Biosensor de transistor de efecto de campo de grafeno magnético para detección de ADN monocatenario

Introducción

La detección de ADN es de gran importancia para el estudio de la biología molecular y el diagnóstico de enfermedades genéticas [1, 2, 3]. Hasta la fecha, se han desarrollado varios biosensores para la detección de ADN, incluidos biosensores fluorescentes [4, 5], biosensores electroquímicos [6,7,8,9] y biosensores de transistores de efecto de campo (FET) [10,11,12,13 ], habiendo atraído esta última una gran atención debido a su alta sensibilidad y especificidad. Kaisti y col. [12] desarrolló un biosensor FET para detectar ADN monocatenario sin marcar utilizando sondas de ácido nucleico de péptidos. Kim y col. [13] fabricó un sensor de carga de ADN tipo FET basado en tecnología de semiconductores de óxido metálico complementario estándar.

Debido a su alta superficie específica, alta conductividad eléctrica y excelente movilidad de electrones, el grafeno ha sido anunciado como un material ideal para la fabricación de biosensores FET [14, 15, 16]. Cai y col. [15] desarrolló un biosensor de grafeno FET (GFET) para la detección ultrasensible de ADN a través de la hibridación de ADN de ácido nucleico peptídico. Nuestro grupo también ha propuesto un biosensor de GFET multicanal para determinar la cinética de unión y la afinidad de la hibridación del ADN y la falta de coincidencia de una sola base [16].

En un GFET convencional, un campo eléctrico de electrodo de puerta externo genera una capa conductora doble en la interfaz entre la película de grafeno y el electrolito en solución [17,18,19]. Basado en un modelo cautivo de GFET [16], el electrodo de puerta carga y descarga la capa conductora doble a través del electrolito, modulando así la conductividad de GFET. Por lo tanto, la conductividad de un GFET está relacionada con la intensidad del campo eléctrico externo y la concentración de iones en el electrolito.

Durante la investigación, se encontró que la investigación sobre la sensibilidad de los GFET ha alcanzado el nivel fM. Por ejemplo, Ping et al. [20] y Zheng et al. [21] han informado de biosensores GFET convencionales con límite de detección en el nivel de fM. Sin embargo, la literatura anterior logra una sensibilidad extremadamente alta mediante la detección del analizador de semiconductores, lo cual es costoso e inconveniente para aplicaciones prácticas. Además, los electrodos de Ag / AgCl se utilizan comúnmente como electrodos de puerta externos, que no son adecuados para la construcción de biosensores integrados debido a su tamaño y capacidad de reutilización.

En este documento, se desarrolló un biosensor magnético GFET (MGFET), en el que se utiliza un campo magnético en lugar de un campo eléctrico para modular la conductividad GFET. El canal conductor se logró mediante una película de grafeno de deposición química en fase de vapor (CVD) transferida a un sustrato de vidrio con dos electrodos de óxido de indio y estaño (ITO). La película de grafeno se funcionalizó con éster succinimidílico del ácido 1-pirenobutanoico (PBASE) para permitir la unión de un aptámero de sonda para capturar e hibridar con ADN monocatenario (ADNc) complementario marcado magnéticamente. Aplicando un campo magnético periódico en la parte posterior de los MGFET, se logró una impedancia eléctrica MGFET periódica. Además, la fluctuación de la impedancia eléctrica de los MGFET en un campo magnético periódico estaba relacionada con la concentración de ADNc. Se construyó un dispositivo de detección de laboratorio correspondiente para detectar la impedancia MGFET en tiempo real. Dado que el campo magnético no está en contacto con los MGFET directamente, los MGFET preparados aquí son más fáciles de integrar y aplicar que los biosensores GFET convencionales. La preparación de MGFET, la construcción del sistema de detección hecho en laboratorio y el principio de detección se describieron en detalle en este documento.

Métodos

Materiales e instrumentos

Se adquirió un sustrato de vidrio con electrodos ITO de Hua Nan Xiang Cheng Ltd. (China). El aptámero de la sonda, el ADNc y el ADN no emparejado se adquirieron de Sangon Biotech Inc. (Shanghai, China). La secuencia del aptámero de la sonda fue (5′-NH ₂ -TGG ACC CCC TCA TAA CGC CTC CTT TTC-FAM-3 ′), la secuencia del ADN complementario era (5′-NH ₂ -GAA AAG GAG GCG TTA TGA GGG GGT CCA-3 ′), la secuencia del ADN completamente desacoplado era (5′-NH ₂ -TCC CCT TCT TAT GGC CTG TTT TTC AAC-3 ′), y la secuencia del ADN no coincidente de una sola base era (5′-NH ₂ -GAA AAG GAG TCG TTA TGA GGG GGT CCA-3 ′). Se obtuvieron PBASE y dimetilsulfóxido (DMSO) de Sigma-Aldrich (Shanghai, China). Se obtuvieron nanoperlas magnéticas (MB) modificadas con grupos carboxilo (10 mg / ml) de Xianfeng Nano Material Technology Co., Ltd. (Nanjing, China). Se adquirieron clorhidrato de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida, N-hidroxisuccinimida, dodecilbencenosulfonato de sodio (SDS) y solución salina tamponada con dodecilsulfato de sodio (PBS, P5368-10PAK; pH 7,4) de Sigma-Aldrich (Shanghai , China).

Se utilizó un sistema microscópico Raman (SPEX-1403, SPEX) para caracterizar la calidad del grafeno y para verificar la funcionalización de MGFET. Se utilizó un fotómetro de fluorescencia (LS55, PerkinElmer) para caracterizar el acoplamiento de nanopartículas magnéticas al ADNc. Se utilizó un sistema de adquisición de datos hecho en laboratorio para registrar la impedancia de MGFET en tiempo real.

Acoplamiento de ADNc a MB

Después de dispersar uniformemente por ultrasonido durante 20 min, se mezcló una suspensión de 20 μL de MB modificados con grupos carboxilo con 200 μL de clorhidrato de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (2 mg / mL) y 200 μL de N- hidroxisuccinimida (2 mg / ml) durante 15 min para obtener MB activados [22, 23]. Luego, se agregaron 20 μl de solución de ADNc a la solución de MB y se incubó durante 2 ha temperatura ambiente con agitación suave continua. Luego se introdujo un campo magnético para enriquecer las muestras de ADNc a través de MB. Los conjugados de nanoperlas magnéticas / ADN (MB / ADNc) se lavaron tres veces con PBS y se dispersaron en PBS para su uso futuro.

Fabricación de MGFET

La preparación de MGFET se describe en detalle a continuación. En primer lugar, se transfirió una película de grafeno CVD a una placa de vidrio como canal conductor entre los dos electrodos ITO (Fig. 1a), como se describió anteriormente [18, 19]. En segundo lugar, se inyectó PBASE (10 mM) disuelto en DMSO en los MGFET durante 12 horas a temperatura ambiente y se dejó reaccionar completamente con el grafeno mediante apilamiento π – π (Fig. 1b). A continuación, los MGFET se lavaron sucesivamente con DMSO y PBS para eliminar cualquier PBASE sin reaccionar. En tercer lugar, se introdujeron 2 µM del aptámero de sonda en los MGFET y se incubaron con PBASE durante 4 horas a temperatura ambiente, lo que permitió que el aptámero de sonda reaccionara suficientemente con PBASE (Fig. 1c). A continuación, los MGFET se lavaron respectivamente con SDS al 0,2% tres veces para eliminar cualquier aptámero de sonda no unido.

Principio de funcionalización y detección de los MGFET. un Película de grafeno crecida por deposición de vapor químico. b Funcionalización del grafeno por PBASE. c Inmovilización de aptámero de sonda mediante PBASE. d Hibridación del aptámero de sonda con cDNA. e Fotografía del dispositivo de detección

Resultados y discusión

Caracterización de MGFET

La película de grafeno producida por el método CVD se transfirió a un sustrato de vidrio como canal conductor entre dos electrodos ITO (Fig. 1a). La película de grafeno transferida se caracterizó con espectro Raman (Fig. 2). La aparición de los tres picos característicos del grafeno demostró la transferencia exitosa de la película de grafeno sobre el sustrato de vidrio [24, 25]. La relación de intensidad entre la banda 2D y la banda G (I _2D / I _G ) indicó que el grafeno transferido era una película multicapa [26]. Además, la relación de intensidad entre la banda D y la banda G (I _D / I _G ) era pequeño, lo que indica una densidad de defectos muy baja.

Espectro Raman

Debido a la falta de grupos funcionales, las cadenas de aptámeros fueron difíciles de modificar en la película de grafeno CVD. Por lo tanto, basándose en su grupo pirenilo aromático, PBASE se modificó en las películas de grafeno mediante apilamiento π – π como enlazador. En el otro extremo de PBASE, la porción succinimida de PBASE podría acoplarse al 5′-NH ₂ aptámero de sonda marcado basado en la reacción de reticulación de N-hidroxisuccinimida (NHS) (Fig. 1c). Para evaluar la unión del aptámero de la sonda en la película de grafeno, se marcó el extremo 3 'del aptámero de la sonda utilizando el fluoróforo FAM (secuencia:5′-NH ₂ -TGG ACC CCC TCA TAA CGC CTC CTT TTC-FAM-3 ′). Inmediatamente después de la introducción del aptámero, la intensidad de la fluorescencia se incrementó obviamente, lo que indica su modificación exitosa en la superficie del grafeno (Fig. 3). El aumento de la concentración de aptámeros de la sonda condujo a un aumento de la intensidad de la fluorescencia, alcanzando un valor constante y, por lo tanto, indicando una saturación de aptámeros de la sonda en los MGFET, a aproximadamente 2 μM. Por lo tanto, los experimentos posteriores se realizaron a una concentración de aptámero de sonda de 2 μM.

Caracterización de la modificación de MGFET mediante aptámero de sonda. La barra de error representa la desviación estándar de 5 análisis independientes

Caracterización de MB / ADNc

La morfología de los conjugados MB y MB / ADNc se caracterizó mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) (Fig. 4a, b). La distribución del tamaño de partícula de MB mostró un tamaño de partícula promedio de aproximadamente 7 nm (Fig. 4c). Con el fin de garantizar la sensibilidad y precisión en la biodetección del cDNA, los MB deberían ser excesivos para el cDNA con el fin de capturar el cDNA por completo. Se activaron MB a una concentración de 4 mg / ml para asegurar la unión a las muestras de ADNc que se utilizan en la presente. Mediante el marcaje de cDNA por FAM, se aprovechó la intensidad de la fluorescencia para caracterizar la eficacia de acoplamiento y optimizar la concentración de cDNA (Fig. 4d). De hecho, la intensidad de la fluorescencia del sobrenadante disminuyó obviamente después de la introducción de MB en las soluciones de ADNc, lo que indica que el ADNc fue capturado y enriquecido por los MB. La captura exitosa de ADNc por MB se confirmó mediante la observación de que, a una concentración de ADNc de 10 nM, la intensidad de fluorescencia del sobrenadante era equivalente a la del PBS, lo que indica que todo el ADNc fue capturado y enriquecido por MB (Fig. 4d ).

Caracterización del acoplamiento MB / cDNA. un TEM de MB. b TEM de conjugados MB / cDNA. c Distribución del tamaño de partícula de MB. d Caracterización del acoplamiento MB / cDNA (FAM). La barra de error representa la desviación estándar de 5 análisis independientes

Análisis de la intensidad del campo magnético

Se añadieron conjugados MB / cDNA a los MGFET durante 10 min para permitir la hibridación completa del cDNA con el aptámero de sonda. Dado que el aptámero de sonda no podría acoplarse con MB sin los grupos amino modificados, el exceso de MB podría eliminarse mediante el lavado de los MGFET tres veces con PBS. Por lo tanto, solo quedaron los conjugados MB / ADNc en los MGFET (Fig. 1d). Se montó un imán permanente en un motor giratorio para aplicar un campo magnético periódico a los MGFET (Fig. 1e). Se utilizó un dispositivo de detección de laboratorio para registrar la fluctuación de impedancia de los MGFET.

Dado que la impedancia de los MGFET fue modulada por un campo magnético como puerta trasera, se investigó la correlación entre la intensidad del campo magnético y la impedancia de los MGFET para optimizar los parámetros de intensidad del campo magnético (Fig. 5). En general, se cree que la doble capa conductora formada entre el grafeno y el electrolito está modulada por el campo eléctrico externo, modulando así la conductividad de los GFET [19, 27, 28]. En MGFET, a través de la fuerza magnética entre los MB y el campo magnético, la distancia entre los conjugados MB / cDNA y la película de grafeno se controló mecánicamente, modulando así la doble capa conductora de MGFET [29, 30]. La impedancia de los biosensores MGFET varió con el aumento de la intensidad del campo magnético en tres etapas, lo que podría explicarse tomando la cadena MB / cDNA como una varilla delgada elástica [31]. La primera etapa ocurrió con una intensidad de campo magnético de menos de 100 mT en este trabajo. Basado en el modelo elástico de varilla delgada de las cadenas de ADN, debido a que la fuerza del campo magnético es menor que la fuerza de soporte radial de la hebra de ADN, la fuerza del campo magnético es difícil de hacer que la hebra de ADN se doble; por lo tanto, los MGFET no son sensibles al campo magnético. En la segunda etapa con la fuerza del campo magnético de 100 a 200 mT, la fuerza del campo magnético es suficiente para superar la fuerza de soporte radial de la varilla delgada elástica de ADN, lo que da como resultado una flexión rápida del MB / ADNc y luego una respuesta sensible de los MGFET al campo magnético. Finalmente, en la tercera etapa con una intensidad de campo magnético superior a 220 mT, la flexión de la varilla elástica del ADN alcanza su límite; por lo tanto, los MGFET no responderán al cambio del campo magnético, lo que da como resultado una impedancia estable de los MGFET como se muestra en la Fig. 5b.

Influencia de la intensidad del campo magnético en la impedancia de MGFET. un Impedancia de MGFET bajo una intensidad de campo magnético variable en el dominio del tiempo. b Relación entre la impedancia de MGFET y la intensidad del campo magnético. La barra de error representa la desviación estándar de 5 análisis independientes

Detección de ADNc

Los cambios en la impedancia MGFET con concentraciones variables de conjugado MB / cDNA se midieron bajo una fuerza de campo magnético fijo de 240 mT para determinar la viabilidad y sensibilidad para la detección de cDNA.

La impedancia de MGFET a cada concentración de cDNA se registró en tiempo real (Fig. 6a). Cuando se cargó un imán permanente en la parte posterior de los MGFET, la impedancia aumentó rápidamente. Por el contrario, cuando se aplicó un campo magnético periódico, se observó un cambio periódico en la impedancia. Sobre la base de esta periodicidad de impedancia, se utilizó un algoritmo de integración de muestras (SIA) para aumentar la relación señal-ruido de los MGFET. Dado el período sin aplicar campo magnético fue T ₀ y el período con la aplicación del campo magnético fue T _M (Fig. 6a), el SIA podría describirse con los siguientes pasos:(1) durante T ₀ , todos los puntos de datos, producidos por el ruido, se normalizaron a cero, (2) los puntos de datos obtenidos durante cada T _M período fueron muestreados y promediados en orden. Después del procesamiento de SIA durante cuatro ciclos, se obtuvo el cambio periódico de impedancia en MGFET como se muestra en la Fig. 6b. En teoría, la relación señal-ruido de los MGFET podría mejorarse eficazmente utilizando tiempos de muestreo suficientemente largos.

un Dominio temporal de las fluctuaciones de impedancia con diferentes concentraciones de ADNc. b Cambios de impedancia de MGFET según la concentración de ADNc

Los cambios de impedancia en MGFET tenían una correlación positiva con la concentración de cDNA (Fig. 6b). Se evaluó la correlación entre el cambio de impedancia de MGFET y la concentración de ADNc (Fig. 7). La alta sensibilidad de los biosensores MGFET en este trabajo se basa principalmente en los dos aspectos siguientes:en primer lugar, el movimiento mecánico de los conjugados MB / cDNA podría mejorar el efecto de modulación en la doble capa conductora en comparación con el caso del ADN solo, y en segundo lugar, Dado que se podría aplicar un campo magnético periódico para producir cambios periódicos de impedancia de MGFET, según el principio de integración de muestreo, solo se muestreó e integró la impedancia MGFET con el campo magnético para reducir el ruido. Por lo tanto, la relación señal / ruido del sistema podría optimizarse en gran medida aumentando el número de períodos del campo magnético externo.

Relación entre impedancia de MGFET y concentración de ADN diana. La barra de error representa la desviación estándar de 5 análisis independientes

Selectividad de los MGFET

La especificidad de los MGFET se evaluó mediante la detección de dos secuencias de ADN diana diferentes, incluidas cadenas de ADN completamente mal emparejadas y cadenas de ADN mal emparejadas de una sola base. Similar al procedimiento descrito anteriormente, un ADN completamente desacoplado (secuencia:5′-NH ₂ -TCC CCT TCT TAT GGC CTG TTT TTC AAC-3 ′) y ADN desparejado de una sola base (secuencia:5′-NH ₂ -GAA AAG GAG TCG TTA TGA GGG GGT CCA-3 ') se acoplaron a MB, respectivamente. El MB / ADN no emparejado disuelto en solución de PBS se añadió a los biosensores MGFET durante 10 min para reaccionar suficientemente con el aptámero. Los MGFET se lavaron con PBS tres veces para eliminar el ADN no emparejado. Para las cadenas de ADN completamente disparejas, debido a que el conjugado de MB / ADN no pudo hibridar con el aptámero, se eliminaron casi todos los conjugados de MB / ADN. Por lo tanto, la adición de MB / ADN completamente desajustados casi no tiene ningún efecto sobre la conductividad del grafeno como se muestra en la Fig. 8, lo que indica una alta selectividad del biosensor. Además, también hemos investigado la selectividad de los biosensores a través de cadenas de ADN mal emparejadas de base única como se muestra en la Fig. 7. Se puede encontrar que el cambio de impedancia MGFET con cadenas mal emparejadas de base única fue ligeramente menor que las cadenas complementarias y mayor que la hebra diana no complementaria en cada concentración determinada. Por lo tanto, la cadena de una sola base no emparejada podría ser detectable en este trabajo. Aunque el aptámero y las cadenas de ADN complementarias son todos productos comerciales que determinan principalmente la selectividad de los biosensores, los MGFET y su sistema de detección también han contribuido a la alta sensibilidad para la detección de ADN.

Relación entre la impedancia de MGFET y la concentración de ADN completamente incompatible. La barra de error representa la desviación estándar de 5 análisis independientes

Conclusiones

Aquí, se presentó un biosensor MGFET basado en grafeno y nanopartículas magnéticas para detectar ADNc. En los MGFET, las nanopartículas magnéticas se modificaron en el extremo de la secuencia de ADNc. Mediante la fuerza magnética entre los MB y el campo magnético, se controló mecánicamente la distancia entre los conjugados MB / ADNc y la película de grafeno, modulando así la doble capa conductora de los MGFET. Además, también podemos concluir que, para una hebra de ADN en particular, la impedancia de los MGFET reflejará la tensión de la hebra de ADN, que a su vez refleja la flexión de la hebra de ADN (recuadro, Fig. 5b). Por tanto, los MGFET actuales tienen el potencial de utilizarse en el estudio de los parámetros mecánicos de las cadenas de ADN. Por lo tanto, los MGFET pueden no solo funcionar como un biosensor para la detección de ADNc, sino que también pueden detectar potencialmente los parámetros mecánicos de las cadenas de ADN.

Disponibilidad de datos y materiales

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en el artículo.

Abreviaturas

ADNc:

ADN monocatenario complementario marcado magnéticamente

CVD:

Deposición de vapor químico

DMSO:

Dimetilsulfóxido

FET:

Transistor de efecto de campo

GFET:

Transistor de efecto de campo de grafeno

MB:

Nanoperlas magnéticas

MGFET:

Transistor de efecto de campo de grafeno magnético

NHS:

N-hidroxisuccinimida

PBASE:

Éster succinimidílico del ácido 1-pirenobutanoico

PBS:

Solución salina tamponada con dodecilsulfato de sodio y fosfato

SDS:

Dodecilbencenosulfonato de sodio

SIA:

Ejemplo de algoritmo de integración

TEM:

Microscopía electrónica de transmisión

ITO:

Óxido de indio y estaño

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