Ferumoxitol atenúa la función de las MDSC para mejorar la inmunosupresión inducida por LPS en la sepsis

Habilidades de MDSC, macrófagos y países en desarrollo para captar FMT. un Los macrófagos se trataron con FMT (1000 ng / mL) durante 24 h, luego se tiñeron con azul de Prusia para determinar la presencia celular y la deposición de hierro entre tres grupos:antes de la separación magnética, seleccionados magnéticamente (FMT +), no aislados magnéticamente (FMT-) . b Se incubaron esplenocitos de ratones C57BL / 6 sin tratamiento previo con FMT durante 6 h, 12 h, 24 hy 48 h. Análisis FACS de los porcentajes de MDSC, macrófagos y países en desarrollo en dos subconjuntos:antes de la separación magnética, células positivas para FMT. c Relación de células positivas para FMT a células antes de la separación magnética. Todos los datos son representativos de tres experimentos independientes para cada grupo experimental y se muestran como la media ± desviación estándar

FMT inhibe la expansión de MDSC in vitro

Se ha informado que FMT induce un cambio fenotípico en los macrófagos M2 hacia un CD86 ⁺ alto , Subtipo de macrófago M1 positivo para TNF-α [3]. Dado que hay una gran cantidad de MDSC que pueden tomar FMT, planteamos la hipótesis de que FMT puede alterar la función de las MDSC. En primer lugar, se evaluaron los efectos citotóxicos de FMT a 250, 500, 1000 y 2000 μg / ml en las MDSC mediante el ensayo de viabilidad celular CCK8. Los resultados mostraron que FMT no tuvo ningún efecto sobre la viabilidad celular a dosis bajas y solo exhibió una citotoxicidad moderada a la dosis máxima de 2000 μg / mL (Fig. 2a). Luego probamos si FMT en diferentes concentraciones afectaría la generación de MDSC. Las células de la médula ósea aisladas de ratones C57BL / 6 sin tratamiento previo se trataron con medio o varias concentraciones de FMT (250, 500, 1000 y 2000 μg / ml) durante 4 días, seguido de la caracterización por citometría de flujo el día 4. GM-CSF y Se añadió IL-6 el día 0. Los resultados de tres experimentos independientes revelaron que FMT a 1000 y 2000 μg / mL disminuyó significativamente la expansión de MDSC (Fig. 2b, c).

Cuantificación por citometría de flujo del porcentaje de CD11b ⁺ Gr-1 ⁺ células después del tratamiento con FMT a 250, 500, 1000, 2000 μg / mL in vitro. un La viabilidad de las células MDSC se detectó usando ensayos CCK8 después del tratamiento con varias concentraciones de FMT durante 24 h. b , c Se cultivaron células de médula ósea aisladas de ratones C57BL / 6 durante 4 días con GM-CSF e IL-6 en presencia de diferentes concentraciones de FMT, y se evaluaron los fenotipos celulares mediante citometría de flujo. Todos los datos son representativos de tres experimentos independientes para cada grupo experimental y se muestran como la media ± desviación estándar. * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 según lo determinado por la t de un estudiante no emparejado prueba versus células tratadas con vehículo solo

FMT reduce la capacidad inmunosupresora de las MDSC

Las MDSC utilizan varios mecanismos para inhibir la proliferación y la función efectora de las células T, siendo el mejor descrito la producción de ROS y Arg-1. La expresión del componente p47phox del complejo nicotinamida adenina dinucleótido fosfato oxidasa (NOX) es responsable de la producción de ROS en las MDSC [5]. Se informó que S100A8 / A9 es sintetizado y secretado por MDSC en un circuito inflamatorio autocrino y que esto es importante en la supresión de la función de las células dendríticas en modelos de ratón [16]. Para determinar si FMT podría alterar la función de MDSC, obtuvimos MDSC derivadas de BM como se describió anteriormente y usamos RT-PCR para medir la expresión de ARNm en MDSC tratadas con FMT versus controles no tratados. Los resultados revelaron que las MDSC tratadas con FMT redujeron significativamente los niveles de expresión de Arg-1, S100A8, S100A9 y p47phox en comparación con las MDSC no tratadas (Fig. 3a-h). A continuación, evaluamos los niveles de ROS en las MDSC de control y las MDSC tratadas con FMT. Los resultados revelaron que las MDSC tratadas con FMT mostraron un nivel significativamente más bajo de ROS que las células de control (Fig. 3i, j). Posteriormente comparamos los cambios en las subpoblaciones de MDSC en los grupos tratados con FMT y sin tratar. Los resultados mostraron que FMT disminuyó el porcentaje de G-MDSC, observándose también un ligero aumento en M-MDSC (Fig. 3k, l).

FMT altera la función de las MDSC in vitro. MDSC derivadas de la médula ósea tratadas con vehículo o FMT durante 24 h. un - h Expresión génica de Arg-1, S100A8, S100A9 y p47phox de las MDSC tratadas, medida por RT-PCR cuantitativa. yo Las MDSC derivadas de BM se incubaron con FMT durante 24 horas y la FCM detectó la producción de ROS. j Datos cuantitativos de i . k Subpoblaciones de MDSC en los grupos de control y tratados con FMT. l Análisis FACS de los porcentajes de G-MDSC y M-MDSC. Todos los datos son representativos de tres experimentos independientes para cada grupo experimental y se muestran como la media ± desviación estándar. * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 según lo determinado por la t de un estudiante no emparejado prueba versus células tratadas con vehículo solo

FMT promueve la diferenciación de MDSC en macrófagos

Para determinar si FMT estimula la diferenciación final de MDSC en macrófagos, tratamos las células con 1000 μg / mL FMT el día 0 y realizamos citometría de flujo para los marcadores asociados a macrófagos CD11b y F4 / 80 en los días 1, 3 y 5. El Los resultados mostraron que 1 día después de la adición de 1000 μg / ml de FMT, la proporción de macrófagos aumentó significativamente en más de 2 veces en comparación con las células no tratadas. De manera similar, 3 días y 5 días después del tratamiento con FMT, las proporciones de macrófagos también aumentaron significativamente (Fig. 4a, b).

Efecto de FMT en la diferenciación de MDSC. un , b Las MDSC derivadas de la médula ósea se trataron con o sin 1000 μg / ml de FMT y el número de macrófagos se evaluó después de 1 día, 3 días y 5 días mediante FACS. Todos los datos son representativos de tres experimentos independientes para cada grupo experimental y se muestran como la media ± desviación estándar. * p <0,05, frente a células tratadas con vehículo solo

FMT mejora los síntomas en ratones sépticos inducidos por LPS

Se ha informado de que la sepsis se asocia con daño tisular y conduce a insuficiencia orgánica y disfunción endotelial [17]. Para investigar si el FMT reduce los síntomas tardíos de la sepsis, se evaluó la extensión del daño orgánico en los ratones experimentales después de 10 días. Un examen histopatológico de los pulmones en la sepsis inducida por LPS indicó que FMT redujo el reclutamiento de glóbulos blancos y el engrosamiento de la pared alveolar en comparación con los ratones tratados con vehículo. La tinción H&E también reveló que el área de necrosis hepática era más pequeña en los ratones tratados con FMT en comparación con los ratones tratados con vehículo (Fig. 5a, b). Además, los niveles séricos de aspartato transaminasa, usados ​​como marcador bioquímico de disfunción hepática en estos animales, fueron significativamente más bajos en los hígados de ratones tratados con FMT en comparación con el control (Fig. 5c). Sin embargo, FMT no afectó los niveles de alanina aminotransferasa (Fig. 5d). Además, se cree que la sepsis está asociada con resultados adversos como la producción elevada de citocinas inflamatorias; por lo tanto, evaluamos los cambios en los niveles de citocinas proinflamatorias en el suero. El nivel de TNF-α en el suero fue levemente, pero no significativamente, menor en los ratones tratados con FMT 3 h después de la inyección de LPS, y no se observaron diferencias en los niveles de MCP-1 o IL-1β entre los ratones tratados con FMT y el vehículo. ratones tratados (Fig. 5e-g).

FMT mejora la lesión hepática en ratones sépticos inducidos por LPS. un Los ratones recibieron PBS o un i.p. inyección de 5 mg / kg de peso corporal de LPS bacteriano el día 0. Después de 1 hy 5 días, se administró FMT a una dosis de 10 mg / kg o 100 µl de solución salina a través de la vena de la cola. Los ratones se dividieron en cuatro grupos ( n =6):control, vehículo receptor; LPS, solo recibe LPS; FMT, recibiendo FMT solamente; y LPS + FMT, recibiendo LPS y FMT. b Los tejidos de pulmón e hígado se tiñeron con hematoxilina y eosina. c-d Se midieron las transaminasas séricas (ALT y AST) ( n =6). Los niveles de citocinas (TNF-a, IL-1β y MCP-1) se midieron mediante ELISA. e - g Efectos de la sepsis inducida por LPS sobre la producción de citocinas en ratones tratados con vehículo o ferumoxitol. Niveles de citocinas medidos por ELISA en el suero de ratones tratados con vehículo o ferumoxitol siguiendo i.p. Prueba de LPS (50 mg / kg). ** p <0.01 según lo determinado por la t de un estudiante no emparejado prueba

FMT disminuye la cantidad de MDSC en el bazo de ratones sépticos inducidos por LPS

Hay cada vez más pruebas que respaldan que la inmunosupresión asociada a la sepsis aumenta la mortalidad [18], y las MDSC se consideran un componente importante de la red inmunosupresora [8]. Se ha informado que las G-MDSC se expanden más específicamente en pacientes sépticos y parecen ser los principales actores de la inmunosupresión inducida por sepsis [12]. Para determinar si FMT modula las poblaciones de MDSC en ratones de tipo salvaje, se administró FMT a ratones C57BL / 6 a través de la vena de la cola en la hora 1 y el día 5. Los resultados mostraron que no se detectaron diferencias significativas en el porcentaje de MDSC en el bazo o el hueso. médula entre el control y los ratones tratados con FMT (Fig. 6a, e). Es de destacar que FMT disminuyó la expansión dependiente de LPS de CD11b ⁺ Gr-1 ⁺ células tanto en la médula ósea como en el bazo (Fig. 6a, e), lo que concuerda con los estudios in vitro. Además, FMT también disminuyó el porcentaje de G-MDSC y M-MDSC en el bazo, mientras que sólo el porcentaje de G-MDSC disminuyó en la médula ósea (Fig. 6c, g). Estos datos indican que FMT disminuye el número de MDSC en el bazo de ratones sépticos inducidos por LPS.

FMT disminuye el número de MDSC en ratones sépticos inducidos por LPS. Los ratones se dividieron en cuatro grupos ( n =6):control, vehículo receptor; LPS, solo recibe LPS; FMT, recibiendo FMT solamente; y LPS + FMT, recibiendo LPS y FMT. un CD11b ⁺ Gr-1 ⁺ Las poblaciones de células en la médula ósea fueron detectadas por FACS. b Datos cuantitativos de a . c Gráfico de puntos de citometría de flujo de la expresión de Ly6C y Ly6G en el CD11b cerrado ⁺ células de bazos. d Cuantificación de los porcentajes de los subconjuntos de granulocitos y monocitos. e CD11b ⁺ Gr-1 ⁺ Las poblaciones de células en los bazos fueron detectadas por FCM. f Datos cuantitativos de e . g Gráfico de puntos de citometría de flujo de la expresión de Ly6C y Ly6G en las células CD11b + controladas de bazos. h Cuantificación de los porcentajes de los subconjuntos de granulocitos y monocitos. * p <0.05 según lo determinado por la t de un estudiante no emparejado prueba

FMT reduce las propiedades inmunosupresoras de células T de las MDSC in vivo

La reducción numérica de múltiples poblaciones de células inmunitarias, incluidas las células T CD4 y CD8, es una característica importante de la respuesta inmunitaria adaptativa después de la sepsis. Se asocia con un mayor riesgo de muerte, así como con otros resultados desfavorables [19, 20]. Se ha demostrado que las MDSC suprimen la proliferación de células T al alterar la expresión de la cadena zeta de las células T en pacientes con sepsis [21]. Para evaluar la proporción de linfocitos en la sepsis en etapa tardía, medimos la proporción de células T CD4 y CD8 en un modelo de sepsis murina. Los resultados mostraron que el FMT provocó un aumento en las células T CD4 y CD8 en los bazos de los ratones inducidos por LPS (Fig. 7a, b). No hubo diferencias en los porcentajes de células T CD4 y CD8 en el bazo de los ratones tratados con FMT en comparación con los ratones de control (Fig. 7a, b). Para confirmar aún más el papel de las MDSC en la supresión de la proliferación de células T in vivo, se aislaron G-MDSC y M-MDSC de los bazos de ratones expuestos a LPS tratados con vehículo o FMT mediante MACS y se cocultivaron con células T CD3 a una proporción de 1:1 proporción. Nuestros resultados mostraron que el tratamiento con FMT redujo las funciones inmunosupresoras de las células T tanto de las G-MDSC como de las M-MDSC (Fig. 7e, f). Además, también medimos los niveles de expresión de Arg-1 y p47phox en MDSC aisladas de bazos de ratones. Como se esperaba, la expresión de los genes Arg-1 y p47phox se redujo significativamente en CD11b esplénico ⁺ Gr-1 ⁺ células aisladas de ratones expuestos a LPS tratados con FMT en comparación con ratones expuestos a LPS (Fig. 7g, h). Estos datos indican que FMT disminuyó las funciones inmunosupresoras de las MDSC al disminuir la producción de Arg-1 y ROS, lo que sugiere que FMT puede reducir la inmunosupresión a largo plazo en la sepsis en etapa tardía.

FMT reduce las propiedades inmunosupresoras de las MDSC. un CD3 ⁺ CD4 ⁺ Las poblaciones de células en los bazos fueron detectadas por FACS. b Datos cuantitativos de a . c CD3 ⁺ CD8 ⁺ Las poblaciones de células en los bazos fueron detectadas por FACS. d Datos cuantitativos de a . e La capacidad de las G-MDSC de ratones para suprimir la proliferación de células T inducida por la estimulación anti-CD3 / CD28 se midió mediante FACS ( n =3 por grupo). Se muestra un histograma representativo. f La capacidad de las M-MDSC de ratones expuestos a LPS tratados con vehículo o FMT para suprimir la proliferación de células T inducida por la estimulación anti-CD3 / CD28 se midió mediante FACS ( n =3 por grupo). Se muestra un histograma representativo. g , h Expresión de ARNm de Arg-1 y p47phox en MDSC de ratones expuestos a LPS con vehículo o tratados con FMT