Biosensor de transistor de efecto de campo de grafeno magnético para detección ultra-sensible de ADN de cadena simple

Resumen

En este trabajo presentamos un biosensor de transistor de efecto de campo de grafeno magnético (MGFET) fabricado transfiriendo una película de grafeno de deposición química de vapor (CVD) sobre un sustrato de vidrio para formar el canal conductor y capa de sensado. La superficie de grafeno se funcionaliza con éster succinimidilo de ácido 1-pirenobutanoico (PBASE), que actúa como ancla molecular para inmovilizar un aptámero sonda. ADN de cadena simple complementario (cDNA) marcado magnéticamente es capturado vía hibridación con el aptámero, y la interacción se transduce en un cambio medible de impedancia. Bajo un campo magnético modulado periódicamente, la impedancia del MGFET exhibe oscilaciones cuya amplitud es directamente proporcional a la concentración de cDNA. Usando este principio, el sensor detecta ADN de cadena simple con límite de detección de 1 pM. El comportamiento observado se racionaliza mediante un modelo en el que la fuerza magnética dobla el complejo ADN-perla, modulando así la capacitancia de doble capa del canal de grafeno. Al aplicar un campo magnético periódico, la impedancia puede muestrearse repetidamente, permitiendo mejora de la relación señal-ruido (SNR) mediante integración sobre múltiples periodos. Este estudio demuestra un biosensor de ADN altamente sensible y sugiere su potencial aplicabilidad a otras biomoléculas y ensayos celulares.

Introducción

La detección de ADN es fundamental para investigación en biología molecular y diagnóstico de trastornos genéticos [1–3]. En la última década, se han desarrollado biosensores basados en fluorescencia [4,5], electroquímica [6–9] y transistores de efecto de campo (FET) [10–13] para este propósito, con sensores tipo FET ganando atención particular por su sensibilidad y especificidad inherentes. Kaisti et al. introdujeron un FET funcionalizado con ácido péptido-nucleico para detección de ADN de cadena simple sin etiquetas [12], mientras Kim et al. fabricaron un sensor de carga de ADN basado en semiconductor complementario de óxido metálico (CMOS) [13]. El grafeno, con su excepcional área superficial, conductividad eléctrica y movilidad de portadores, ha emergido como plataforma ideal para construir biosensores FET [14–16]. Cai y colegas reportaron un FET de grafeno (GFET) capaz de detección ultra-sensible de ADN vía hibridación de ácido péptido-nucleico [15], y nuestro grupo demostró previamente un GFET multi-canal para estudiar cinética de unión de ADN y desajustes de pares de bases [16]. En GFETs convencionales, un electrodo de compuerta externo genera un campo eléctrico que establece una doble capa en la interfaz grafeno-electrolito [17–19], modulando la conductancia del dispositivo. Estudios recientes han logrado límites de detección femtomolares con GFETs [20,21]; sin embargo, estas altas sensibilidades dependen de analizadores de semiconductores caros y electrodos de referencia Ag/AgCl, limitando despliegue práctico. Para superar estos desafíos, ideamos un FET de grafeno magnético (MGFET) que usa un campo magnético, en lugar de una compuerta eléctrica, para modular el canal de grafeno. El MGFET incorpora una película de grafeno CVD transferida sobre sustrato de vidrio flanqueada por electrodos de óxido de indio-estaño (ITO). El grafeno se funcionaliza con PBASE, permitiendo unión covalente de un aptámero sonda que captura cDNA marcado magnéticamente. Al someterse a un campo magnético periódico, la impedancia del MGFET oscila de manera que correlaciona con la concentración de cDNA. Este enfoque magnético elimina contacto directo de electrodos, simplificando integración y ampliando aplicabilidad. Las siguientes secciones detallan la fabricación, sistema de detección y mecanismo subyacente de este novedoso biosensor MGFET.

Métodos

Materiales e Instrumentos

Un sustrato de vidrio con electrodos ITO se obtuvo de Hua Nan Xiang Cheng Ltd. (China). El aptámero sonda, cDNA y ADN desajustado se compraron de Sangon Biotech Inc. (Shanghai, China). La secuencia del aptámero es (5′‑NH₂‑TGG ACC CCC TCA TAA CGC CTC CTT TTC‑FAM‑3′); el ADN complementario (cDNA) es (5′‑NH₂‑GAA AAG GAG GCG TTA TGA GGG GGT CCA‑3′); el ADN completamente desajustado es (5′‑NH₂‑TCC CCT TCT TAT GGC CTG TTT TTC AAC‑3′); y el ADN con desajuste de base simple es (5′‑NH₂‑GAA AAG GAG TCG TTA TGA GGG GGT CCA‑3′). PBASE y dimetil sulfóxido (DMSO) se obtuvieron de Sigma‑Aldrich (Shanghai, China). Nanoperlas magnéticas (MBs) con funcionalización carboxilo (10 mg mL⁻¹) se adquirieron de Xianfeng Nano Material Technology Co., Ltd. (Nanjing, China). 1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida clorhidrato, N-hidroxisuccinimida, dodecilbencenosulfonato de sodio (SDS) y salino fosfato tampón (PBS, pH 7,4) se compraron de Sigma‑Aldrich (Shanghai, China).

Un espectrómetro Raman (SPEX‑1403, SPEX) caracterizó calidad de grafeno y confirmó funcionalización con PBASE. Fotometría de fluorescencia (LS55, PerkinElmer) cuantificó el acoplamiento de nanopartículas magnéticas a cDNA. Un sistema de adquisición de datos personalizado registró impedancia MGFET en tiempo real.

Acoplamiento de cDNA a MBs

Tras sonicación 20 min, 20 µL de suspensión MB 4 mg mL⁻¹ se mezcló con 200 µL de EDC 2 mg mL⁻¹ y 200 µL de NHS 2 mg mL⁻¹ durante 15 min para activar los MBs [22,23]. Posteriormente, se añadieron 20 µL de cDNA e incubaron 2 h a temperatura ambiente con agitación suave. Un campo magnético enriqueció los conjugados MB/cDNA, que se lavaron tres veces con PBS y resuspendieron para uso posterior.

Fabricación de MGFETs

Los MGFETs se fabricaron en proceso de tres pasos: (1) una película de grafeno CVD se transfirió sobre una placa de vidrio sirviendo como canal conductor entre dos electrodos ITO (Fig. 1a). (2) Una solución 10 mM PBASE en DMSO se incubó sobre el grafeno 12 h a temperatura ambiente, permitiendo apilamiento π–π con la red de grafeno (Fig. 1b). Exceso de PBASE se eliminó enjuagando con DMSO y PBS. (3) Una solución 2 µM de aptámero sonda se introdujo e incubó 4 h a temperatura ambiente, permitiendo acoplamiento covalente vía éster NHS de PBASE (Fig. 1c). Finalmente, aptámero no unido se lavó con 0,2 % SDS tres veces.

Resultados y Discusión

Caracterización de MGFETs

La película de grafeno CVD se transfirió exitosamente sobre el sustrato de vidrio, confirmado por espectro Raman (Fig. 2). La presencia de picos G, D y 2D indica grafeno de alta calidad; la relación I_2D/I_G confirma película multicapa, mientras la baja relación I_D/I_G evidencia defectos mínimos [24–26].

La unión directa de aptámeros a grafeno prístino es difícil por falta de grupos funcionales; por tanto, PBASE sirve como enlazador anclado π–π. El grupo succinimida de PBASE reacciona con el 5′‑NH₂ del aptámero vía química NHS (Fig. 1c). La inmovilización exitosa del aptámero se confirmó por intensidad de fluorescencia de la etiqueta FAM en 3′ (Fig. 3). La fluorescencia aumentó con concentración de aptámero hasta meseta a ~2 µM, indicando saturación de superficie. Consecuentemente, experimentos subsiguientes emplearon concentración 2 µM de aptámero.

Caracterización de MB/cDNA

Microscopía electrónica de transmisión reveló que los MBs son ~7 nm de diámetro (Fig. 4a,b). Para maximizar eficiencia de captura, se empleó concentración 4 mg mL⁻¹ de MBs para activación. La eficiencia de acoplamiento se monitorizó midiendo la disminución de fluorescencia FAM en el sobrenadante (Fig. 4d). Se logró enriquecimiento completo de 10 nM cDNA, evidenciado por el nivel de fluorescencia del sobrenadante retornando al de PBS.

Análisis de Intensidad de Campo Magnético

Tras incubación 10 min de MB/cDNA con MGFETs, MBs no unidos se removieron con lavados PBS, dejando solo MB/cDNA en el sensor (Fig. 1d). Un imán permanente montado en motor rotativo aplicó campo magnético periódico (Fig. 1e). La impedancia del MGFET se registró usando dispositivo de detección personalizado.

Se investigó la relación entre intensidad de campo magnético e impedancia MGFET para identificar parámetros óptimos (Fig. 5). En MGFETs, la fuerza magnética dobla el complejo MB/cDNA, alterando la distancia entre el complejo y la superficie de grafeno, lo que a su vez modula la capacitancia de doble capa. Se observaron tres regímenes: (1) <100 mT, donde la fuerza magnética es insuficiente para doblar el ADN, produciendo cambio de impedancia despreciable; (2) 100–200 mT, donde el doblamiento ocurre rápidamente, produciendo respuesta de impedancia pronunciada; y (3) >220 mT, donde la varilla de ADN alcanza su límite de doblamiento, y la impedancia se estabiliza (Fig. 5b). Este modelo de varilla elástica se alinea con informes previos sobre mecánica de ADN [29,30].

Detección de cDNA

Con campo magnético fijo de 240 mT, se registraron cambios de impedancia en un rango de concentraciones MB/cDNA (Fig. 6a). La aplicación del campo magnético periódico indujo una clara oscilación de impedancia. Para suprimir ruido, se empleó un algoritmo de integración de muestreo (SIA): (1) puntos de datos durante período no magnético (T₀) se normalizaron a cero; (2) puntos durante cada período magnético (T_M) se muestrearon y promediaron; tras cuatro ciclos, se extrajo el cambio periódico de impedancia (Fig. 6b). Este enfoque mejora efectivamente SNR aprovechando muestreo repetido.

El cambio de impedancia exhibió relación lineal con concentración de cDNA (Fig. 7). La alta sensibilidad proviene de (1) el doblamiento mecánico del complejo MB/cDNA, que amplifica la modulación de la doble capa de grafeno, y (2) el campo magnético periódico que permite supresión de ruido basada en SIA. Al aumentar el número de periodos magnéticos, el SNR del sistema puede mejorarse aún más.

Selectividad de MGFETs

La selectividad se evaluó usando ADN completamente desajustado y ADN con desajuste de base simple, cada uno acoplado a MBs. Tras 10 min incubación con MGFETs y lavado PBS, el complejo MB/ADN completamente desajustado se removió mayormente, resultando en cambio de impedancia despreciable (Fig. 8a), confirmando alta selectividad. El ADN con desajuste de base simple produjo cambio de impedancia ligeramente menor que la hebra completamente complementaria pero mayor que control no complementario, demostrando que el sensor puede discriminar desajustes de base simple (Fig. 8b). Si bien la especificidad intrínseca del aptámero gobierna la selectividad, la arquitectura MGFET contribuye a la sensibilidad general.

Conclusiones

Hemos desarrollado un biosensor FET de grafeno magnético que aprovecha ADN marcado magnéticamente y un campo magnético periódico para transducir eventos de unión en oscilaciones de impedancia. La fuerza magnética dobla mecánicamente el complejo MB/cDNA, modulando la doble capa de grafeno y produciendo límite de detección de 1 pM para ADN de cadena simple. El campo magnético periódico permite supresión de ruido basada en integración de señal, mejorando aún más la sensibilidad. Más allá de detección de ADN, esta plataforma ofrece un marco versátil para medir propiedades mecánicas de ácidos nucleicos y detectar otras biomoléculas o células.