Nanogeles PNIPAM sensibles a temperatura y pH para liberación controlada de β-lapachona por doble estímulo

Resumen

Nanogeles de poli-N-isopropilacrilamida (PNIPAM) se copolimerizaron con ácido acrílico (AAc) para ajustar la temperatura crítica de solución inferior (LCST). Los nanogeles PNIPAM-co-AAc resultantes exhiben dos transiciones de fase de volumen distintas, con el LCST aumentando conforme incrementa el contenido de AAc. Cuando se cargan con β-lapachona (β-LP), la liberación del fármaco se rige tanto por temperatura como por pH, y está fuertemente influenciada por la proporción de AAc. Notablemente, la formulación PNIPAM-co-AAc20 retiene <10 % de liberación a pH ácido-neutro y temperatura corporal, mientras libera >70 % a pH básico. Estos hallazgos demuestran que los nanogeles PNIPAM sensibles a temperatura y pH son portadores prometedores para administración intestinal específica de fármacos vía oral.

Introducción

Los nanoportadores sensibles a estímulos se emplean cada vez más en administración de fármacos, imagen y diagnóstico. Entre los disparadores usados —pH, temperatura, redox, campo magnético, luz— la temperatura y el pH siguen siendo los más explotados para liberación controlada. PNIPAM, un polímero termorresponsivo, colapsa por encima de su LCST (~32 °C) debido a interacciones hidrofóbicas, mientras que grupos carboxilo desprotonados en AAc introducen repulsión electrostática adicional que desplaza el LCST hacia arriba. La copolimerización de PNIPAM con AAc ofrece así una plataforma ajustable que responde a tanto temperatura como pH. La β-lapachona, un agente anticancerígeno natural, tiene ventana terapéutica limitada por su metabolismo rápido y toxicidad fuera de blanco; la encapsulación en nanogeles responsivos puede mitigar estos inconvenientes. En este estudio, reportamos la síntesis de nanogeles PNIPAM-co-AAc con contenido variable de AAc, su comportamiento de liberación de fármaco por doble estímulo y su eficacia citotóxica en células fibroblásticas.

Métodos

Materiales

NIPAM (97 %, Sigma-Aldrich), N,N'-metilenbisacrilamida (MBA), AAc, agua destilada, EtOH, persulfato de potasio (KPS, 98 %, Dae Jung), β-LP (Productos Naturales) y PBS, grado analítico, usados tal cual.

Síntesis de Nanogeles PNIPAM-co-AAc

En matraz de 500 mL, 2,26 g NIPAM, 0,154 g MBA y 0–0,145 g AAc se disolvieron en 200 mL agua a 75 °C. Tras purga con nitrógeno, se añadieron 37,5 mg KPS y la mezcla se reflujó 10 min, produciendo solución turbio. El polímero se dializó (12–14 kDa) 7 días, congeló en nitrógeno líquido y liofilizó 3 días para obtener nanogeles secos (PNIPAM, PNIPAM-co-AAc5, PNIPAM-co-AAc10, PNIPAM-co-AAc20).

Carga de β-LP

1 mg nanogel seco se disolvió en 1 mL EtOH y se añadieron 0,1 mg β-LP. La mezcla se agitó overnight en oscuridad, luego dializó (6–8 kDa), congeló y liofilizó. Los nanogeles cargados con β-LP se almacenaron a 4 °C.

Caracterización

La morfología se examinó por TEM (200 kV) y FE-SEM (15 kV). Espectros FT-IR se registraron en espectrómetro Nicolet 6700. Carga y liberación de fármaco se cuantificaron por espectroscopía UV-Vis (200–800 nm). LCST se determinó por dispersión dinámica de luz (DLS) en incrementos de 1 °C de 30 a 50 °C.

Estudios de Liberación de Fármaco

10 mL nanogeles cargados con β-LP se colocaron en tubos de diálisis (3,5 kDa) e incubaron a 24 °C y 37 °C en PBS a pH 2, 4, 7,4 y 8,0. En puntos temporales especificados (0–12 h), se retiraron alícuotas de 2 mL y analizaron por UV-Vis. La liberación acumulada se calculó relativa al total β-LP cargado.

Ensayos de Viabilidad Celular

Fibroblastos NIH3T3 (2×10⁴ células/pozo) se trataron con β-LP libre, PNIPAM-co-AAc5-β-LP o PNIPAM-co-AAc20-β-LP a 0–20 µg/mL. Tras 3 h, se realizaron ensayo MTT (595 nm) y tinción LIVE/DEAD® para evaluar citotoxicidad.

Resultados y Discusión

Preparación y Morfología

Imágenes TEM y SEM (Fig. 1) revelaron nanogeles monodispersos con diámetros medios ~250 nm para PNIPAM-co-AAc5. Los potenciales zeta disminuyeron de −13,6 mV (PNIPAM) a −23,6 mV (PNIPAM-co-AAc20), reflejando mayor grupos carboxilo superficiales.

Comportamiento Termorresponsivo

Medidas DLS (Fig. 2) mostraron dos transiciones hinchamiento-colapso distintas. La primera comenzó ~30 °C y la segunda apareció cerca 40 °C, desplazándose a 45 °C para PNIPAM-co-AAc20. Así, LCST aumenta con contenido AAc, consistente con reportes previos.

Liberación de Fármaco por Doble Estímulo

A 37 °C, PNIPAM-co-AAc20 liberó solo ~61 % β-LP en 6 h, mientras PNIPAM y PNIPAM-co-AAc5 liberaron ~80 %. A pH 8,0, la liberación desde PNIPAM-co-AAc20 aumentó ~10 % comparado con pH neutro o ácido (Fig. 3). Estos resultados confirman que la liberación se potencia sinérgicamente por pH básico y temperatura elevada.

Citotoxicidad In Vitro

β-LP libre redujo viabilidad celular más que formulaciones en nanogel. PNIPAM-co-AAc20 mostró mayor viabilidad a 20 µg/mL, correlacionando con su menor liberación a 37 °C. Tinción live/dead (Fig. 4) mostró citotoxicidad pronunciada para PNIPAM-co-AAc5-β-LP a 3 h, mientras PNIPAM-co-AAc20-β-LP permaneció mayormente no tóxica hasta 6 h a pH 8,0, donde se observó muerte celular sinérgica.

Conclusiones

Hemos diseñado nanogeles PNIPAM-co-AAc cuyo LCST puede ajustarse por contenido AAc. La formulación alto-AAc (20 %) exhibe liberación mínima β-LP a temperatura fisiológica pero libera eficientemente el fármaco a pH básico, imitando el ambiente del intestino delgado. Estos nanogeles de doble estímulo representan una plataforma convincente para administración oral dirigida al intestino de β-lapachona.