Influencia de los nanotubos de carbono y sus derivados en las células tumorales in vitro y parámetros bioquímicos, composición de la sangre celular in vivo

Resumen

El objetivo del trabajo propuesto fue analizar la toxicidad de los nanotubos de carbono oxidados (CNTox), funcionalizados por doxorrubicina (CNT-Dox) y fluoresceína (CNT-FITC) a nivel celular y de organismo. El efecto citotóxico de CNTox, CNT-Dox y CNT-FITC se analizó en células tumorales in vitro (cultivos 2-D, 3-D) y en modelos de ratones Balb2 / c in vivo. Como resultado, se demostró la posibilidad de inmovilización de doxorrubicina en la superficie de CNT y liberación controlada de doxorrubicina (Dox) desde la superficie de CNT. La inmovilización de Dox coincidió con la disminución del efecto citotóxico CNT-Dox en comparación con Dox libre. La ruptura de los enlaces peptídicos con la superficie de CNT condujo a la liberación de doxorrubicina y al aumento dependiente de la dosis del efecto citotóxico de los CNT y Dox. Se demostró el efecto citotóxico combinado de los CNT, Dox y tripsina sobre la supervivencia de las células tumorales. A nivel de organismo, se investigó el efecto de las nanoestructuras obtenidas sobre el estado del sistema enzimático hepático, el metabolismo proteico y la composición sanguínea celular de los animales de experimentación. La influencia de CNTox en el modelo in vivo fue estadísticamente la misma que la del control. CNT-Dox demostró un efecto tóxico para el organismo total más bajo en comparación con la doxorrubicina pura. Las desviaciones en la composición de la sangre de las células indicaron un efecto tóxico general de CNT-Dox, pero fue más moderado en comparación con la doxorrubicina pura. A partir de los datos obtenidos, llegamos a la conclusión de que la unión de los NTC con la doxorrubicina permite reducir la toxicidad de la doxorrubicina sobre los indicadores bioquímicos generales de la sangre y las violaciones en la composición de las células sanguíneas in vivo. Al mismo tiempo, el efecto combinado de los CNT y la doxorrubicina después de la liberación del fármaco nos permitió lograr una mayor eficacia en la supresión del crecimiento tumoral in vitro.

Antecedentes

Una de las aplicaciones más llamativas y prometedoras de los nanotubos de carbono es la medicina. Los nanotubos de carbono (NTC) se caracterizan por propiedades químicas y biológicas únicas [1, 2, 3, 4, 5]. Los CNT tienen una gran superficie que les permite unir una amplia gama de sustancias biológicas [6]. Además, los NTC pueden penetrar a través de las membranas celulares, los capilares y acumularse en las células y los tejidos [7,8,9]. Los CNT son absorbidos fácilmente por las células y promueve la capacidad de los CNT para alcanzar los núcleos celulares e implica la posibilidad de una terapia génica [10]. Es por eso que los NTC son vehículos atractivos para el transporte de proteínas, antígenos, vectores de ARN / ADN [11], vacunas y fármacos al interior de las células [12]. Hay un interés particular en las perspectivas de uso de los NTC como transportadores personalizados con liberación controlada de fármacos para la terapia anticancerosa [13], antibacteriana [14] e inmunológica [15]. La administración dirigida y la liberación controlada es el problema real del uso moderno de fármacos, especialmente con propiedades citotóxicas. El mecanismo exacto de liberación del fármaco asegura una concentración eficaz del principio activo en el tejido diana con una concentración mínima en otros. Reduciría la dosis del fármaco manteniendo su eficacia y disminuyendo el daño por efectos secundarios. Actualmente, existen varias formas de administración intencionada de fármacos, como la administración mediante liposomas [16], micelas poliméricas y dendrímeros [17], partículas biodegradables [18] y otras nanopartículas [19]. Pero experimentos recientes han demostrado muchos beneficios del uso de CNT en la administración de fármacos en comparación con otras nanopartículas [20, 21]. Uno de ellos son los CNT con una superficie bastante grande y activa que puede llenarse con la sustancia química deseada, que van desde moléculas pequeñas hasta proteínas, anticuerpos y ARN / ADN. Los extremos abiertos de los CNT hacen que el volumen interior y la superficie sean accesibles para la funcionalización. Por lo tanto, la gran superficie de los CNT proporciona muchos sitios de unión para diferentes tipos de funcionalización. Al mismo tiempo, con las perspectivas de los NTC, existen algunos problemas con la baja solubilidad de los NTC, la capacidad de agregación, las cualidades hidrófilas, la vida media prolongada y la influencia en todo el organismo [22]. Según la literatura, la introducción de CNT en el cuerpo de animales de experimentación se acompaña de acumulación de CNT y sus derivados en los órganos del tracto digestivo, el bazo, los riñones [23], los músculos [24] y el tejido pulmonar [25]. . En el siguiente paso, los NTC influyen en la actividad de los procesos metabólicos e inflamatorios [25, 26], el estado del sistema inmunitario [27] y la supervivencia de los animales de experimentación [28]. Sin embargo, estos problemas son objeto de una investigación activa para seguir avanzando en el uso de nanotubos de carbono. Las ventajas de los CNT como nanovectores para la administración de fármacos se han demostrado de manera convincente en varios estudios. Los autores de [29, 30] informaron que los nanotubos específicos pueden ser menos dañinos que los nanoportadores de medicamentos. También se ha demostrado que la funcionalización simple (-OH, -COOH, -NH, PEG) [31] o la encapsulación de los NTC [22] aumenta la solubilidad en agua, mejora la biodisponibilidad y reduce la toxicidad de los NTC. Y la introducción de CNT en ratones con un tumor trasplantado puede ser eficaz contra el tejido transformado dirigido y condujo a la disminución del volumen del tumor y al aumento de la supervivencia de los animales [32].

En base a investigaciones previas [33], asumimos que la sustancia antitumoral activa (doxorrubicina) podría inmovilizarse en la superficie de los enlaces peptídicos de nanotubos de carbono. El compuesto resultante, nanotubos de carbono que fueron funcionalizados por doxorrubicina (CNT-Dox), podrían reducir las propiedades citotóxicas de CNT como doxorrubicina (Dox). Al mismo tiempo, la desintegración de la construcción tratada puede permitir realizar las propiedades citotóxicas CNT y Dox. De este modo, es posible conseguir incrementar la actividad antitumoral de ambas sustancias. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue determinar el efecto citotóxico de la construcción CNTs-Dox en presencia de proteasa (tripsina) in vitro. Analizamos el impacto de los CNT y sus derivados sobre las células tumorales en modelo celular 2D y 3D, in vitro. El otro objetivo fue investigar la influencia de los compuestos obtenidos (CNT, CNTox y CNT-Dox) sobre la actividad del sistema enzimático hepático, el recambio de proteínas y la composición de la sangre celular in vivo. Entonces, los autores realizaron una estimación compleja de la toxicidad, biodisponibilidad y efectividad del uso de CNT y sus derivados contra tumores del tracto gastrointestinal.

Métodos

La línea celular de carcinoma de grado II de adenocarcinoma de colon caucásico (HT29) se utilizó como modelo celular experimental en el sistema 2D (monocapa) y 3D (esferoide) in vitro. La línea se compró del Banco de líneas celulares y tejidos de animales Kavetsky 'Instituto de patología experimental, oncología y radiobiología NAS Ucrania. Las células se manipularon en condiciones estándar de cultivo celular (95% de humedad, 5% de CO ₂ en aire; 37 ° C) en medio completo DMEM con FBS al 10% bajo nivel de contención de laboratorio 2.

Síntesis, oxidación y funcionalización de CNT

Los nanotubos de carbono de paredes múltiples iniciales (MWCNT) se obtuvieron por deposición química de vapor (propileno e hidrógeno con Mo / Fe / Al ₂ O ₃ como catalizador). Los MWCNT sintetizados tenían de 10 a 30 capas, diámetro interno de 5 a 15 nm, diámetro externo de 10 a 60 nm, longitud de 20 a 500 μm, área de superficie específica 120 m ² / gy densidad aparente 5-50 g / l [33].

La purificación de los MWCNT del metal / catalizador se realizó mediante tratamiento con HF. La eliminación del carbono amorfo de los nanomateriales de carbono se realizó mediante oxidación en aire a 450–500 ° C. La muestra bruta que contenía MWCNT reaccionó con el oxígeno del aire y creó dióxido de carbono o monóxido de carbono. Se ha obtenido una cierta cantidad de depósito de carbono después de que la disolución de HF (agua) del soporte del catalizador se oxidara en aire a 450–500 ° C. Se utilizó un reactor tubular de cuarzo de flujo de aire para este procedimiento durante 130-150 min. Analizamos y describimos las características físicas y químicas de los MWCNT obtenidos en trabajos anteriores [33].

Se utilizó espectroscopía electrónica de barrido (SEM) de MWCNT (JEOL SL6060LA, Japón) para determinar las características estructurales de los MWCNT. Después de la inmovilización de los ligandos, la morfología no cambió.

Oxidación de MWCNT

En el siguiente paso, los nanotubos de carbono purificados (CNT) se oxidaron en 70% de HNO ₃ a 99 ° C durante 4 hy luego se lava con agua destilada y NH ₄ al 10% Solución de OH durante 12 h. Como resultado, se sintetizaron óxidos de nanomateriales de carbono MWCNTox (CNTox). Después de eso, los CNT se lavaron tres veces con dH ₂ O a pH neutro. Los sitios ácidos en la superficie de CNT se regeneraron con una solución de HCl 0,1 M. Los CNT oxidados resultantes se separaron por centrifugación, se enjuagaron ampliamente y se resuspendieron en dH ₂ Oh agua.

Preparación de partículas CNT-Dox

La tarea del siguiente paso fue inmovilizar el clorhidrato de Dox (Dox, Teva Nederland B.V, Países Bajos) en la superficie de las partículas de MWCNT. Para funcionalizar las superficies de los CNT oxidados (200 mg) con amino que contiene Dox-lactosa monohidrato, se incubaron con un agente de enlace bifuncional — N-ciclohexil-N ′ - (2 morfolinoetil) carbodiimida meto-p-toluenosulfonato (C 1011, Sigma Aldrich , EE.UU.) durante 15 min a temperatura ambiente (Fig. 1a). Después de eso, se añadieron 100 mg de DOX-lactosa monohidrato en 10 ml de tampón fosfato 0,15 M pH 6,5 a cada material nanocarbonado. Se dejó reaccionar la mezcla a 30 ° C durante 24 h. En tales condiciones, se formaron enlaces covalentes entre Dox y CNT (Fig. 1b). La composición se recogió por centrifugación a 10.000 rpm durante 15 min y se lavó con dH ₂ Oh tres veces. Los sobrenadantes se utilizaron para detectar la concentración de DOX libre mediante espectrofotómetro. La inmovilización de FITS en la superficie de CNT se proporcionó mediante el esquema que se muestra en la Fig. 2a, b.

un Esquema de reacción de los NTC con carbodiimida. b Esquema de funcionalización de los NTC por doxorrubicina

un Esquema de reacción de los NTC con urea. b Esquema de funcionalización de los CNTs por FITC

Preparación de suspensiones estables de MWCNT

La suspensión coloidal de MWCNT se llevó a cabo en dos etapas. En la primera etapa, los nanomateriales de carbono se sometieron a un tratamiento ultrasónico en tampón fosfato salino (PBS) utilizando un dispersor ultrasónico UZDN — 2 T. Los modos de procesamiento fueron I =10 mA, R =22 kHz, duración:30 min. En la segunda etapa, el hidrosol resultante se dispersó por centrifugación a temperatura ambiente. El proceso incluye varios ciclos de centrifugación. Entonces, la fracción de SWCNTs de disolución hidrófila se seleccionó de esta manera. Antes de añadir a la suspensión las células cultivadas, se esterilizaron las soluciones de MWCNT hirviéndolas durante 30 min. Se esterilizaron derivados de CNT (CNT-Dox y CNT-FITC) mediante una concentración de 100 veces de PSGA (penicilina:estreptomicina:gentamicina:anfotericina).

Potencial Zeta de las suspensiones de nanotubos

El potencial zeta de las muestras se midió mediante dispersión de luz electroforética (M3-PALS). Para las mediciones se utilizó el analizador Zetasizer Nano ZS, fabricado por Malvern Instruments (Malvern, Reino Unido). Los experimentos se llevaron a cabo a 25 ° C con siete repeticiones. Para medir las muestras, se utilizó un electrodo sumergible universal (Universal Dip Cell) ZEN1002 y cubetas de poliestireno (DTS001), una fuente de luz, un láser H-Ne de 633 nm.

Espectroscopia FTIR

La composición química de los nanomateriales obtenidos se investigó mediante espectroscopía de infrarrojos por transformada de Fourier (FTIR). Los espectros de IR se determinaron mediante el espectrómetro FTIR Varian FTS 7000e. Las muestras para el análisis se prepararon triturando en un molino una mezcla de ~ 1 mg de CNT y 150 mg de KBr espectralmente puro. Las muestras se prepararon utilizando una prensa con una fuerza de presión de 3,0–3,5 × 10 ³ kg / cm ² . Las muestras se deshidrataron calentándolas a una temperatura de 600 ° C durante 60 min. Los espectros de pre-disparo de KBr se obtuvieron de forma preliminar, después de eso se restaron de los espectros de las muestras. Todos los espectros se analizaron según el catálogo de Identificación espectrométrica de compuestos orgánicos [34]. A modo de comparación, se utilizaron muestras de MWCNT oxidados (CNT-O), MWCNT funcionalizados por doxorrubicina (CNT-D) y MWCNT funcionalizados por marcador fluorescente (CNT-F). Todo el procesamiento y las condiciones, de muestras y concentración, fueron los mismos para tres materiales.

Ensayo colorimétrico de liberación de doxorrubicina de la superficie de CNT

Para evaluar la cantidad de Dox libre después de la inmovilización en CNM y la eficacia de la liberación de Dox, se utilizó la capacidad de Dox libre de fluorescencia a una longitud de onda de 495 nm [35]. La concentración activa de Dox en clorhidrato de Dox fue de 16,7% w / w . Con el fin de dibujar las líneas de calibración, Dox Teva 20 mg / ml con diez diluciones a 8 × 10 ⁻³ Se utilizó mg / ml. Luego, se midió la fluorescencia de Dox libre en el sobrenadante de los complejos DOX con CNT mediante un lector de placas espectrofotométrico Multiscan (Labsystem, Finlandia).

Concentración de grupos funcionales en partículas CNT-DOX, CNT-FITC

Para inmovilizaciones Dox, 1 g de MWCNT en 1 ml de dH ₂ O se utilizó. La cantidad de Dox-TEVA fue de 100 mg de (16,7 mg de Dox activo) en 1 ml de dH ₂ O. La cantidad de Dox libre en el sobrenadante después de la reacción fue de 0,37 mg o 2,2% de las sustancias activas. Por tanto, llegamos a la conclusión de que se inmovilizaron 16,23 mg de DOX en 1 g de CNTox. Para FITC, el porcentaje de inmovilización fue bajo. Luego, se inmovilizaron 8,35 mg de FITC en 1 g de CNTox en 1 ml de dH ₂ O. La eficacia de la funcionalización fue del 1,62% w / w para CNT-DOX y 0,84% w / w para CNT-FITC. Los cálculos adicionales de las concentraciones CNT-Dox y CNT-FITC se basan en estos datos.

Ensayo citotóxico de derivados de CNT en modelos de células 2-D y 3-D

Se evaluó la citotoxicidad de Dox, CNT, CNT-FITC y CNT-Dox frente a células tumorales HT29 utilizando un ensayo MTT. Prueba MTT basada en la conversión de sales de 3- [4,5-dimetltiazol-2] -2,5-difeniltetratetrazolio en cristales de formazán por enzimas oxidorreductasa mitocondrial dependientes de NAD (P) H en células vivas. El protocolo fue descrito por T. Mosmann [36]. En resumen, 1 × 10 ⁴ Se sembraron HT29 en placas de 96 pocillos y se cultivaron en medio de cultivo completo durante 12 h. Luego, el medio de cultivo actual se reemplazó por medio de cultivo que contenía CNTox (muestra n. ° 1), MWCNT (muestra n. ° 2), CNT-Dox (muestra n. ° 3), Dox (muestra n. ° 4) y CNT-FITC (muestra n. ° 5) . Las concentraciones de las muestras n. ° 1, 2, 3, 5 fueron de 12,5–25–50–100–200 μg / ml, la concentración de stock de la muestra n. ° 4 fue de 20 μg / ml, la concentración final de 1 a 10 μg / ml. Las células se cultivaron en medio completo y se usaron como control. Después de 24 h de incubación, las células se analizaron con MTT mediante ensayo colorimétrico. A 100 l de suspensión de células, agregamos 20 l de solución de MTT (5 mg / ml de PBS, Sigma). Posteriormente, las células se incubaron con MTT durante 4 h en condiciones estándar. Luego, las muestras se centrifugaron a 1500 g, durante 5 min, y se extrajo el sobrenadante. En total, se añadieron a los pocillos 10 µl de DMSO (Sigma) para la dilución de cristales de MTT y 20 µl de glicina 25 mM. La absorbancia de la solución reaccionada se midió a 540 nm en un lector de placas espectrofotométrico Multiscan (Labsystem, Finlandia).

Generación de esferoides tumorales multicelulares

El esferoide tumoral multicelular de células HT29 (MTS) (cultivo 3D) como sistema modelo de micrometástasis tumoral se cultivó mediante un método bien establecido que se describió anteriormente [33]. Brevemente, la suspensión de células se contó con azul tripán y se plantó un número igual de células (5 × 10 ⁴ células / ml). El cultivo de células 3D se mantuvo en medio DMEM (Sigma, EE. UU.) Con FBS al 10% (Sigma, EE. UU.) En condiciones estándar (95% de humedad, 5% de CO ₂ en aire, 37 ° C). La generación de MTS se realizó mediante tecnología desarrollada en nuestro laboratorio. El cultivo de células tumorales se mantuvo durante 24 h en placas de 24 pocillos recubiertas con agar al 1% en medio de cultivo con 0,24% de carboximetilcelulosa. Para investigar la dependencia del tamaño y el número de MTS de la concentración y el tipo de CNT, se generó MTS en presencia de diversas concentraciones de CNT. Antes de la generación de MTS a los cultivos celulares, se añadió solución de CNT en PBS en cultivo hasta la concentración final como se describió anteriormente para el ensayo de MTT. El cultivo adicional se llevó a cabo durante 48 h con una rotación constante de placas en un agitador orbital (80 rpm). En la siguiente etapa, se tomaron imágenes de micro fotografías mediante el método de "campo oscuro". En total, se realizaron más de 120 imágenes. Luego, se calculó el volumen de todos los MTS, que estaban en los archivos, con el programa de uso Axio Vision Rel 4.7, Zeiss. Usamos la fórmula de Rolf Bjerkvig: V =0.4 ∙ a ∙ b ² , donde los tamaños geométricos de los esferoides ( b < a ) [37]. La visualización de los resultados se realizó en un microscopio Stemy 2000C, Zeiss.

Análisis del impacto de los CNT en el sistema de enzimas hepáticas, la rotación de proteínas y la composición de la sangre celular in vivo

Los procedimientos que involucran a los animales y su cuidado se ajustan a la directiva europea 2010/63 UE, aprobada por los Comités Éticos de Experimentación Animal locales (Protocolo №1 21.10.2016). Para analizar la influencia de las sustancias obtenidas en el estado general de la homeostasis del organismo, se llevaron a cabo una serie de experimentos in vivo. Se utilizaron ratones de estudios in vivo de la línea Balb / 2a. Los ratones machos y hembras eran iguales en los grupos, de 6 a 8 semanas, diez para cada grupo. Los ratones se alojaron en jaulas con tapas de alambre de acero y lechos de mazorcas de maíz y se mantuvieron en una atmósfera controlada con un ciclo de oscuridad / luz de 12/12, temperatura de 22 ° C ± 3 ° C y humedad del 50-70%, con acceso libre. a la comida y al agua dulce. Así, se formaron cuatro grupos de ratones. Grupo 1:los animales intactos se trataron con 200 µl de PBS, control. Grupo 2:los ratones fueron tratados con CNTox en dosis de 1,5 mg / kg. Grupo 3:los ratones fueron tratados con CNT-DOX en dosis de 1,5 mg / kg. Y en el grupo 4, los ratones fueron tratados con doxorrubicina en dosis de 20 mg / kg. Los ratones recibieron CNT parenteral en 200 μl de PBS, cada 3 días, durante 4 semanas. La doxorrubicina se administró por vía intraperitoneal, una vez cada 3 días, a una concentración de 20 mg / kg de peso corporal.

Análisis bioquímico del suero

Un mes después, los ratones se retiraron del experimento. Se recogieron inmediatamente muestras de sangre cardíaca de animales muertos. Se extrajo sangre de los animales al mismo tiempo de 10 a 11 a.m. Para el plasma, la sangre se incubó durante 40 min a 37 ° C y luego se centrifugó (20 min, 2000 rpm). Luego se determinaron los parámetros bioquímicos, proteína total, albúmina, aspartato aminotransferasa (AST) y alanina aminotransferasa (ALT), fosfatasa alcalina (ALP), en el plasma con kits de diagnóstico (Cormay, Varsovia, Polonia). Los experimentos se llevaron a cabo mediante protocolos de laboratorio unificados en el analizador bioquímico semiautomático FP-901M (Labsystems, Finlandia). La composición de la sangre celular se determinó en un analizador hematológico Mindray BC-3000 Plus, China.

Análisis estadístico

Para el análisis estadístico del cultivo 3D, todos los agregados celulares se clasificaron en grupos según el tamaño de 1 × 10 ⁻⁴ mm ³ a 1 × 10 ⁻² mm ³ con paso en 1 × 10 ⁻³ mm ³ . Luego se estimó el número de MTS en cada grupo y la mediana del volumen de MTS para cada grupo. Todas las mediciones se repitieron tres veces. Para el ensayo micro estadístico de variables aleatorias distribuidas normalmente, utilizamos el coeficiente de Student para una población pequeña. El p indicado el valor era * р ≤ 0.05 o ** р ≤ 0,01.

Resultados y discusión

Microscopía electrónica de barrido de MWCNT

Según el protocolo [38], el diámetro medio de los NTC era de 10 a 20 nm y la superficie específica determinada por desorción de argón era de 200 a 400 m ² /gramo. Densidad aparente entre 20 y 40 g / dm ³ . En particular, los aglomerados en forma de tubos entrelazados con dimensiones de 20 a 500 μm se obtienen durante una producción industrial de CNT aplicando el método CVD (Fig. 3).

Imágenes SEM de CNT, 1) escala de 0,5 μm; 2) escala de 5 μm

Potencial Zeta de las suspensiones de nanotubos

CNTox y CNT indican una estabilidad significativa a la agregación, que depende directamente del valor del potencial zeta. CNT-DOX tiene un potencial zeta menor que CNTox y CNT, y una alta reproducibilidad de la medida, lo que indica la homogeneidad de las partículas (Cuadro 1). Un valor pequeño del potencial zeta de CNT-FITC puede indicar tamaños de partículas significativos o sus pequeñas concentraciones, como lo indica la alta relación de ruido en la medición.

Espectroscopia FTIR de CNT, CNT-Dox y CNT-FITC

Las uniones entre CNTox y doxorrubicina (DOX) y fluoresceína (FITC) se estimaron sobre la base de datos espectrales infrarrojos como se demuestra en la Fig. 4.

Espectros infrarrojos de CNTox (CNT-O), CNT-DOX (CNT-D), CNT-FITC (CNT-F)

La presencia de una banda fuerte en υ =3311 cm ⁻¹ (CNT-O) y υ =3451 cm ⁻¹ (CNT-D) atribuido a las fluctuaciones del acoplamiento CON-H, así como a la presencia de una banda fuerte en υ =1634 cm ⁻¹ (CNT-O) y υ =1631 cm ⁻¹ (CNT-D) atribuido a las vibraciones de unión O-CNH, que indica claramente el tipo de unión amida entre CNT y Dox. Además, IR mostró la absorción de enlaces C-H que se encuentra en 2969-2834 cm ⁻¹ y una banda ancha a 1460-1407 cm ⁻¹ del fragmento C-O-H. Por lo tanto, podemos concluir que como resultado de reacciones químicas, los NTC se funcionalizaron con un fármaco antitumoral (doxorrubicina) y un marcador fluorescente (FITC).

Citotoxicidad de los NTC en diferentes etapas de funcionalización en modelos de crecimiento celular monocapa y esferoides

El siguiente paso fue determinar la citotoxicidad de los CNT oxidados (CNTox), los CNT funcionalizados con doxorrubicina (CNT-Dox) y el marcador fluorescente (CNT-FITC). Los resultados de la prueba MTT en cultivo monocapa de HT29 se muestran en la Fig. 5.

Viabilidad de células tumorales HT29 en cultivo monocapa tras incubación durante 48 h con CNT y sus derivados (CNT-Dox y CNT-FITC). Significación estadística:* р ≤ 0.05 o ** р ≤ 0,01

Como resultado, se demostró que CNTox, CNT-Dox y CNT-FITC tienen un efecto citotóxico moderado a concentraciones de 12,5 μg / ml (81%). El aumento de la concentración de CNTox de 25 a 50 y 100 μg / ml condujo a una disminución dependiente de la dosis de la viabilidad de las células tumorales a 71,8–69,6–62,5% en comparación con el control. A concentraciones de CNTox de hasta 200 μg / ml, la viabilidad de HT29 disminuyó al 39,2%. En ese momento, CNT-Dox en concentraciones bajas (12,5 a 50 μg / ml) no mostró citotoxicidad estadísticamente significativa, en comparación con CNTox. A altas concentraciones (200 μg / ml), CTN-Dox tuvo incluso menos citotoxicidad que CNTox (50%). Al mismo tiempo, los CNT, funcionalizados con fluoresceína, tenían un efecto citotóxico relativamente mayor sobre las células tumorales. Después de la incubación con CNT-FITC en una concentración de 25 μg / ml, la supervivencia de las células HT29 se redujo al 55% ya 100-200 μg / ml al 23 y 7%, respectivamente. Por tanto, en ese caso, los CNT desempeñaron el papel de sustrato celular bastante inerte. Más que eso, los CNT inmovilizaron Dox y redujeron la citotoxicidad de Dox. En estudios anteriores [33], hemos demostrado que los nanotubos primarios tienen cualidades hidrófobas, un efecto citotóxico moderado y estimulan la formación de un gran número de agregados celulares. Según la literatura [39], la carga superficial de los NTC cambia durante la oxidación. Los CNT se vuelven más hidrófilos y esto conduce a la formación de agregados más pequeños y aumenta el efecto citotóxico de los CNT. Los datos que recibimos en un estudio anterior confirman esta tendencia. CNTox redujo la supervivencia de las células tumorales en al menos un 60% en comparación con el control, CNT-Dox al 45% y CNT-FITC al 97% (a 200 μg / ml). La explicación de los datos obtenidos puede encontrarse en informes de otros autores de que los ligandos funcionales, en la mayoría de los casos, cambian el potencial zeta de superficie de los NTC, estimulan la solubilidad de los NTC y aumentan la penetración celular de los NTC [40]. La capacidad de los NTC para formar agregados después de la oxidación y funcionalización disminuye, mientras que aumenta la permeabilidad a través de la membrana celular y aumenta la reactividad de los orgánulos celulares. Más que eso, CNT-Dox, a altas concentraciones, tiene un efecto citotóxico menor que CNTox. Al mismo tiempo, de acuerdo con los datos obtenidos, se puede suponer que el enlace peptídico mantiene la doxorrubicina en la superficie del CNT. El enlace peptídico entre los CNT y Dox es suficientemente estable en condiciones de cultivo celular. No se descompone y toma doxorrubicina en forma inactiva. Al mismo tiempo, fluoresceína-sodio molecular (C ₂₀ H ₁₂ O ₅ ), un ligando del tamaño de 332,311 g / mol, se disocia con bastante facilidad de la superficie de los NTC y entra en las células. Como resultado, hay violaciones irreversibles de las estructuras del ADN, los núcleos y las mitocondrias [41].

Para verificar la citotoxicidad de los CNT y sus derivados y el impacto en las propiedades adhesivas de las células tumorales, se analizó el área de las colonias 2D de células HT29. Los resultados se muestran en la Fig. 6. Se demostró que los CNT y sus derivados tienen una influencia sobre la capacidad adhesiva de las células tumorales y la formación de colonias de células tumorales en cultivos de monocapa. La incubación de células tumorales con CNTox (muestra n. ° 1) a concentraciones de 12,5, 50,0 y 200 μg / ml condujo a una disminución dependiente de la dosis de las colonias de células 2D al 55,2%, 57,8% y 78,3% en consecuencia, en comparación con el control. Al mismo tiempo, la muestra de CNT-Dox (muestra # 3) a las mismas concentraciones no causó tal efecto. El área de colonias 2D se redujo en un 34,8%, 61,6% y 82,4%, respectivamente. El CNT-FITC (muestra n. ° 5) demostró la mayor influencia sobre las células tumorales en cultivos de monocapa. El área de colonias 2D después de la incubación con CNT-FITC disminuyó al 59,8%, 85,2% y 89,8%, respectivamente. Cabe señalar que los resultados obtenidos tienen la misma tendencia que el ensayo MTT. Pero los resultados del análisis MTT no mostraron un efecto citotóxico tan significativo. Las discrepancias resultantes pueden ser el resultado de efectos no citotóxicos de los CNT en la colonia celular y, en parte, de la influencia anti-adhesiva. Previamente, hemos demostrado que los CNT tienen menos capacidad citotóxica que anti-adherencia. Según nuestros datos, los CNT estimulan la migración de células tumorales a la fracción de suspensión y la formación de esferoides tumorales multicelulares (MTS). La sensibilidad de las células a los agentes antitumorales en cultivos de monocapa y esferoides es diferente. Es por eso que en el siguiente paso, investigamos la formación de MTS por las células tumorales HT29 en presencia de CNTox, CNT-Dox y CNT-FITC. Las concentraciones de CNT fueron las mismas que en experimentos anteriores. En la Fig. 7, se demostró que los CNTox (muestra nº 1) pueden estimular la formación de MTS. El aumento de la concentración de CNTox se acompaña de un aumento dependiente de la dosis del volumen medio de MTS. A concentraciones de CNTox de 12,5, 50, 200 μg / ml, el volumen medio de MTS aumenta de 1,79 a 2,18 y 10,98 mm ³ ; es casi diez veces. Los derivados de los CNT no producen tal efecto en las células tumorales. CNT-Dox (muestra n. ° 3) estimula la formación de MTS en 2.83 veces. Al mismo tiempo, la incubación del cultivo de células tumorales 3D con CNT-FITC (muestra n. ° 5) conduce a una disminución de 2,4 veces del volumen de MTS.

El área de colonias de células tumorales HT29 en cultivo de monocapa que se incubó con CNTox (nº 1), CNT-Dox (nº 3), CNT-FITC (nº 5). Significación estadística:* р ≤ 0.05 o ** р ≤ 0,01

La mediana del volumen de esferoides tumorales multicelulares. Los MTS se generaron en presencia de CNTox (muestra n. ° 1), CNT-Dox (muestra n. ° 3), CNT-FITC (muestra n. ° 5). Significación estadística:* р ≤ 0.05 o ** р ≤ 0,01

Es de destacar que en la mayoría de los experimentos, CNT-Dox no tiene tales efectos citotóxicos sobre las células tumorales, tanto en cultivo 2D como en 3D, que podrían compararse con el efecto de una sola doxorrubicina. The mechanism of cytotoxic action of doxorubicin is based on penetration into the cell nucleus and intercalation between nucleotide pairs, violation of replication and DNA repair, protein synthesis and, as a result, cell death. The cause of the reduction of cytotoxic effect of the CNT-Dox may be the binding of the doxorubicin with CNT surface through peptide bonds. It prevents Dox dissociation from CNT surface and Dox penetration into the cell and cellular organelles. This fact may let to deliver the compound to certain tissues without causing a negative effect on “non-target” objects.

In this case, the next step of the study was controlled release of doxorubicin. For peptide bonds breaking, we used the commonly known peptidase trypsin as the release agent. The effect of trypsin on the Dox release from the surface of the CNT was investigated by spectral analysis. Since the free doxorubicin has a fluorescence peak at 495 nm, bounded doxorubicin has no such ability. It was analyzed how the increasing of trypsin concentration affected on concentration of free doxorubicin. The results are shown in our previous work [42]. Shortly, it was demonstrated that increasing the concentration of 0.05% trypsin from 11 to 20% in culture medium contributed to an increasing the concentration of free doxorubicin from 3.13 to 6.55 μg/ml. A further increasing the concentration of trypsin to 60% did not lead to increasing in free doxorubicin. However, the concentration of trypsin by about 66% stimulated release again and led to increasing the concentration of doxorubicin in two times, to 11.38 μg/ml. Thus, it was concluded that 0.05% trypsin has several effective concentrations. Under these conditions, peptide bonds between doxorubicin and CNT were broken and doxorubicin was released. Therefore, to analyze how CNT-Dox influence the tumor cells after Dox release, we incubated tumor cells in the w/o fetal bovine serum (FBS) nutrient medium with trypsin and in the presence of CNT-Dox. The survival of tumor cells was determined using the MTT test. The ratio of the nutrient medium, trypsin, concentration of CNT-Dox, and doxorubicin are given in Table 2. The results of incubation HT29 during 48 h are demonstrated on Fig. 8. Cell viability in the presence of trypsin—blue columns, alone doxorubicin—orange columns, and CNT-Dox with trypsin—pink columns. In results, it has been found that the simultaneous use of trypsin and CNT-Dox significantly increased the cytotoxic effect of CNT and doxorubicin compared to the separately use of these substances. So doxorubicin alone at concentrations from 0.05 to 1.0 μg/ml causes a dose-dependent decreasing the percentage of living HT29 cells from 7.18 to 45.7% relative to control (Fig. 8, orange columns). Incubation of CNT-Dox at concentrations of 20.0 to 1.25 μg/ml with trypsin at concentration from 0 t0 70% led to a dose-dependent decreasing in the percentage of living cells from 80.9 and 99.8% respectively (Fig. 8, pink columns). At the same time, incubation with trypsin alone leads to decreasing percentage of living cells only by 34.0–42.0% (Fig. 8, blue columns). Thus, we can conclude that we observe the synergistic effect of CNT-DOX and trypsin. Each individual component has a small cytotoxic effect on cells, and together the cytotoxic potential of substances increases several times.

Percentage of alive cells HT29 after 48 h of incubation in the presence of trypsin, doxorubicin, CNT-Dox. Statistical significance:*р ≤ 0.05 or **р ≤ 0.01

As functional groups (Dox) were attached to CNTs surface by peptide bonds as, in vivo Dox release will be realized in organs of the gastrointestinal tract with an increased content of proteases, peptidases. In organism, proteases are used for various metabolic processes. Acid proteases secreted into the stomach (such as pepsin) and serine proteases present in duodenum (trypsin and chymotrypsin) enable us to digest the protein in food [43]. Other proteases are present in leukocytes (elastase, cathepsin G) and play several different roles in metabolic control. This is one of the fastest “switching on” and “switching off” regulatory mechanisms in the physiology of an organism. By complex cooperative action, the proteases may proceed as cascade reactions, which result in rapid and efficient amplification of an organism’s response to a physiological signal. Therefore, the authors suggest that CNT-Dox construction will be the most effective in the case of stomach, pancreas, liver, and small intestine cancer localization in case of parenteral administration of drug.

Influence of CNTs and Their Derivatives on Cell Blood Composition, Hepatic Enzyme System, and Proteins Turnover In Vivo

To determine the impact of the CNTox and CNT-Dox on the protein metabolism and the state of the hepatic enzyme system, the level of albumin (Al), total protein (Tp), alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), and alkaline phosphatase (ALP) was determined. Data are given in Fig. 9a, b. As a result, it was noted that CNT-Dox and Dox have influence on the hepatic enzymes activity, namely on the AST and ALP. AST level increased in mice serum from 1 group for 21.6%, 2 group for 93.9%, and 3 group for 126.4% compared with control. At the same time, the activity of ALP increased in mice serum from 1 group for 23.5%, 2 group for 119.1%, and 3 group for 147.8%. CNTox administration did not show statistically significant changes in AST, ALT, and ALP levels. In addition, it should be noted that CNTox, Doxorubicin, and CNT-Dox slightly increased the level of total protein in the blood of experimental animals. So, we found that systematic introduction of CNTox have not influence on mice serum enzyme profile. And opposite, administration of CNT-Dox and Dox had toxicity influence and induced a chronic hepatic damage. Notably, symptoms of hepatitis had more manifestation after Dox treatment than CNT-Dox. To determine possible inflammatory processes and systemic effects of CNTox, CNT-Dox on the state of blood cells composition, it was analyzed the blood cell formula of the experimental animals. The results are shown in Table 3. Obtained data are in good agreement with the well-known manifestations of doxorubicin’s hematological toxicity:anemia (decreased red blood cells, hemoglobin, hematocrit), thrombopenia (platelet count), neutropenia (decrease in the number of granulocytes). Interestingly, that it was demonstrated the same direction of the changes of practically all hematological parameters in the 1 (CNTox), 2 (CNT-Dox), and 3 (Dox) groups of animals. However, the change in the 2 and 3 groups of animals was statistically significant accordingly to control and 1 group. In the 2 group (CNT-Dox), it was found pronounced decreasing of the monocyte content related to the system of phagocyte mononuclear cells and cell’s immune response (9.5% and 0.12 × 10⁹ /l in control, 4.6% and 0.06 × 10⁹ /l in 2 group, and 4.55 and 0.05 × 10⁹ /l in 3 group). Animals of 2 and 3 groups demonstrated reducing the content of granulocytes (neutrophils) (12.6 and 0.16 × 10⁹ /l in control and 8.5% and 0.2 × 10⁹ /l in 2 group and 8.05 and 0.16 × 10⁹ /l in 3 group). The number of lymphocytes, both in percentage and absolute, increased in 2 and 3 groups (77.9% and 0.97 × 10⁹ /l in control and 86.9% and 2.0 × 10⁹ /l in 2 group and 87.8% and 2.3 × 10⁹ /l in 3 group). The main function of the lymphocytes is recognition of the antigen and participation in the adequate immunological response of the body. T lymphocytes perform regulatory and effectors functions. B lymphocytes take part in humoral immunity, providing immunoglobulins in response to stimulation of other people’s antigens. So, it can be assumed that an increase in the index of lymphocyte content in experimental 1, 2, and 3 groups can be associated with the introduction of foreign antibodies (CNTs) and/or tissue distraction [44]. Some decrease in the absolute number of leukocytes in 2 (1.2 × 10⁹ /l) and 3 (0.85 × 10⁹ /l) groups compared with the 1 group of animals (2.0 × 10⁹ /l) can be regarded as the result of a gradual accumulation of the reversal of toxic effects of Dox. It is described the reaction of WBC in experimental animal groups as well-known toxic hematologic impact from doxorubicin in the development of leucopenia. The analysis of indicators reflecting the number and state of RBC (erythrocytes and hemoglobin) also showed the same trend of misbalance in the 2 and 3 groups of animals. Statistically significant thrombocytopenia and anemia are more indicative in animals of 2 and 3 groups:the number of erythrocytes (5.54 × 10¹² /l in control, 3.97 × 10¹² /l in 2 group, and 3.12 × 10¹² /l in 3 group), the amount of hemoglobin (78 g/dl for intact animals, 55.5 g/dl for 2 group, and 46.2 g/dl for 3 group), hemoglobin (25.25% for intact animals and 16.75% for 2 group and 15.12% for 3 group). The amount of erythrocytes decreased but the average content of hemoglobin in one erythrocyte did not decrease. And, as a result, concentration of hemoglobin per one erythrocyte increased. Analysis of the RBW counts let us suggest that in 2 and 3 group of animals, there are several processes:decreasing the formation of erythrocytes in the bone marrow, the acceleration of erythrocyte destruction, the violation of the structure of membranes of red blood cells, and molecular defects (oxidation) of hemoglobin. Thrombocytopenia (27 × 10⁹ /l in intact animals, 14.0 × 10⁹ /l in 2 group, and 12.05 × 10⁹ /l in 3 group), a dose-dependent reversible myelosuppression, leucopenia and granulocytopenia (neutropenia) are the predominant manifestations of doxorubicin hematologic toxicity and is the most common acute dose-limiting toxicity of this drug. The direction of changes in the platelet content in the blood of experimental animals treated with CNTox and CNT-Dox is the same; however, significantly more pronounced in the group of animals receiving free Dox.

Monitoring of clinical parameters following CNTox (1 group), CNT-DOX (2 group), free DOX (3 group) administration in Balb/2a mice. Mice were treated by CNTox, CNT-DOX, DOX every 3 days during 4 weeks, in concentrations:CNT—1.5 g/kg and Dox—20 mg/kg of weight. Each experiment was done in triplicate. Statistical significance:*р ≤ 0.05 or **р ≤ 0.01. ALT alanine transferase, AST aspartate transferase, AP alkaline phosphatase

Thus, according to our results from in vivo experiments, it was demonstrated that systematic introduction of CNTox have not influence on mice serum enzyme profile and protein turnover. And opposite, administration of CNT-Dox and Dox had toxicity influence and induced a chronic hepatic damage. More than that, dose-dependent reversible myelosuppression, leucopenia, and granulocytopenia (neutropenia) was shown for the group of animals receiving free Dox. This predominant manifestation of hematologic toxicity was less pronounced in the group of animals receiving free CNT-Dox and CNTs. So, we can assume that, in the case of parenteral administration of CNT-Dox under action of gastric juice peptidases, CNT-Dox particles breaks up into free CNT and Doxorubicin. After that, Doxorubicin enters to the stomach cells and partly in the bloodstream. That also causes the specified effect on blood cells composition. For modeling Dox release in vivo, trypsin were used in vitro.

One of the goals of this investigation was to minimize the side effects of carbon vehicle on the body. Previously, the authors demonstrated that CNTs may be a potential threat to tumor development due to its ability to stimulate cell migration and support cells in suspension fraction [33]. In this case, CNTs themselves play a role of artificial extra cellular matrix. Another way CNTs can stimulate suspension cells to aggregation. If this process will be coincident with antitumor drug accumulation on CNTs surface, CNTs will attract substrate-independent cells and kill them. Simultaneously, it was found that pure CNTs did not have statistically significant cytotoxicity to tumor cells. So, CNTs alone are not dangerous as cytotoxic agents and can act as carrier for antitumor drugs to target cells. Then, studies were conducted to the functionalization of the CNTs by antitumor antibodies. It was demonstrated that CNTs are able to carry on the surface not only the Dox but also specific tumor antibodies—anti EGFr [42]. Under the action of trypsin, Dox was released and realized strong cytotoxic effect on tumor cells. Recent studies have shown the synergy cytotoxic effect of CNTs and Doxorubicin after release from CNT-Dox construct in the presence of trypsin. Such effect was not demonstrated by CNTs and Dox separately. Therefore, the benefits from the use of CNTs seems in the usage CNTs as vehicle for antitumor antibody and drug. On the other hand, the negative effects of Doxorubicin, like many other early antitumor drugs, are totally cytotoxic effects. Binding of the Dox to the CNTs partially blocks it. This effect allows ensuring local accumulation of the Dox in the focus of tumor activity with subsequent release and action. Thus, greater efficacy can be achieved with a smaller dose of administration. This effect can be achieved only if there are tumor-specific antibodies on the surface of the CNTs. The possibility of creating such construct was demonstrated by the authors in previous work. Undoubtedly, that CNTs dissemination, accumulation, and Dox effective should be tested on mixed culture in vitro and on a tumor model in vivo. For this purpose, synthesized CNT-FITC was created and conducted. The ability of the CNTs to act as an extra-cellular matrix and the significance of this process for the “tumor-body” system should be tested on the animal model. The effectiveness of the drug will be investigated on the model of Ehrlich carcinoma and colon rectal carcinoma [44]. The distribution of CNTs in the tissues of the body will be investigated using the construct created by the CST-FITC, as was mentioned in this work. The accumulation of CNTs in the tissues of the organs of the gastrointestinal system, namely the stomach, liver, and intestines, will be analyzed by histological assay. These studies are already conducted by the authors.

According to Shang-Lin Wang [4] and our data, free doxorubicin causes similar side effects, but more pronounced than CNT-Dox. Other authors reported that toxicity effect of CNTs depends on way of administration, dose, and time of exposure and varies according to the size and type of the cells [45,46,47,48,49]. Settling of CNTs in the tissues of the liver, kidneys, and stomach with prolonged exposure can cause oxidative stress, DNA damages, compromise cell proliferation, necrosis of tissues, and chronic inflammation [50]. According to Manna [51], CNTs can cause oxidative stress and compromise cell proliferation. In the case of in vitro studies, the cytotoxicity of CNT highly depends on the degree of CNTs purification, functionalization, size, and surface charge [52,53,54,55]. According to our results and previous data, the obtained CNTs did not demonstrate a significant cytotoxic effect [33]. More than that, our data let us suggest that there is a combined cytotoxic effect of CNTs and DOX that occurs as in vitro. That is why we assumed that obtained CNTs can be used against tumor cells, in case of the target accumulation of CNTs/CNT-Dox in tumor tissue. However, mechanisms of the cytotoxic effect of CNTs are not completely clear. Some authors suggested that CNT particles activate NF-kappaB pathway depending on the dose and that the mechanism of activation was due to activation of stress-related kinases [51]. Other authors reported that CNTs have a direct pro-apoptotic effect in vitro in different cancer cell lines and tumor cells obtained from surgical specimens [56], CNTs able to modify fatty acids in cell membranes [57] or erythrocyte membrane damage [58]. For further investigation of accumulation CNTs in cells and tissue, we plan to use CNT-FITC composite.

Other unclear questions are as follows:what is the prolonged impact of CNTs/CNT-Dox on organism level and how does it stimulate accumulation CNTs/CNT-Dox in tumor tissue? To investigate the influence of chronical introduction of CNTs/CNT-Dox, long-time studies on model of transplanted or initiated tumors of various localizations will be realized. Other authors analyzed the distribution of nanotubes throughout the body of mice after pulmonary exposure [59]. In results, accumulation of MWCNTs was documented in several organs, including notably the white pulp of the spleen and the bone marrow. The CNTs usually deposit in the liver, spleen, or lungs after they have served their purpose from where they are expelled gradually out of the body through the renal excretion route [60]. Zhao and Liu reported that accumulation of CNTs in the body can lead to granulomatous inflammation or alveolar septal thickening. Zhuang Liu et al. reported that SWNT-PTX affords higher efficacy in suppressing tumor growth than clinical Taxol® in a murine 4T1 breast-cancer model, owing to prolonged blood circulation and tenfold higher tumor paclitaxel (PTX) uptake by SWNT delivery likely through enhanced permeability and retention [61]. Accumulation of CNTs in the target tissue can be enhanced by placing on the CNTs surface specific antibodies which over expressed by tumor cells. The possibility of using antibodies for the targeted delivery of nanostructured preparations has been described by many authors [62, 63].

Conclusion

In 2D culture CNTox concentration from 25 to 50 and 100 μg/ml led to dose-dependent decreasing the viability of tumor cells to 71.8–69.6–62.5% accordingly compared with control. At concentration of CNTox up to 200 μg/ml, the viability of HT29 decreased to 39.2%. At that time, CNT-Dox at concentrations 12.5–25–50 μg/ml did not show statistically significant cytotoxicity, compared with CNTox. At high concentrations (200 μg/ml), CTN-Dox had even less cytotoxicity than CNTox (50%). After incubation with CNT-FITC in concentration of 25 μg/ml, HT29 cell survival reduced to 55% and at 100–200 μg/ml to 23 and 7% respectively. In 3D culture, increasing of CNTox concentration is accompanied with dose-dependent increasing of median volume of MTS. At concentration CNTox from 12.5, 50, 200 μg/ml median volume of MTS increases from 1.79 to 2.18 and 10.98 mm³ . CNTs-Dox and CNT-FITC did not cause such effect on tumor cells. Doxorubicin alone at concentrations from 0.05 to 1.0 μg/ml causes a dose-dependent decrease in the percentage of living HT29 cells from 7.18 to 45.7% relative to control. Incubation CNT-Dox at concentrations of 20.0 to 1.25 μg/ml with trypsin at concentration from 0 to 70% led to a dose-dependent decreasing the percentage of living cells from 80.9 and 99.8% respectively. At the same time, incubation with trypsin alone leads to decreasing percentage of living cells only by 34.0–42.0%. So, the synergistic effect of CNT-DOX and trypsin was observed. Each individual component has a small cytotoxic effect on cells, and together the cytotoxic potential of substances increases several times. In vivo, systematic introduction of CNTox have not influence on mice serum enzyme profile. And opposite, administration of CNT-Dox and Dox had toxicity influence and induced a chronic hepatic damage, thrombocytopenia, a dose-dependent reversible myelosuppression, leucopenia, and granulocytopenia (neutropenia). Notably, symptoms of hepatitis had more manifestation after Dox treatment than CNT-Dox.

So, the possibility of targeted delivery and controlled release of any highly toxic drug with the use of CNT depends on strategies of reducing toxicity of CNTs and realizing potential of CNTs and anti-tumor drugs “in right place in right time.” According to the data obtained by authors and literature, it is possible. Our data support the assumption that this approach allows to reduce toxicity of the doxorubicin on the general biochemical indicators of blood and violations in the blood cells composition. At the same time, doxorubicin releasing is realized under certain conditions. And combined effect of CNTs and doxorubicin let us achieve greater efficacy in suppressing tumor cell growth in vitro.

Abreviaturas

Al:: Albumin
ALP:: Alkaline phosphatase
ALT:: Alanine aminotransferase
AST:: Aspartate aminotransferase
CNT-Dox:: Carbon nanotubes which were functionalized by doxorubicin
CNT-FITC:: Carbon nanotubes which were functionalized by fluorescein
CNTox:: Oxidized carbon nanotubes
CNTs:: Carbon nanotubes
Dox:: Doxorrubicina
FTIR:: Espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier
MTS:: Multi-cellular tumor spheroid
MWCNTs:: Multi-walled carbon nanotubes
PTX:: Paclitaxel
Tp:: Total protein

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