Las nanopartículas de oro modulan el metabolismo de la testosterona en microsomas hepáticos humanos: efectos del tamaño, la química de superficie y la corona proteica

Resumen

Los complejos de nanopartículas de oro (AuNP) con corona proteica pueden alterar el metabolismo de la testosterona (TST) mediado por citocromo P450 (CYP) al cambiar sus propiedades fisicoquímicas. Se examinó cómo el tamaño de las NP, la química de superficie y la corona proteica de plasma humano (PC) influyen en el metabolismo de la TST en microsomas hepáticos humanos agrupados (pHLM). Se estudiaron AuNP de 20-40 nm y 80 nm funcionalizadas con polietilenimina ramificada (BPEI), ácido lipoico (LA) o polietilenglicol (PEG), tanto desnudas como con PC. En pHLM, las AuNP desnudas de 40 nm inhibieron la formación de cinco metabolitos hidroxilados de TST, mientras que las partículas de 80 nm tuvieron un efecto más débil. La PC mitigó en gran medida estas inhibiciones. Sorprendentemente, las AuNP desnudas aumentaron la producción de androstenediona. En microsomas hepáticos de un solo donante, se observó variabilidad interindividual; la mayoría de las AuNP suprimieron el metabolismo de TST a concentraciones no inhibitorias, mientras que las PC-PEG-AuNP estimularon la producción de androstenediona. Estos hallazgos destacan a las AuNP como posibles disruptores endocrinos al modular el metabolismo de la TST y proporcionan un marco para evaluar otros nanomateriales.

Introducción

Las AuNP se utilizan ampliamente en administración de fármacos, diagnósticos y productos de consumo debido a sus propiedades ópticas y físicas únicas. Al exponerse a fluidos biológicos, las AuNP adsorben proteínas rápidamente, formando una corona que modifica la química de superficie, la conformación proteica y las respuestas biológicas posteriores, incluyendo citotoxicidad, captación celular y actividad de enzimas CYP. Estudios in vitro han demostrado que las AuNP pueden ser tóxicas para hepatocitos humanos, la línea hepatoma C3A y células espermáticas, pero la presencia de PC puede atenuar o potenciar estos efectos según la química de superficie. La formación de PC también interfiere con la captación celular en varios tipos celulares independientemente del tamaño o carga de las NP.

Las enzimas CYP en el hígado metabolizan compuestos endógenos y exógenos. Varios agentes —incluyendo fármacos, pesticidas y nanopartículas— pueden alterar la síntesis y el metabolismo de hormonas esteroideas, conduciendo a funciones fisiológicas alteradas. La testosterona (TST) es un andrógeno primario y sustrato de CYP3A4, que la hidroxila a 6β-OH-TST. Hidroxilaciones adicionales por CYP3A4 producen 2β-OH-TST, 15β-OH-TST, 16α-OH-TST y 16β-OH-TST, mientras que CYP2D6 desalquila la TST a androstenediona (AD). Trabajos previos indican que las AuNP desnudas y recubiertas con PC modulan un amplio espectro de enzimas CYP, incluyendo CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6, 2E1 y 3A4. Las AgNP también suprimen la actividad de CYP3A4 en HLM. Las AuNP funcionalizadas con BPEI y LA disminuyen la actividad de CYP3A4 en células C3A, pero la PC atenúa este efecto. In vivo, las AuNP pequeñas se acumulan en hígado y bazo y alteran la expresión hepática de Cyp1a1 y Cyp2b. Dados estos hallazgos, el presente estudio investiga cómo la PC influye en el tamaño, carga y química de superficie de las AuNP sobre el metabolismo de TST mediado por CYP en pHLM y HLM de un solo donante.

Métodos

Reactivos

Testosterona, sus metabolitos y TST marcado con ¹³C₃ se obtuvieron de MilliporeSigma. Reactivos adicionales de Steraloids o MilliporeSigma. Disolventes grado LC-MS de Fisher Scientific; agua ultrapura de sistema Merck Synergy® UV-R.

Microsomas hepáticos humanos

HLM agrupados (pHLM) de 200 donantes (100 hombres, 100 mujeres) y HLM de un solo donante de Corning Inc. Las actividades CYP específicas de donante se detallan en la Tabla Suplementaria S1.

Síntesis de nanopartículas de oro

AuNP Biopure™ de 40 y 80 nm funcionalizadas con BPEI, LA o PEG se compraron de nanoComposix. La síntesis del núcleo implicó reducir HAuCl₄·3H₂O en K₂CO₃, seguido de envejecimiento y filtración tangencial (TFF). Funcionalización superficial: LA (0.2:1 p/p) o PEG (0.5:1 p/p) se añadieron, seguidos de TFF y filtración estéril. Superficies BPEI se prepararon mediante química EDC/NHS enlazando carboxilo de LA a aminas de BPEI; BPEI no unido se eliminó por TFF y centrifugación.

Preparación de corona proteica

Plasma humano agrupado (n=5) se incubó con AuNP de 40 u 80 nm al 55% de volumen de plasma en agitador a 37 °C (250 rpm, 1 h). PC-AuNP se recogieron por centrifugación (20 000×g, 20 °C, 20 min), se lavaron tres veces con PBS y se resuspendieron en PBS para caracterización.

Caracterización fisicoquímica

DLS y TEM midieron tamaño, polidispersidad y potencial zeta. Mediciones en agua DI, PBS y buffer de incubación microsomal (pH 7.4) a 0 min y 45 min (37 °C). Rejillas TEM examinadas en Tecnai G2 Spirit BioTWIN (120 kV). Espectros UV-Vis registrados con lector Spectra Max i3.

Metabolismo de testosterona in vitro

Se confirmó metabolismo lineal de TST (10 µM) durante 1.3–9.3 mg mL⁻¹ de proteína microsomal hasta 60 min. pHLM se incubaron con TST y concentraciones variables de AuNP desnudas o con PC (0–571 µg mL⁻¹). Reacciones iniciadas con o sin NADPH (0.25 mM NADP, 2.5 mM glucosa-6-fosfato, 2 U mL⁻¹ deshidrogenasa) y detenidas tras 45 min a 37 °C con ácido fosfórico al 4%. Surnadantes centrifugados, almacenados a –20 °C y procesados para LC-MS/MS. HLM de un solo donante tratados similarmente a 10 µg mL⁻¹ AuNP.

Estándares y preparación de muestras

Estándares primarios (1 mM) e ISTD (¹³C₃-TST) en metanol. Estándares de trabajo de 0.01 a 200 µM. Muestras QC a 0.01, 0.05 y 0.1 µM. Muestras adicionadas con ISTD, extraídas en placas Oasis PRIME HLB, lavadas, eluidas, diluidas y analizadas por LC-MS/MS.

Cromatografía líquida-espectrometría de masas

Separación con columna Waters UPLC HSS T3 (2.1 × 50 mm, 1.8 µm) a 600 µL min⁻¹. Gradiente: 30% B a 98% B en 8.4 min. Fuente ESI⁺ a 4000 V, 150 °C; desolvatación a 450 °C. Transiciones MRM en Tabla Suplementaria S2. Curvas de calibración 0.001–20 µM. LOD y LOQ 0.001 µM y 0.005 µM respectivamente.

Análisis estadístico

Prueba t de Student para diferencias en D_H y PDI. IC₅₀ y EC₅₀ calculados mediante ecuación de Hill en GraphPad Prism®. ANOVA unidireccional seguido de HSD de Tukey (p < 0.05) evaluó efectos de AuNP. Correlación de Pearson r entre actividad CYP y producción de metabolitos.

Resultados y Discusión

Propiedades fisicoquímicas de las AuNP

TEM confirmó monodispersidad de todas las AuNP desnudas y con PC excepto PC-BPEI-AuNP de 40 y 80 nm, que mostraron agregación en PBS. Valores D_H aumentaron para AuNP desnudas BPEI y LA de 40 nm y PC-PEG-AuNP a 45 min, mientras que PC-LA-AuNP de 80 nm disminuyeron. PDI aumentó para AuNP desnudas y PC-PEG-AuNP de 40 nm, y potencial zeta disminuyó con el tiempo para AuNP BPEI desnudas. Estos cambios reflejan hallazgos previos donde la PC altera tamaño, absorbancia y morfología de NP.

Metabolismo de TST en HLM agrupados

Se detectaron seis metabolitos de TST (cinco hidroxilados y AD) en pHLM. AuNP desnudas de 40 y 80 nm inhibieron la producción de 2β-OH-TST, 6β-OH-TST y 15β-OH-TST de manera dosis-dependiente (IC₅₀: 416–1113 µg mL⁻¹). No inhibieron 16α- ni 16β-OH-TST, excepto BPEI-AuNP de 40 nm que suprimió ligeramente 16β-OH-TST a la dosis más alta. Curiosamente, las AuNP desnudas aumentaron la producción de AD a altas concentraciones (4.3 pmol mg⁻¹ min⁻¹ para BPEI-AuNP de 40 nm). Las AuNP recubiertas con PC eliminaron en gran medida estas inhibiciones; la PC también mitigó el efecto estimulador sobre AD para LA-AuNP de 80 nm. En general, las AuNP desnudas redujeron la hidroxilación mientras a veces aumentaban la desalquilación, efecto atenuado por la PC.

Variabilidad en HLM de un solo donante

La actividad CYP específica de donante correlacionó fuertemente con la formación de metabolitos: 6β-OH-TST correlacionó con CYP2C19 (r = 0.99, p = 0.01) y CYP3A4 (r = 0.99, p = 0.03); AD correlacionó inversamente con CYP4A11 (r = –0.98, p = 0.04). Las AuNP a concentraciones no inhibitorias modulaban la producción de metabolitos de manera diferente entre donantes, reflejando polimorfismos y fenotipos CYP. Tamaño, recubrimiento superficial y formación de PC afectaron significativamente los niveles de metabolitos (p < 0.0001). Por ejemplo, PC-PEG-AuNP activaron la producción de AD en el donante HDC3 independientemente del tamaño.

Conclusiones

Las AuNP, particularmente las partículas desnudas de 40 y 80 nm, inhiben la hidroxilación de TST y pueden estimular la desalquilación en HLM agrupados. La presencia de una PC biológicamente relevante mitiga estos efectos, especialmente para AuNP catiónicas BPEI. En HLM de un solo donante, los efectos de las AuNP dependen de la química de superficie y varían con la actividad CYP individual, subrayando el potencial de las AuNP como disruptores endocrinos. Estos resultados proporcionan un marco para evaluar el impacto de otros nanomateriales en el metabolismo de hormonas esteroideas e identificar subpoblaciones vulnerables.

Disponibilidad de Datos y Materiales

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo y su información suplementaria.

Abreviaturas

11β-OH TST

11β-hidroxitestosterona

15β-OH TST

15β-hidroxitestosterona

16α-OH TST

16α-hidroxitestosterona

16β-OH TST

16β-hidroxitestosterona

2α-OH TST

2α-hidroxitestosterona

2β-OH TST

2β-hidroxitestosterona

6α-OH TST

6α-hidroxitestosterona

6β-OH TST

6β-hidroxitestosterona

AD

Androstenediona

AgNP

Nanopartículas de plata

ANOVA

Análisis de varianza unidireccional

AuNP

Nanopartículas de oro

BPEI

Polietilenimina ramificada

CFS

Clorpirifós

CYP

Citocromo P450

DEET

Dietiltoluamida

D_H

Diámetro hidrodinámico

DI

Agua desionizada

DLS

Dispersión dinámica de luz

EC₅₀

Concentración de activación semimáxima

EDC/NHS

1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida/N-hidroxisuccinimida

ESI⁺

Electrospray positivo

HLM

Microsomas hepáticos humanos

HSD

Diferencia honesta significativa de Tukey

IC₅₀

Concentración inhibitoria semimáxima

ISTD

Estándar interno

LA

Ácido lipoico

LC-MS/MS

Cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem

LOD

Límite de detección

LOQ

Límite de cuantificación

MRM

Monitoreo de reacciones múltiples

NADP

Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido

NADPH

NADP reducido

naked

Sin PC

NP

Nanopartícula

PBS

Salino fosfato tamponado

PC

Corona proteica de plasma humano

PDI

Índice de polidispersidad

PEG

Polietilenglicol

pHLM

Microsomas hepáticos humanos agrupados

QC

Control de calidad

SWCNT

Nanotubo de carbono de pared simple

TEM

Microscopía electrónica de transmisión

TFF

Filtración tangencial

TiO₂

Dióxido de titanio

TST

Testosterona

UPLC TQD

Sistema de cromatografía líquida de ultra rendimiento con detector de cuadrupolo triple