Captación de fotosensibilizador de cloro e6 por nanosistema híbrido de poliestireno-difeniloxazol-poli (N-isopropilacrilamida) estudiado por transferencia de energía de excitación electrónica

Experimental

Materiales

Estireno (ST, Ucrania) de p.a. La calidad se purificó mediante un método estándar directamente antes de la polimerización. N-isopropilacrilamida (NIPAM, Sigma-Aldrich Inc.), N, N'-metilenbisacrilamida (BIS, Sigma-Aldrich Inc.), persulfato de potasio K ₂ S ₂ O ₈ (KPS, Ucrania), fosfato de sodio monobásico deshidratado NaH ₂ PO ₄ × 2H ₂ O (Ucrania) y dodecil sulfato de sodio tensioactivo aniónico (SDS, Sigma-Aldrich Inc.) eran de calidad reactivo y se usaron sin purificación adicional. Cloro e ₆ (Frontier Scientific Inc.) fue amablemente proporcionada por T.Y. Ohulchanskyy (Instituto de Láseres, Fotónica y Biofotónica de la Universidad Estatal de Nueva York en Buffalo). Se utilizaron 50 milimolares de tampón TRIS-HCl (pH 7,2) como disolvente.

Síntesis y caracterización de nanosistemas

Los nanosistemas híbridos de poliestireno-poli (N-isopropilacrilamida), dopados con PPO (PS-PPO-PNIPAM híbrido NS), se sintetizaron como sigue. En primer lugar, se prepararon nanopartículas de núcleo de PS-co-PNIPAM dopadas con PPO mediante polimerización en microemulsión [13, 14, 19, 20]. Brevemente, 0,2 g de NIPAM, 0,2 g de dodecilsulfato de sodio y 0,01 g de NaH ₂ PO ₄ × H ₂ O se disolvieron en 90 g de H ₂ A continuación, se disolvieron 0,09 g de PPO en 1,8 g de estireno y la mezcla obtenida se añadió gota a gota durante 30 min también. La mezcla se agitó a 700 rpm y se burbujeó Ar en la mezcla durante 30 min. Después de que la temperatura aumentó a 70 ° C, 0.01 g de K ₂ S ₂ O ₈ disuelto en 1 ml de H ₂ Se inyectó O para iniciar la polimerización. En segundo lugar, la capa de cubierta de PNIPAM se fabricó después de 4 horas de calentamiento a 70 ° C. Para ello, se añadieron al reactor una solución acuosa de monómero NIPAM (0,69 g) y reticulante N, N'-metilenbisacrilamida (BIS) (0,06 g) utilizando una jeringa. Se dejó que la reacción continuara durante 3 horas a 70ºC y 1 hora más a 90ºC. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se dializó durante 48 h utilizando membrana de celulosa con MWCO 3500 Da.

En la Fig. 2 se presentan imágenes de microscopía electrónica de transición (TEM) de los nanosistemas obtenidos. Para la preparación de la muestra, se hicieron hidrófilas rejillas de Cu de malla 400 con película de carbono simple mediante un tratamiento de descarga luminiscente (Elmo, Cordouan Technologies Bordeaux Francia). Se depositó una gota de 5 μl y se dejó adsorber durante 1 min, luego se retiró el exceso de solución con un trozo de papel de filtro. Las observaciones de los nanosistemas PS-PPO-PNIPAM se realizaron en dos TEM, Tecnai G2 o CM12 (FEI, Eindhoven, Países Bajos), y las imágenes se adquirieron con una cámara ssCCD Eagle en el Tecnai y una cámara Megaview SIS en el CM12. Se ve en la Fig. 2 que los nanosistemas híbridos obtenidos consisten en varios NP de PS-PPO esféricos unidos; creemos que están unidos por una red de polímero PNIPAM reticulado. Así, se obtuvieron nanosistemas híbridos PS-PPO-PNIPAM.

Medidas espectrales y preparación de muestras

Los espectros de absorción se midieron usando un espectrofotómetro Specord M40 (Carl Zeiss, Alemania). Los espectros de excitación y emisión de fluorescencia se registraron con la ayuda de un espectrofotómetro fluorescente Cary Eclipse (Varian, Australia). Las medidas de absorción y fluorescencia se realizaron en una celda de cuarzo de 1 x 1 cm a temperatura ambiente. Se utilizaron como disolvente cincuenta milimolares de tampón TRIS-HCl, pH 7,2. Para las mediciones espectrales, la solución obtenida de PS-PPO-PNIPAM híbrido NS se disolvió 100 veces en tampón. Solución madre de clorina e ₆ a la concentración de 10 mM se preparó en DMF y se diluyó adicionalmente en tampón hasta una concentración de 1 mM. Pequeña alícuota de esta solución 1 mM de clorina e ₆ luego se añadió a una solución tampón disuelta 100 veces de NS; la concentración final de cloro e ₆ fue de 2 µM y, por lo tanto, la mezcla de DMF fue del 0,02%. Espectros de excitación y emisión de fluorescencia de solución NS híbrida PS-PPO-PNIPAM con cloro e ₆ se midió en 0, 5, 10, 20, 40, 60, 80 y 100 minutos después de la adición de clorina e ₆ a la solución de PS-PPO-PNIPAM híbrido NS. En casi 80 minutos, se alcanzó la saturación.

Para mediciones dependientes de la temperatura, solución de PS-PPO-PNIPAM híbrido NS en presencia de cloro e ₆ se colocó en el soporte de celda termostatizado ( T =23 ° C). En 88 min después de la preparación de la muestra, después de la captación de cloro e ₆ por PS-PPO-PNIPAM híbrido NS alcanzó la saturación, el flujo de agua del baño de agua se encendió calentando la muestra a 39 ° C (esta temperatura debería exceder LCST para el PNIPAM reticulado). Espectros de excitación de fluorescencia de clorina e ₆ (emisión a 680 nm) luego se midieron en diferentes intervalos de tiempo después de que se inició el calentamiento. Los resultados experimentales indican que la transición de conformación comienza en aproximadamente 3 minutos después de que se inició el calentamiento. Cabe mencionar que en aproximadamente 18 minutos después de que se inició el calentamiento, se produjo la coagulación del NS dando coágulos macroscópicos (que sin embargo desaparecen después de que la solución se enfrió, por lo que la coagulación es reversible). El experimento de temperatura se realizó tres veces y se obtuvieron tendencias similares.

Resultados y discusión

Los espectros de absorción, excitación de fluorescencia y emisión de fluorescencia de los nanosistemas híbridos PS-PPO-PNIPAM obtenidos en tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,2) se presentan en la Fig. 3. El espectro de absorción contiene las bandas correspondientes al estireno (máximo cerca de 260 nm ) y PPO (máximo cerca de 307 nm). Al mismo tiempo, el espectro de emisión de fluorescencia tras la excitación a 250 nm (el rango de absorción de estireno) resultó en el espectro que pertenece exclusivamente a PPO (con un máximo a 367 nm), mientras que la emisión de estireno (debido a 307 nm [15] ) no fue observado. Por lo tanto, la EEET de estireno a PPO incorporado está casi completa. EEET también está respaldada por el espectro de excitación de la emisión de PPO (380 nm) donde se observa claramente una banda de estireno cercana a los 260 nm (Fig. 3). Cabe agregar que se pudo observar una clara estructura vibrónica en el espectro de emisión de PPO (que no se observa para la solución acuosa de PPO [14]) que además apunta a la incorporación de PPO en la matriz de PS.

Espectros de absorción (línea continua negra), excitación de fluorescencia (emisión a 380 nm, normalizada; línea negra de trazos cortos) y de emisión (excitación a 250 nm, normalizada; línea continua roja) de los nanosistemas híbridos PS-PPO-PNIPAM obtenidos en Tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,2)

Además, a la solución de los nanosistemas híbridos PS-PPO-PNIPAM obtenidos en tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,2), el fotosensibilizador clorina e ₆ fue añadido. Espectro de absorción de clorina e ₆ no muestra casi ningún cambio en la presencia de nanosistemas híbridos en comparación con la solución tampón, excepto una pequeña disminución de la densidad óptica en los máximos (Fig. 4).

Espectros de absorción de clorina e ₆ (2 μM) libre (línea negra) y en presencia de nanosistemas híbridos PS-PPO-PNIPAM (línea roja) en tampón Tris-HCl 50 mM, pH 7,2

Al mismo tiempo, efecto de la adición de clorina e ₆ a PS-PPO-PNIPAM híbrido NS en espectros de fluorescencia es mucho más notable en comparación con los de absorción. En primer lugar, la presencia de cloro e ₆ conduce a la extinción de la emisión fluorescente de PPO de NS híbrido PS-PPO-PNIPAM, y esta extinción mejora durante aproximadamente una hora (Fig. 5). Generalmente, tal extinción podría deberse a EEET (que conduciría a la extinción de la emisión del donante en todas las longitudes de onda de emisión) o reabsorción (que conduciría a la extinción de la emisión del donante en las longitudes de onda de la absorción del aceptor). Las diferencias de los espectros de emisión de PPO (Fig. 5) muestran que inmediatamente después de la clorina e ₆ Además, la contribución de la reabsorción a la extinción de las emisiones de PPO es significativa (pero también se produce EEET). Al mismo tiempo, la contribución de la reabsorción disminuye aún más con el tiempo y la de EEET crece.

Espectros de fluorescencia del híbrido PS-PPO-PNIPAM libre de NS (línea continua negra) y tras la adición de clorina e ₆ medido en 0 min (línea negra de trazos cortos) y en 80 minutos (línea negra de trazos y puntos). La longitud de onda de excitación es de 250 nm. Como disolvente se utilizan cincuenta milimolares de tampón Tris-HCl, pH 7,2. Las diferencias de los espectros (líneas rojas sólidas, de trazos cortos y de puntos) indican la contribución de la reabsorción y la transferencia de energía de excitación electrónica (EEET) a la extinción de las emisiones

Otro efecto de la adición de cloro e ₆ a PS-PPO-PNIPAM híbrido NS es la aparición de clorina e ₆ emisión (tras la excitación de PS a 250 nm) que se desplaza a la región de longitud de onda larga en comparación con la de cloro libre e ₆ ; tanto la intensidad como el desplazamiento aumentan con el tiempo y alcanzan la saturación en aproximadamente una hora (Fig. 6). Este cambio apunta a la influencia del entorno PNIPAM sobre las moléculas unidas de clorina e ₆ . Al mismo tiempo, emisión de cloro e ₆ tras la excitación a su propia absorción (a 400 nm) sólo cambia ligeramente en presencia de PS-PPO-PNIPAM NS. Junto con el pequeño cambio en el cloro e ₆ absorción (Fig.4), esto significa que solo una pequeña parte de la clorina e ₆ moléculas está unidas a PS-PPO-PNIPAM NS.

Espectros de fluorescencia de clorina e ₆ libre y agregado a PS-PPO-PNIPAM híbrido NS (medido en 0, 5, 10, 20, 40 y 80 min después de la adición). Las longitudes de onda de excitación son 250 y 400 nm; Se utilizó como disolvente tampón Tris-HCl 50 mM, pH 7,2. Las flechas de trazos cortos indican espectros excitados a 250 y 400 nm. La flecha continua indica el tiempo de aumento (t) después de la adición de cloro e ₆ para los espectros excitados a 250 nm

Finalmente, la banda de PS-PPO aparece en el espectro de excitación de la clorina e ₆ añadido a PS-PPO-PNIPAM híbrido NS (emisión a 680 nm, donde la contribución de la clorina e ₆ unida a PNIPAM a la emisión total de cloro e ₆ está cerca del máximo). Esta banda es débil al principio, pero además, su intensidad aumenta fuertemente con el tiempo (Fig. 7). Al mismo tiempo, esta banda de PS-PPO es muy débil en el espectro de excitación de la clorina e ₆ tras la emisión a 660 nm (es decir, al máximo de cloro libre e ₆ espectro) incluso después de 100 minutos después de la adición de clorina e ₆ .

Espectros de excitación de fluorescencia de clorina e ₆ libre y agregado al NS híbrido PS-PPO-PNIPAM (medido en 0, 10, 80 y 100 min después de la adición), y al NS híbrido PS-PPO-PNIPAM mismo. Longitudes de onda de emisión para cloro e ₆ son 660 nm (intensidad normalizada) y 680 nm. La longitud de onda de emisión para PS-PPO-PNIPAM NS es de 380 nm (intensidad normalizada). Como disolvente se utilizan cincuenta milimolares de tampón Tris-HCl, pH 7,2

Por lo tanto, clorina e ₆ se une a PS-PPO-PNIPAM híbrido NS que causa EEET de la matriz de PS y PPO encapsulado a clorina e ₆ . La eficiencia de EEET mejora con el tiempo (durante aproximadamente una hora después de que el cloro ₆ adición), lo que indica que la absorción de cloro e ₆ por la red PNIPAM del NS híbrido PS-PPO-PNIPAM todavía prosigue durante este tiempo. Al mismo tiempo, una parte relativamente pequeña de clorina e ₆ presente en la solución está obligado por PNIPAM.

También debe mencionarse que PS-PPO NP mostró emitir la fluorescencia de PPO [14] o porfirina adherida [13] cuando se excita con rayos X. Por lo tanto, EEET de PS a clorina e ₆ observado en PS-PPO-PNIPAM híbrido NS bajo la excitación UV de PS significa que la energía de los rayos X también podría transferirse a la clorina e ₆ en el SN estudiado. Al mismo tiempo, se requiere una concentración bastante alta de NP de PS-PPO para la observación directa de la emisión estimulada por rayos X de dicha NP [13, 14]. Una de las formas de aumentar la sensibilidad de tales NS a los rayos X podría ser la adición de componentes que contienen átomos pesados.

Se sabe que PNIPAM experimenta la transición de conformación a LCST igual a 32 ° C. Para el polímero reticulado, el valor de LCST debería ser aún mayor. Si nuestro NS híbrido PS-PPO-PNIPAM consiste en una red PNIPAM reticulada que rodea a los NP PS-PPO y clorina e ₆ está vinculado a la red PNIPAM, podríamos esperar la disminución de PPO-clorina e ₆ distancia y, por lo tanto, el aumento de la eficiencia EEET al calentar todo el NS híbrido.

Para verificar esta idea, el efecto del calentamiento de NS híbridos PS-PPO-PNIPAM en presencia de cloro e ₆ en espectros de excitación de fluorescencia de clorina e ₆ fue estudiado. El experimento de calentamiento se realizó tres veces; se demostraron tendencias similares. Los resultados de uno de estos experimentos se presentan en las Figs. 8 y 9. Así, la solución de NS híbrido PS-PPO-PNIPAM en presencia de cloro e ₆ se calentó a una temperatura de 39 ° C (esta temperatura debería exceder la LCST para el PNIPAM reticulado); el calentamiento comenzó después de la absorción de cloro e ₆ por PS-PPO-PNIPAM híbrido NS alcanzó la saturación. Durante el calentamiento, la proporción de cloro e ₆ intensidades de fluorescencia (emisión a 680 nm) tras la excitación a 320 nm ( I _ex320 ; eso es cloro e ₆ emisión debida a PPO-to-chlorin e ₆ EEET) y 404 nm ( I _ex404 ; eso es cloro e ₆ se estudió la emisión tras la excitación a su propia banda de Soret) (Figuras 8 y 9); Creemos que esta relación refleja la eficiencia de PPO a clorina e ₆ EEET. Por lo tanto, los primeros 3 minutos después de que comenzó el calentamiento, I _ex320 / Yo _ex404 disminuyó de 0,9 a 0,85, quizás debido a la disminución de la clorina e ₆ afinidad de unión de -a-PNIPAM al aumentar la temperatura. Además, el valor de I _ex320 / Yo _ex404 la relación aumentó hasta 1,02, lo que se acompañó de un aumento de la dispersión de la luz (Fig. 8; la dispersión se manifiesta como un aumento de intensidad cerca de 660 nm). Esto podría explicarse por la transición de conformación en PNIPAM que conduce a la reducción del volumen de red de PNIPAM reticulado. Esto provoca la disminución de la distancia entre el donante de PS-PPO y la clorina e ₆ moléculas aceptoras unidas a la red PNIPAM y, por lo tanto, aumentan la eficiencia de EEET.

Espectros de excitación de fluorescencia (normalizados a 404 nm) de clorina e ₆ añadido a PS-PPO-PNIPAM híbrido NS a 23 ° C (línea negra) y a 39 ° C (en 14 min después de que se encendió el calentamiento; línea roja). Longitud de onda de emisión 680 nm; Se utilizó como disolvente tampón Tris-HCl 50 mM, pH 7,2

La dependencia del tiempo después del calentamiento a 39 ° C se activó de la relación de la intensidad de emisión de cloro e ₆ añadido a PS-PPO-PNIPAM híbrido NS a 680 nm tras la excitación a 320 nm (absorción por PPO con más EEET para cloro e ₆ ) a la de la excitación a 404 nm (excitación directa de clorina e ₆ ). Las barras de error explican el ruido de los espectros de excitación registrados

En resumen, los procesos en la solución de PS-PPO-PNIPAM híbrido NS en presencia de cloro e ₆ La adición podría describirse como sigue. Primero, adición de clorina e ₆ a la solución de PS-PPO-PNIPAM híbrido NS en tampón (Fig. 10, proceso 1) conduce a la penetración de la pequeña parte de cloro e ₆ en la red PNIPAM del NS híbrido; esto resultó en EEET de PS y PPO a clorina e ₆ . Tal penetración procede durante aproximadamente una hora acompañada del aumento en la eficiencia de EEET (Fig. 10, proceso 2). El calentamiento adicional de la muestra a una temperatura superior a LCST da como resultado la transición de conformación de la red PNIPAM que conduce a la disminución de la distancia entre PS-PPO y cloro ₆ moléculas, y por lo tanto a un aumento aún mayor de PS-PPO-a-clorina e ₆ Eficiencia EEET (Fig. 10, proceso 3).

Esquema propuesto de los procesos en la solución de NS híbrido PS-PPO-PNIPAM en presencia de cloro e ₆ tras la adición de clorina e ₆ (proceso 1), pasando aproximadamente 1 h (proceso 2) y calentando adicionalmente de 23 a 39 ° C (proceso 3)

Conclusiones

El estudio fluorescente reveló la absorción de clorina e ₆ mediante PS-PPO-PNIPAM híbrido NS, así como transferencia de energía de excitación electrónica desde la matriz de PS a través de PPO encapsulado a clorina e ₆ ; la absorción alcanzó la saturación en aproximadamente una hora.

Calentamiento de PS-PPO-PNIPAM-clorina e ₆ NS de 21 a 39 ° C da como resultado una mejora de la eficiencia de EEET; esto es consistente con la transición de conformación PNIPAM que reduce la distancia entre los donantes de PS-PPO y la clorina e ₆ aceptadores.

Mientras tanto, una parte relativamente pequeña de clorina e ₆ presente en la solución se une a PNIPAM; por lo tanto, son necesarios más estudios en esta dirección.

Abreviaturas

EEET:

Transferencia de energía de excitación electrónica

LCST:

Baja temperatura crítica de la solución

NS:

Nanosistema

PNIPAM:

Poli-N-isopropilacrilamida

PPO:

Difeniloxazol

PD:

Poliestireno

TEM:

Microscopía electrónica de transmisión

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