Nanoscopía basada en microscopía de fuerza atómica de células madre derivadas de tejido adiposo humano que se diferencian condrogenicamente:nanoestructura e integrina expresión β1

Características de la morfología de hADSc durante la condrogénesis. un Se obtuvieron imágenes morfológicas de hADSc completo a los 0, 6 y 12 días de diferenciación condrogénica. Las imágenes se analizaron mediante un modelo de imagen de error de fuerza máxima y altura mediante un nanoscopio. b Se midió la relación longitud / ancho promedio de las células después del tratamiento de diferenciación condrogénica a los 0, 6 y 12 días. * p <0.05, ** p <0.01

Características de la ultraestructura de la membrana hADSc durante la diferenciación condrogénica. un Los cambios en la ultraestructura de la membrana celular se evaluaron después de la diferenciación condrogénica durante 0, 6 y 12 días. b Los parámetros de rugosidad de la superficie Ra y Rq de las células se midieron durante la inducción condrogénica de hADSc durante 0, 6 y 12 días

Como se muestra en la Fig. 2a, la ultraestructura de la membrana celular también cambió; las partículas se agrandaron y fueron heterogéneas. Estudios anteriores demostraron que Ra y Rq fueron los creadores del valor de rugosidad para evaluar el cambio en las membranas celulares tratadas de manera diferente [22]. Rq trata sobre la rugosidad de la raíz cuadrada media, \ (\ mathrm {Rq} =\ sqrt {\ frac {\ sum_ {t-1} ^ N {\ left (Zn- \ overline {Z} \ right)} ^ 2 } {N-1}} \); \ (\ mathrm {Rq} =\ sqrt {\ frac {\ sum _ {\ mathrm {t} -1} ^ {\ mathrm {N}} {\ left (\ mathrm {Zn} - \ overline {\ mathrm {Z }} \ right)} ^ 2} {\ mathrm {N} -1}}; \) Ra tiene una rugosidad promedio, \ (\ mathrm {Ra} =\ frac {1} {N} {\ sum} _ { t-1} ^ N1 \ mid Zi- \ overline {Z} \ mid \). Para obtener la rugosidad, el tamaño de escaneo es de 10 μm × 10 μm. Como se muestra en la Fig. 2b, tanto el Ra como el Rq de dos áreas diferentes aumentaron durante la condrogénesis de hADSc. Los valores de Ra y Rq de las células en el día 0 eran bajos, lo que indica una superficie lisa (Fig. 2b). Los valores de Ra y Rq aumentaron simultáneamente con la diferenciación condrogénica, mostrando una mayor heterogeneidad y más rugosa en las superficies celulares (Fig. 2a). Según los cambios observados, la diferenciación condrogénica dio como resultado la morfología celular y cambios en la relación altura / ancho de la célula (Fig. 1a, b). Hay estudios que muestran que la ECM podría regular la adhesión celular mediante la regulación de las integrinas [11]. Por lo tanto, el aumento de los valores de rugosidad sugirió cambios en la ECM y la ultraestructura de la membrana celular durante la condrogénesis. Estos datos demuestran que la diferenciación condrogénica afecta la morfología celular, la ECM y la estructura de la membrana celular.

Cambios citoesqueléticos durante la inducción condrogénica de hADSc

Durante la diferenciación de las células madre, la morfología celular y los cambios estructurales de la membrana están relacionados con el citoesqueleto de la célula, después del desarrollo de características celulares específicas del linaje [21]. Como se muestra en la Fig. 3a, las señales de fluorescencia roja y azul indican respectivamente F-actina y DAPI. El citoesqueleto celular cambió mucho durante la inducción condrogénica en la Fig. 3a. Por un lado, los microfilamentos del citoesqueleto fueron a lo largo del eje celular largo en el grupo del día 0, mientras que los microfilamentos del citoesqueleto se extendieron en una matriz radial cuando las hADSc se trataron con diferenciación condrogénica durante 12 días. Por otro lado, la distribución de los microfilamentos celulares fue homogénea en el grupo del día 0, pero los microfilamentos se distribuyeron principalmente en la periferia de hADSc tratados con diferenciación condrogénica durante 12 días.

Organización del citoesqueleto y ubicación de la integrina β1 en hADSc que se diferencian condrogenicamente. un Se detectaron cambios en el citoesqueleto durante la condrogénesis de hADSc mediante microscopía confocal. b La ubicación de la integrina β1 se midió durante la diferenciación condrogénica mediante microscopía confocal. El citoesqueleto y el núcleo se tiñeron con F-actina y DAPI, respectivamente. Las señales de fluorescencia roja y azul indican respectivamente F-actina y DAPI

La diferenciación condrogénica cambió la probabilidad de unión de la integrina β1 a los receptores en hADSc

El AFM también es una herramienta útil para el estudio de la fuerza de unión entre los ligandos y sus receptores, lo que aclara la transducción de la señal del receptor de la membrana en la superficie celular [23]. Mediante AFM, los cambios entre la integrina β1 y sus receptores se miden de forma visual, simple y específica. La interacción del receptor-ligando de la integrina β1 en las células vivas es una forma de explorar el proceso de unión en la membrana celular. El procedimiento para la funcionalización de la punta de AFM es el acoplamiento de la integrina β1 a las puntas de AFM mediante la unión de APTES y glutaraldehído. Estas puntas se usaron para la detección de la unión de la integrina β1 a los receptores CD29 en las superficies celulares (Fig. 4a). Se utilizó espectroscopia de fuerza de molécula única (SMFS) para evaluar la distribución de la fuerza de separación de células vivas antiintegrina β1 dentro de regiones localizadas de hADSc vivas individuales (Fig. 4b). Las curvas de fuerza representativas se muestran en la Fig. 4c, d, que representan una curva de una sola molécula (Fig. 4c) y dos pares de curvas de pico de ruptura (Fig. 4d). Se realizaron experimentos de bloqueo y experimentos con puntas de AFM desnudas para verificar la especificidad de las curvas de fuerza obtenidas. Las puntas de AFM desnudas no detectaron un pico de fuerza específico (Fig. 4e). Los experimentos de AFM desnudos mostraron que la probabilidad de unión inespecífica de la interacción ligando-receptor de la integrina β1 en la superficie de hADSc era inferior al 1%. Para los experimentos de bloqueo, el anticuerpo anti-integrina β1 se incubó con células durante 30 min y luego se registraron las curvas de fuerza usando puntas funcionalizadas con integrina β1. El anticuerpo de bloqueo redujo las curvas de fuerza en un 90% (Fig. 4f). No hubo diferencia en la probabilidad de unión del ligando-receptor de la integrina β1 en las superficies celulares entre los tres grupos después del tratamiento con anticuerpos anti-integrina β1 (Fig. 4g). Estos resultados demuestran que las puntas de AFM modificadas con anticuerpos fueron muy útiles para detectar la fuerza y ​​que las puntas de AFM funcionalizadas con integrina β1 eran específicas.

Medidas de fuerza de AFM con punta de AFM funcionalizada con integrina β1 en hADSc vivo. un Representación esquemática de la estrategia utilizada para la inmovilización de la integrina β1 en una punta de AFM. b Representación esquemática de la fuerza de una sola molécula medida entre las puntas de AFM funcionalizadas con integrina β1 y hADSc vivo. c, d Curvas de fuerza representativas obtenidas con puntas de AFM modificadas con integrina β1 en hADSc y e después de que el sistema se bloqueó con la solución de anticuerpo monoclonal de integrina β1. f La probabilidad de unión de las puntas funcionalizadas con integrina β1 en hADSc antes y después del bloqueo por el anticuerpo de integrina β1 en el día 0. g La probabilidad de unión de puntas funcionalizadas con CD29 en hADSc después del bloqueo por el anticuerpo de la integrina β1 a los 0, 6 y 12 días. *** p <0.001, n.s .. sin diferencia significativa

La fuerza de unión (fuerza de ruptura) es la fuerza de interacción entre los ligandos y sus receptores [24]. Los cambios en la morfología y la ultraestructura de la superficie de las membranas plasmáticas están relacionados con muchos procesos de la biología celular, como la diferenciación, la apoptosis y la migración celular. Durante la diferenciación, se cree que los cambios en el citoesqueleto están relacionados con los cambios de la integrina, especialmente la integrina β1. La integrina β1 (CD29) es muy importante en la adhesión celular a la ECM y en la adhesión célula-célula. También puede interactuar con proteínas intracelulares, estimulando moléculas de señalización relacionadas con el citoesqueleto de actina [25]. En este estudio, se observaron cambios en la morfología celular y citoesquelética durante la condrogénesis de hADSc mediante microscopía de barrido láser confocal (CLSM) y AFM. Durante la diferenciación condrogénica, los cambios en el citoesqueleto, la morfología y la ultraestructura de la superficie pueden ser un indicador nuevo y confiable del estado celular. La integrina β1, el receptor CD29, se distribuye sobre la superficie celular según se juzga por inmunofluorescencia (Fig. 3b). La fuerza de unión y la estabilidad de los complejos ligando-receptor de la integrina β1 durante la condrogénesis de hADSc se evaluaron a los 0, 6 y 12 días de diferenciación. Se registraron un total de 1200 curvas por día, con fuerzas de ruptura promedio de 61,8 ± 22,2 pN, 60 ± 20,2 pN y 67,2 ± 22,0 pN, respectivamente (fig. 5a-c). La distribución de la magnitud de la fuerza se analizó como fuerza media + SD (figura 5d). No hubo diferencia significativa en la media de fuerza entre los días 0 y 6. Hubo una diferencia en la media de fuerza entre los días 0 y 12. La magnitud de la fuerza de unión aumentó el día 12. Mientras tanto, eventos de ruptura a los 0, 6 y 12 días fueron, respectivamente, 19,58 ± 1,74%, 28,03 ± 2,05% y 33,4 ± 1,89% (Fig. 5e). La mayor probabilidad de unión también indicó que la integrina β1 (CD29) jugó un papel importante en la diferenciación condrogénica y puede proporcionar la información para la diferenciación condrogénica, a través de vías de señalización. Por tanto, el aumento de los nanodominios β1 de la integrina durante la diferenciación condrogénica puede afectar fundamentalmente la fuerza de unión del ligando-receptor CD29 en hADSc vivo. Los cambios en la morfología y la ultraestructura de la superficie de las membranas plasmáticas acompañaron a los cambios en la estructura, conformación, fuerza de unión y estabilidad de la proteína de la integrina β1 en las células. En resumen, la integrina β1 juega un papel necesario en la diferenciación condrogénica de hADSc.

Fuerza de unión y probabilidad de unión medidas en la superficie de hADSc vivo mediante puntas de AFM funcionalizadas con integrina β1. a – c Histogramas de la fuerza de unión del anticuerpo-receptor de la integrina β1 obtenidos durante la diferenciación condrogénica de hADSc durante 0, 6 y 12 días. d Las fuerzas de unión para los receptores de integrina β1 se obtuvieron a los 0, 6 y 12 días de diferenciación condrogénica de hADSc. e La probabilidad de unión del receptor de integrina β1 se detectó durante la diferenciación condrogénica de hADSc durante 0, 6 y 12 días. * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0,001, n.s. sin diferencia significativa

Regulación al alza de la integrina β1 durante la diferenciación condrogénica de hADSc

Numerosos estudios han demostrado que los miembros de la familia de las integrinas juegan un papel importante en la diferenciación celular. Además, las integrinas pueden regular la interacción entre el entorno extracelular y las células, controlando las vías de transducción de señales a través de proteínas conectadas [26]. Estudios anteriores han demostrado que la probabilidad de unión puede verse afectada por la densidad y conformación de la proteína transmembrana (receptores) en la superficie celular [27]. La conformación de integrina puede ser un casco cerrado, que tiene baja afinidad por el ligando, o un casco abierto, que tiene una alta afinidad por el ligando [28, 29]. La expresión de la integrina β1 se reguló positivamente tanto a nivel transcripcional como traduccional con una expresión aumentada de colágeno II, característica de los condrocitos (Fig. 6a, b). Como tal, la expresión de integrina β1 regulada positivamente fue consistente con una mayor probabilidad de unión sin tener en cuenta la conformación.

The role of integrin β1 and β-catenin/SOX pathway in regulating hADSc chondrogenic differentiation. un Protein integrin β1 was up-regulated during chondrogenesis of hADSc as assessed by western blotting. Cartilage differentiation up-regulated collagen II expression at different days. b The mRNA of integrin β1 was up-regulated during chondrogenic differentiation of hADSc. c Measurement of proteins associated with the β-catenin/SOX pathway during chondrogenic differentiation of hADSc for 0, 6, and 12 days. * p <0.05, ** p  < 0.01

The Role of Integrin β1 in Chondrogenic Differentiation Regulated by the β-catenin/SOX Signaling Pathway

Previous studies have shown Wnt/β-catenin, PI3K, and mTOR signaling pathways to be related to integrin β1 [30,31,32]. Each is important in mesenchymal stem cell differentiation. Likewise, studies have demonstrated SOX and collagen II to be regulated by integrin β1 during chondrogenesis of hADSc. SOX is a hallmark component of the Wnt/β-catenin signaling pathway. Hence, we hypothesized that chondrogenic differentiation was regulated by the β-catenin/SOX pathway via integrin β1. SOX, GSK-3β, β-catenin, and integrin β1 were all increased during chondrogenesis of hADSc (Fig. 6c), with integrin β1 inducing cell signaling. These data demonstrate chondrogenic differentiation to be regulated by the β-catenin/SOX pathway via integrin β1.

Prospective and Limitations

In this work, changes in cellular morphology, the structure of the membrane, and the binding probability of integrin β1 ligand–receptors were demonstrated to be useful image markers to evaluate the chondrogenic differentiation process. This is a new method for evaluation of morphology, membrane ultrastructure, and changes in transmembrane proteins during chondrogenic differentiation. There are limitations to this study. Although increased binding probability was related to the high expression of integrin β1, the conformation of integrin β1 during chondrogenesis was not investigated. Further work is necessary to determine the conformation of integrin β1 during chondrogenic differentiation. Integrin β1 was demonstrated to participate in the β-catenin/SOX signaling pathway during chondrogenesis of hADSc. However, the relationship between integrin β1 and β-catenin/SOX signaling pathway is still not fully established. Further work is necessary to identify the exact role of integrin β1 in this pathway.