Sistema de administración de fármacos de doble respuesta fototérmica / pH de rGO modificado con HBP terminado en amino y la terapia quimio-fototérmica en células tumorales

Resumen

En este artículo, se propuso un método simple para preparar óxido de grafeno reducido hidrófilo (rGO) mediante la reducción de GO por polímero hiperramificado terminado en amino (NHBP), el NrGO preparado podría presentar una excelente dispersabilidad, absorbancia de luz en el infrarrojo cercano (NIR), fototermia capacidad de conversión y estabilidad. Luego, el clorhidrato de doxorrubicina (DOX) se conjugó con NrGO para preparar el sistema de carga de fármaco, y se caracterizó un comportamiento de administración de fármaco de doble respuesta fototérmica / pH. En un ambiente ácido o bajo irradiación con láser NIR, la velocidad de liberación del fármaco podría mejorarse, lo que es beneficioso para controlar la liberación del fármaco antitumoral en los tejidos tumorales. Además, los experimentos con células in vitro revelaron que NrGO era bien biocompatible, y en la parte de inhibición tumoral, en comparación con el grupo de control sin ningún tratamiento, DOX @ NrGO obtuvo una terapia sinérgica quimio-fototérmica eficiente, cuya tasa de inhibición fue mucho más alto que la quimioterapia única de DOX liberado. Por lo tanto, el DOX @ NrGO preparado obtuvo un gran potencial de aplicación en la terapia tumoral y un excelente candidato en otras aplicaciones biomédicas.

Introducción

La terapia fototérmica (PTT) bajo irradiación de infrarrojo cercano (NIR) ha atraído una creciente atención por la inhibición tumoral, debido al escaso efecto secundario y las propiedades invasivas mínimas [1]. La luz NIR (700 ~ 1100 nm) penetra más profundamente en el tejido corporal sin mucha absorción, ya sea sin dañar el tejido o las células sanas [2, 3]. Por lo tanto, bajo irradiación con láser NIR, el agente fototérmico puede elevar la temperatura en la ubicación implantada a través de su capacidad de conversión fototérmica. Además, el agente fototérmico aplicado requiere buena biocompatibilidad, eficacia de conversión fototérmica y estabilidad.

Para las investigaciones de los últimos años, se diseñaron y prepararon diversos materiales para curar tejidos tumorales como agentes PTT, como metales preciosos (nanobarras de oro [4], nanoplacas de oro [5]), nanomateriales semiconductores (CuS [6], MoS ₂ [7], FeS [8]), materiales orgánicos (polidopamina [9], nanopartículas de polipirrol [10]), nanomateriales de carbono (nanotubos de carbono [11], nanopartículas de carbono [12] y grafeno [13]). Como una especie de nanomaterial de carbono prometedor, el grafeno se usó ampliamente en la inhibición de tumores mediante el método PTT debido a sus nanohojas bidimensionales especiales, que obtienen una superficie específica ultra alta y un gran potencial para una alta eficiencia de carga de fármacos [14, 15]. Sin embargo, el óxido de grafeno reducido (rGO) preparado mediante métodos normales que incluyen urea e hidrato de hidracina, el proceso hidrotermal siempre muestra una alta hidrofobicidad, lo que no es beneficioso para el fenómeno de aplicación en agua del tejido corporal [16].

En este caso, propusimos una idea novedosa para utilizar un polímero soluble en agua con capacidad reductora para preparar rGO hidrófilo. En nuestro trabajo anterior, sintetizamos polímero hiperramificado terminado en amino (NHBP) y tratamos de usarlo para tratar nanopartículas de óxido metálico y preparar nanoesferas metálicas, que son altamente hidrofílicas sin aglomeraciones obvias, como las nanopartículas de plata modificadas con HBP y su aplicación en antiinflamatorios. -campo de bacterias [17, 18].

Con el fin de mejorar la capacidad de inhibición tumoral, los fármacos antitumorales suelen cargarse en agentes fototérmicos para fabricar un sistema cargado de fármaco [19]. Por un lado, el agente fototérmico puede presentar efecto PTT bajo irradiación láser NIR. Por otro lado, la temperatura elevada puede acelerar la velocidad de administración del fármaco debido a la velocidad mejorada de movimiento molecular. Por lo tanto, el agente fototérmico cargado de fármaco puede ejercer un efecto de terapia sinérgica quimio-fototérmica para la inhibición tumoral [20, 21]. En este documento, utilizamos HBP terminado en amino para preparar rGO hidrófilo (NrGO, Fig. 1), y se caracterizaron las propiedades fisicoquímicas así como la capacidad fototérmica. Posteriormente, se incorporó un fármaco antitumoral (doxorrubicina, DOX) en NrGO, luego se probaron in vitro el comportamiento de administración del fármaco en diferentes condiciones y la eficacia de inhibición tumoral.

Métodos / Experimental

Materiales

El óxido de grafeno (GO, 0,8 ~ 1,2 nm de grosor y 0,5 ~ 5 μm de ancho) fue suministrado por XFNANO Co., Ltd. Los DOX se adquirieron en HuaFeng United Technology Co., Ltd. Medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), fetal bovino suero (FBS), tripsina, penicilina (100 U / ml) y estreptomicina (100 μg / ml) se adquirieron de Thermo Fisher Scientific Inc. Metil tiazolil tetrazolio (MTT), 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI ) y yoduro de propidio (PI) se obtuvieron de Beyotime Biotechnology Co., Ltd. Todos los demás reactivos se compraron de Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. sin purificación adicional.

Preparación de polímero hiperramificado terminado en amino (NHBP)

El polímero hiperramificado terminado en amino se sintetizó como nuestro trabajo anterior [16]. Se añadió tetraetilenpentamina (94 ml, 0,5 mol) a un matraz de vidrio de fondo redondo y tres bocas de 250 ml equipado con protección de gas nitrógeno y agitación magnética. La mezcla de reacción se agitó con un agitador magnético calefactor y se enfrió con un baño de hielo, mientras se añadía gota a gota al matraz una solución de acrilato de metilo (43 ml, 0,5 mol) en metanol (100 ml). Luego, la mezcla se retiró del baño de hielo y se dejó en agitación durante 4 h más a temperatura ambiente. La mezcla se transfirió a un matraz en forma de berenjena para la evaporación rotatoria automática al vacío, y la temperatura se elevó a 150 ° C usando un baño de aceite, y se dejó por 4 h hasta que se obtuvo una escala de HBP viscosa amarillenta con un peso molecular promedio en peso de aproximadamente 7759. .

Preparación de GO reducido en NHBP (NrGO)

Primero se dispersó GO en agua desionizada y se mezcló por ultrasonidos con HBP apropiado (la relación en peso de GO y NHBP es 1:10, 1:20 y 1:30) durante 10 min, se mantuvo en agitación y se hizo reaccionar a 90 ° C durante 1 h. Luego, el resultante (marcado como NrGO-10, NrGO-20 y NrGO-30) se centrifugó y se lavó con agua desionizada tres veces.

Preparación de NrGO cargado con DOX (DOX @ NrGO)

La suspensión de NrGO preparada se dispersó en una solución de DOX con una relación en peso de 1:1 y se mantuvo en agitación durante 24 h a temperatura ambiente. Luego, la solución compuesta se centrifugó y se lavó para recolectar DOX @ NrGO.

Medidas

La morfología de la superficie se caracterizó mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM, JEM-2100, JEOL, Japón). Se realizó una espectroscopía de infrarrojos por transformada de Fourier (FTIR, Nicolet iS10, Thermo Scientific, América) para ilustrar el cambio de componente químico entre GO y NrGO. Todos los espectros se midieron en un rango de longitud de onda de 400 ~ 4000 cm ⁻¹ con una resolución de 4 cm ⁻¹ . El potencial de superficie y el tamaño de partícula se investigaron a través del analizador de tamaño de partícula de potencial Zeta (NanoBrook 90plus Zeta, Brookhaven, EE. UU.). La absorción de NrGO en la región NIR fue estudiada por UV-vis (Evolution 300, Thermo Fisher, EE. UU.) Con un rango de longitud de onda de 400 ~ 900 nm y una resolución de 1 cm ⁻¹ .

Las propiedades fototérmicas se midieron utilizando un dispositivo láser NIR (SFOLT Co., Ltd., Shanghai, China) y un termómetro termopar (DT-8891E, Shenzhen Everbest Machinery Industry Co., Ltd., China). La propiedad fototérmica de NrGO se midió con irradiación con láser de 808 nm. El área del punto del láser es de aproximadamente 0,25 cm ² , y el cambio de temperatura de la suspensión de la muestra probada se controló en tiempo real. Aquí, se aplicaron agua pura y suspensión de GO como grupos de control:(1) 0,2 ml de agua pura, GO y NrGO (NrGO-10, NrGO-20 y NrGO-30) suspensión se pusieron en un tubo Eppendorf de 0,25 ml, luego NIR El láser se irradió con una densidad de potencia de 1 W / cm ² durante 5 min; (2) Se irradió una suspensión de 0,2 ml de NrGO-30 con diferente concentración (100, 200 y 300 μg / ml) (1 W / cm ² ) durante 5 min; (3) Se irradiaron 0,2 ml de suspensión de NrGO-30 (200 μg / ml) con diferente densidad de potencia (1, 1,5 y 2 W / cm ² ) durante 5 min; (4) Se irradió una suspensión de 0,2 ml de NrGO-30 (200 μg / ml) (1 W / cm ² ) durante tres ciclos de encendido / apagado.

El DOX @ NrGO recolectado se dividió en tres grupos para diferentes tratamientos para investigar el comportamiento de administración del fármaco:(1) dispersión en solución de PBS con pH =7,4, marcado como grupo de control; (2) dispersar en solución de PBS con pH =4.0, marcado como grupo ácido; (3) dispersar en solución de PBS con pH =7,4 e irradiar con láser NIR, marcado como grupo NIR. Los tres grupos anteriores (cada grupo se estableció en tres paralelos) se colocaron en una bolsa de diálisis (5 ml) con un peso molecular de corte de 8000, y luego se colocaron en un tubo de centrífuga con 20 ml de la solución de PBS correspondiente. Después de eso, todos los tubos se colocaron en un agitador a 37 ° C con 100 rpm, se retiraron 10 ml de solución de PBS de cada tubo en puntos de tiempo predeterminados para el análisis de liberación del fármaco, y se volvió a agregar un volumen igual de PBS fresco correspondiente. Además, el grupo NIR se trató como si se irradiara luz NIR durante 5 minutos después de cada punto de tiempo predeterminado. Todas las soluciones extraídas se analizaron mediante espectrofotometría UV-vis y se obtuvo el perfil de administración del fármaco.

La citotoxicidad de NrGO contra células tumorales (HeLa) se investigó mediante ensayo MTT. Brevemente, las células HeLa se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 5 × 10 ³ células por pocillo y se mantuvo incubando hasta que se cubrió el 80% del pocillo. Luego, el medio antiguo se cambió por medio fresco con NrGO (3,125, 6,25, 12,5, 25 y 50 μg / ml), el medio sin NrGO se estableció como grupo de control. Después de incubar durante 24 y 48 h, se utilizó el ensayo MTT para medir la viabilidad celular relativa a través de la Eq. (1):

$$ \ mathrm {Celda} \ kern0.17em \ mathrm {viabilidad} \ left (\% \ right) =\ frac {{\ mathrm {OD}} _ {\ mathrm {muestra}}} {{\ mathrm {OD }} _ {\ mathrm {control}}} \ veces 100 \% $$ (1)

donde OD _muestra y OD _control representó la absorbancia medida de las células tratadas con NrGO en diferentes concentraciones y grupos de control, respectivamente.

Luego, se investigó la terapia sinérgica quimio-fototérmica mediante el tratamiento de células HeLa con DOX @ NrGO (3.125, 6.25, 12.5, 25 y 50 μg / ml) bajo irradiación NIR. Después de incubar con DOX @ NrGO durante 4 h, las células HeLa se irradiaron con láser NIR durante 5 min y se mantuvieron incubando durante otras 20 h. Posteriormente, se volvió a probar la viabilidad celular mediante el ensayo MTT. Para la observación de células, las células HeLa se tiñeron con DAPI y PI, respectivamente, y se observaron con CLSM y microscopio de fluorescencia.

Resultados y discusión

Caracterización física y química

Después de reaccionar con NHBP, la solución de GO se volvió negra de marrón, lo que indica que GO se redujo con éxito a rGO y se dispersó en agua. Como se muestra en la Fig. 2a, b, las imágenes TEM de GO y NrGO-30 se exhibieron respectivamente, mientras que no se descubrió ninguna crispación o aglomeración obvia en NrGO, lo que reveló que el tratamiento de HBP no causaría ningún cambio morfológico al reducir la reacción. Basado en los espectros FT-IR en la Fig. 3, la curva de transmitancia de NrGO-30 fue muy similar a la de NHBP. Significativamente, el pico a 1725 cm ⁻¹ de GO desapareció después de la reacción de reducción, que se sugirió que era la absorción de vibraciones de C =O del grupo carboxi [22]. De acuerdo con la estructura molecular del NHBP terminado en amino, el grupo amino reductor reaccionó con GO y se generó un nuevo pico FT-IR a 1633 cm ⁻¹ , que se supone que es C-N del enlace amido. El resultado del potencial zeta se presentó en la Fig. 4, obviamente, todas las muestras de NrGO fueron de potencial positivo mientras que GO fue negativo, lo que indica que el grupo carboxi de GO reaccionó con el grupo amino de HBP. Se utilizaron espectros UV-vis-NIR (Fig. 5) para ilustrar la absorción NIR de NrGO; las curvas de las muestras de NrGO con diferentes proporciones de materias primas mostraron una tendencia similar con una alta absorción en la región NIR, lo que es beneficioso para la aplicación en PTT. Mientras que la solución de GO y HBP apenas mostró absorción en la región NIR, lo que sugiere la fabricación exitosa de un agente fototérmico a partir de GO y NHBP. Además, también se midió el tamaño nanométrico de NrGO (Fig. 6), que no mostró un cambio obvio con el aumento de la relación NHBP.

Medición de propiedades fototérmicas

Basándose en la NrGO obtenida, se investigaron las propiedades fototérmicas bajo irradiación con láser de 808 nm. Como se muestra en la Fig. 7, las curvas de calentamiento del agua, GO y NrGO presentaron una tendencia diferente. La temperatura del agua pura casi no mostró crecimiento, y GO solo subió por debajo de 5 ° C, mientras que NrGO mejoró hasta 40 ° C y NrGO-20 y NrGO-30 incluso alcanzaron más de 45 ° C. NrGO podría absorber el láser NIR para desencadenar el comportamiento fototérmico, y la eficacia de conversión fototérmica se mejoró con el aumento de la proporción de HBP; por lo tanto, se eligió NrGO-30 para completar la siguiente investigación. Como se ilustra en la Fig. 7b, c, la temperatura alcanzada se elevó con la concentración de NrGO o el aumento de la potencia del láser, y este último factor se vio afectado más fuertemente. 41-43 ° C demostró ser apropiado en la inhibición de las células tumorales con poco efecto negativo sobre las células normales; por lo tanto, el NrGO preparado podría cumplir con el requisito de PTT en una dosis baja y polvo láser. Luego, se probó la estabilidad fototérmica y se mostró en la Fig. 7d, no hay una diferencia obvia después de tres ciclos de encendido / apagado. Así, NrGO obtuvo grandes propiedades fototérmicas en la región NIR. Para confirmar la estabilidad de absorción de NrGO antes y después de la irradiación con láser NIR, los espectros UV-vis se mostraron en la Fig. 8. Obviamente, la curva no cambió después de la irradiación NIR, revelando que la irradiación NIR no afectaría la absorción de NrGO.

Prueba de comportamiento de administración de medicamentos

Después de que se cargó DOX en NrGO, se llevó a cabo el experimento de administración del fármaco. Debido al entorno ligeramente ácido del tejido tumoral, se estudiaron la influencia de la irradiación NIR y el pH. En este documento, se aplicó PBS con pH de 7,4 o 4,0 para imitar el tejido normal o tumoral, respectivamente. Como se muestra en la Fig. 9, la velocidad de administración del fármaco se aceleró obviamente bajo un pH bajo y una irradiación NIR. Por un lado, el grupo amino de NrGO se ionizaría bajo un valor de pH bajo, luego la fuerza repulsiva entre DOX y los grupos amino ionizados mejoraría bajo condiciones de pH bajo, lo que aceleró la administración del fármaco y mostró sensibilidad al pH. Además, la buena solubilidad de DOX en condiciones de pH bajo también podría aumentar la velocidad de administración del fármaco [23]. Por otro lado, con la irradiación con láser NIR, se elevó la temperatura local y se aceleró la velocidad de movimiento molecular. Por lo tanto, el DOX @ NrGO era sensible al pH / fototérmico en el comportamiento de administración de fármacos, lo que es beneficioso para controlar la velocidad de administración de fármacos en el tejido tumoral y ejerce la terapia sinérgica quimio-fototérmica.

Citotoxicidad de NrGO

La biocompatibilidad es la propiedad básica requerida en biomateriales; por lo tanto, la citotoxicidad de NrGO con diferentes concentraciones se probó inicialmente durante un experimento in vitro mediante el ensayo MTT. Como se muestra en la Fig.10a, los resultados del ensayo MTT de 24 h indicaron que la viabilidad celular se mantuvo en más del 80% cuando la concentración de NrGO alcanzó 50 μg / ml, lo que puede demostrar que NrGO era bien biocompatible y se consideraba como un agente PTT biocompatible prometedor en tumores. inhibición.

Inhibición sinérgica de DOX @ NrGO en células tumorales

Basándose en la biocompatibilidad de NrGO, se estudió in vitro la eficacia de inhibición tumoral de DOX @ NrGO. Para examinar la influencia del comportamiento fototérmico, se irradió láser NIR en las células tumorales correspondientes durante 5 min con una densidad de potencia de 0,5 W / cm ² . Como se demuestra en la Fig. 10b, cuando las células tumorales se trataron con DOX @ NrGO durante 24 h, la viabilidad disminuyó obviamente con el aumento de la concentración, revelando que la DOX liberada podría inhibir la proliferación de células tumorales. Además, la viabilidad disminuyó mucho más rápidamente cuando también se aplicó la irradiación NIR, lo que indica que la temperatura elevada y la tasa de liberación de DOX podrían jugar una terapia sinérgica quimio-fototérmica.

Después de teñir con DAPI, las células se observaron bajo microscopía de barrido láser confocal (CLSM), el núcleo se tiñó de azul y las imágenes de diferentes tratamientos se mostraron en la Fig. 11a-c, respectivamente. Las células cultivadas con NrGO se extendieron (Fig. 11a) en la placa de cultivo con una gran cantidad, mientras que el número disminuyó cuando se trataron con DOX @ NrGO (Fig. 11b), revelando que la DOX liberada podría inhibir la proliferación tumoral. De manera significativa, las células tumorales en la región de exposición al láser NIR se destruyeron y cayeron de manera eficiente, lo que resultó en un área oscura en la imagen (Fig. 11c).

Además, se aplicó PI para observar la inhibición de las células tumorales después del tratamiento sinérgico quimio-fototérmico, que es una especie de colorante molecular pequeño para teñir las células muertas con fluorescencia roja. Como se muestra en la Fig.12, rara vez se observaron células muertas (punto rojo en la imagen) en la Fig.12a cuando no se llevó a cabo ningún tratamiento, mientras que después del tratamiento quimio-fototérmico, las células tumorales fuera de la región de exposición sufrieron el daño de DOX y alta temperatura para reducir aún más la viabilidad celular (Fig. 12b). Según los resultados anteriores, se demostró que DOX @ NrGO era un candidato deseado para la terapia tumoral.

Conclusiones

En resumen, se diseñó y preparó con éxito una nueva NrGO hidrófila mediante una reacción simple de GO y HBP terminada en amino. La caracterización variada mostró que NrGO obtuvo una propiedad fototérmica estable y sobresaliente. Después de la carga de DOX, la administración del fármaco presentó pH y un comportamiento fototérmico de doble respuesta, que podría acelerarse a un valor de pH bajo e irradiación NIR. Además, el resultado del experimento citotóxico in vitro mostró que la NrGO preparada era bien biocompatible. Debido a la ventaja, las células tumorales podrían inhibirse de manera efectiva en base a la terapia sinérgica quimio-fototérmica, y la NrGO cargada con fármacos antitumorales obtuvo una aplicación prometedora en la terapia tumoral.

Abreviaturas

CLSM:: Microscopía de escaneo láser confocal
DAPI:: 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol
DOX:: Doxorrubicina
DOX @ NrGO:: NrGO cargado con DOX
FTIR:: Infrarrojos por transformada de Fourier
GO:: Óxido de grafeno
HBP:: Polímero hiperramificado
MTT:: Metil tiazolil tetrazolio
NHBP:: HBP terminado en amino
NIR:: Infrarrojo cercano
NrGO:: Óxido de grafeno reducido con polímero hiperramificado terminado en amino
PI:: Yoduro de propidio
PTT:: Terapia fototérmica
rGO:: Óxido de grafeno reducido
SEM:: Microscopía electrónica de barrido
TEM:: Microscopio electrónico de transmisión

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