM y 100 nM) fueron 69,6% ± 3,3% y 56,3% ± 1,9%, y las tasas de supervivencia celular de DMP / siMcl1 (50 nM y 100 nM) fueron 82,8 % ± 3,1% y 56,3% ± 3,2% (Fig. 3e).

Para seguir estudiando la actividad anticancerígena de DMP / siBcl-xl y DMP / siMcl1, se realizó un ensayo de formación de clones. Obviamente, se demostró que en la Fig. 3c yd, en comparación con el grupo de control, el número de clones en DMP / siBcl-xl y DMP / siMcl1 (50 nM y 100 nM) era menor. Estos resultados sugirieron que DMP / siBcl-xl y DMP / siMcl1 tenían un efecto antiproliferación obvio en las células C26. Por lo tanto, al combinar los resultados del ensayo MTT, los resultados demostraron que DMP / siBcl-xl y DMP / siMcl1 podrían inhibir la proliferación de células C26 y tener una actividad anticancerígena prominente en las células C26.

Para determinar si la pérdida de capacidad de proliferación inducida por DMP / siBcl-xl y DMP / siMcl1 y la viabilidad celular de las micelas de DMP se asociaron con la inducción de apoptosis, se evaluó el número de células apoptóticas mediante citometría de flujo. Como se muestra en la Fig. 3f, las tasas de apoptosis del grupo DMP / siMcl1 fueron 37,9% ± 4,7%, que fue mayor que la del grupo de control y el grupo DMP y el grupo de ARNip DMP / Scramble. Como se muestra en la Fig. 3g, la tasa de apoptosis del grupo DMP / siBcl-xl fue 33,0% ± 3,8%, que también fue mayor que la de otros grupos de control. Estos datos de apoptosis indicaron que DMP / siMcl1 y DMP / siBcl-xl tenían una fuerte capacidad inductora de apoptosis. Los resultados del ensayo de apoptosis fueron consistentes con los resultados de MTT y los resultados de la formación de clones descritos anteriormente, lo que sugiere que la inducción de la apoptosis es un posible mecanismo para inhibir la proliferación y la viabilidad de las células C26.

El complejo DMP / ARNip inhibe el crecimiento del tumor C26 in vivo

También se utilizó un modelo animal de xenoinjerto C26 para probar la eficacia antitumoral del complejo DMP / ARNip in vivo. Las curvas de crecimiento tumoral y las imágenes de los tumores de xenoinjerto C26 de cada grupo se presentan en la Fig. 4a y b. Según nuestros resultados, la inyección intratumoral de DMP / siMcl1 y DMP / siBcl-xl dio como resultado una inhibición significativa del crecimiento tumoral de xenoinjerto en comparación con los grupos de control. El peso de los tumores en cada grupo se presenta en la Fig. 4b. En comparación con el grupo de tratamiento NS (0,85 ± 0,09 g) y el grupo DMP (0,76 ± 0,11 g), el complejo DMP / siMcl1 provocó una reducción estadísticamente significativa en el peso del tumor (0,34 ± 0,06 g, P <0.01), y mientras tanto, el complejo DMP / siBcl-xl provocó una reducción estadísticamente significativa en el peso del tumor (0.42 ± 0.08 g, P <0,01). Estos resultados sugieren que la inyección intratumoral del complejo DMP / ARNip podría inhibir eficazmente el crecimiento del xenoinjerto subcutáneo del modelo de cáncer de colon C26. Los efectos secundarios in vivo del complejo DMP / ARNip en otros órganos se examinaron mediante análisis de HE. Como se muestra en la Fig. 4, no se observaron cambios patológicos significativos en el corazón, hígado, bazo, pulmón o riñón.

Efectos anticáncer y seguridad de DMP / siRNA en modelo de xenoinjerto de ratón C26. un Curva de desarrollo tumoral, calculada por volumen tumoral. b Peso medio de los tumores en cada grupo. En comparación con otros grupos de tratamiento, el grupo DMP / siMcl1 y el grupo DMP / siBcl-xl lograron una reducción estadísticamente significativa en el peso del tumor (*** P , 0,001). c Imágenes representativas de tumores de carcinoma de colon C26. d Apoptosis en tejidos tumorales detectada por ensayo TUNEL. e HE análisis de los órganos principales de cada grupo de tratamiento en ambos modelos. No se observaron cambios patológicos significativos en corazón, hígado, bazo, pulmón o riñón

Discusión

En este estudio, se prepararon micelas híbridas DOTAP y MPEG-PCL catiónicas autoensambladas para administrar ARNip Bcl-xl y ARNip Mcl1 para el tratamiento del cáncer de colon C26. Estas micelas de DMP tenían una estabilidad excelente y eran capaces de combinar y transmitir eficazmente ARNip de Bcl-xl y ARNip de Mcl1 a células C26. Más importante aún, las micelas de DMP administraron ARNip sin precedentes (ARNip de Bcl-xl y ARNip de Mcl1) y podrían inducir eficazmente la apoptosis de las células C26, lo que inhibe el crecimiento de las células C26 tanto in vitro como in vivo con alta seguridad. En conjunto, nuestro estudio sugirió que DMP es un portador de suministro de genes potencial para ARNip.

Hay informes de que el lípido catiónico DOTAP se ha aplicado ampliamente para la liberación de ARNip, pero genera fuertes cargas positivas que desencadenan la hemólisis y tiene una alta citotoxicidad. Basado en liposomas catiónicos DOTAP con alta eficiencia de transfección, pero sus cargas positivas producirían toxicidad, la razón puede ser que la cabeza de sal de amonio cuaternario de DMP con cargas positivas fue expuesta en la superficie de la bicapa de fosfolípidos del liposoma. Sin embargo, las micelas de DMP basadas en lípidos DOTAP tenían alta transfección y baja citotoxicidad. Especulamos que en el proceso de autoensamblado de micelas, DOTAP estaba incrustado dentro de las nanopartículas de polímero, de las cuales la cabeza de sal de amonio cuaternario no estaba completamente expuesta en la superficie. Así se enmascararon las cargas positivas parciales; Mientras tanto, nuestros resultados también muestran que la eficiencia de transfección de las micelas de DMP no fue baja en comparación con la eficiencia de transfección de PEI25K. Sugirió que las cargas positivas de DOTAP después de ser cubiertas todavía estaban parcialmente expuestas, mostrando un potencial adecuado, y se demostró que este nivel de potencial era suficiente para combinar y transmitir ARNip. Además, nuestros resultados indicaron que las micelas de DMP basadas en MPEG-PCL son un portador de entrega de genes eficaz y seguro, que se ha optimizado para la citotoxicidad de DOTAP y retiene la capacidad de transmisión de genes de DOTAP. Y un estudio similar informó que la citotoxicidad de DOTAP se redujo después de combinarse con otros materiales [23]. Recientemente, un nuevo vector que consta de DOTAP y SWNT tuvo una menor citotoxicidad en la entrega de ARNip en comparación con la lipofectamina [8]. Los LPN que se preparan con micelas DOTAP-PLGA mediante el uso de un método de evaporación de disolvente de emulsión doble (DESE) dieron como resultado portadores de tamaño nanométrico [24, 25, 26]. Estos estudios concordaron bien con lo descrito en nuestra investigación e hicieron que nuestra conjetura fuera más convincente hasta cierto punto.

La eficacia de suministro del vector de transferencia génica está muy influenciada por el suero. Las proteínas séricas en el suero podrían neutralizar las cargas positivas en la superficie de los complejos nanoportador / ARNip, que se vio afectada por los efectos electrostáticos en la superficie de las células con cargas negativas [27,28,29].

En nuestro estudio, cuando estudiamos la eficiencia de transfección de las micelas de DMP, configuramos una serie de medio DMEM que contenía 0%, 10%, 20% y 30% de FBS para la transfección, investigando el efecto del suero sobre la eficiencia de transfección de las células cargadas. Nanopartículas de ARNip de FAM. Nuestros resultados mostraron que la presencia de FBS tuvo poco impacto en la eficiencia de la transfección. En este artículo, usamos MPEG-PCL para cubrir DOTAP, y DOTAP se incrustó dentro de MP con algunas partes dejadas en la superficie en una proporción adecuada. Con base en esta estructura, especulamos que las cargas positivas del DOTAP estaban parcialmente ocultas debido a la cubierta de MPEG-PCL, que disminuyó el nivel de exposición a proteínas séricas, por lo que se evitó el efecto del suero sobre la transfección. Implicaba que además de las cargas superficiales reducidas de los portadores catiónicos después de la modificación, la presencia de transfección de suero tenía poco efecto sobre la eficacia del portador de polímero catiónico. Debido a la excelente capacidad de transfección en el entorno del suero demostrada por las micelas de DMP in vitro, sugirió que el suero tenía poca afección por la entrega de ARNip mediada por DMP en un experimento celular in vitro.

Conclusión

En este estudio, las micelas de DMP preparadas tenían la capacidad de entregar ARNip. Y se utilizaron micelas de DMP para administrar ARNip de Bcl-xl y ARNip de Mcl1 en células C26 para el estudio de la actividad anticancerígena in vitro. Investigamos el proceso de preparación de las micelas de DMP y seleccionamos un excelente proceso de preparación para preparar las micelas de DMP con un tamaño estrecho, buen potencial zeta y excelente estabilidad. Además, las micelas de DMP preparadas no se vieron afectadas por la presencia del experimento de transfección in vitro de suero. Más importante aún, DMP / siBcl-xl y DMP / siMcl1 pueden inhibir la expresión del gen Bcl-xl y del gen Mcl1, induciendo la apoptosis de las células C26 y luego logrando un efecto terapéutico de inhibición del crecimiento de las células C26. La inyección intratumoral de complejo DMP / ARNip podría inhibir eficazmente el crecimiento del xenoinjerto subcutáneo del modelo de cáncer de colon C26. No se observaron cambios patológicos significativos en el corazón, hígado, bazo, pulmón o riñón. Se cree que las micelas de DMP pueden considerarse un portador eficaz para administrar ARNip para el tratamiento del cáncer de colon.

Abreviaturas

DOTAP:: N- [1- (2,3-dioleoiloxi) propil] -N, N, N-trimetilamonio metil sulfato
mPEG-PCL:: Metoxipoli (etilenglicol) Poli (caprolactona)
MTT:: Bromuro de 3- (4, 5-dimetiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolio
ARNip:: Pequeño ARN interferente

Impedancia de superficie de estructuras híbridas de grafeno / metauperficies Propiedades electrónicas y magnéticas de la monocapa defectuosa WSe2 con vacantes

Nanomateriales

Materiales poliméricos

Biologicos

Teñir

Especias