Detección rápida in situ de rongalita en alimentos usando ensayo de tira lateral tipo sándwich basado en aptámeros

Resumen

Presentamos un ensayo rápido y fácil de usar de tira lateral (LFSA) que emplea dos aptámeros altamente específicos —A09 y B09— funcionalizados con nanopartículas de oro (AuNP) para detectar rongalita, un reactivo peligroso usado ocasionalmente como aditivo alimentario. El aptámero A09 biotinilado se inmoviliza en membrana de nitrocelulosa recubierta de estreptavidina como sonda de captura, mientras el aptámero B09 conjugado a AuNP sirve como sonda de señalización. El ensayo produce una línea roja clara en zona de prueba para concentraciones de rongalita tan bajas como 1 µg mL⁻¹, observable a simple vista en 15 minutos, ideal para cribado in situ de productos agrícolas y alimentarios.

Antecedentes

Rongalita (sulfinato de hidroximetilo sódico) se emplea ampliamente en teñido industrial y química de polímeros como agente reductor. Sin embargo, su adición inadvertida o intencional a alimentos ha causado serias preocupaciones de salud, incluyendo liberación de formaldehído y efectos adversos reportados en China. Métodos de detección confiables y rápidos son esenciales para salvaguardar seguridad alimentaria y salud pública.

Los aptámeros —moléculas de ADN o ARN monocatenario— ofrecen ventajas distintas sobre anticuerpos: síntesis química con alta consistencia entre lotes, baja inmunogenicidad y fácil modificación para diversas plataformas de detección. Aunque existen ensayos aptaméricos electroquímicos y enzimáticos para rongalita, a menudo requieren instrumentación compleja y tiempos de análisis prolongados. En contraste, ensayos de tira lateral (LFSA) proporcionan solución de un solo paso, portátil y bajo costo adecuada para pruebas punto de atención.

Hasta la fecha, solo un puñado de ensayos cromatográficos basados en aptámeros han dirigido rongalita. Dado creciente escrutinio regulatorio y prevalencia de aditivos ilícitos, desarrollamos LFSA formato sándwich que aprovecha especificidad de dos aptámeros y claridad óptica de AuNP, permitiendo detección rápida in situ de rongalita en diversas matrices alimentarias.

Métodos

Materiales y reactivos

Rongalita provino de Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. Cloruro de oro(III) trihidrato (HAuCl₄) y citrato trisódico se compraron de Sigma-Aldrich (EE. UU.). Reactivos de soporte (NaCl, BSA, sacarosa, PEG₂₀₀₀₀, Tween-20) de Beijing Biotopped Science and Technology Co., Ltd. Membranas de nitrocelulosa (NC) (Pall 90, Pall 170, Millipore 135) suministradas por Pall Corporation y Millipore Corporation via Jiening Biotech Company. Muestras alimentarias —torta de arroz (ersi), fideos, tofu y tofu glucono-δ-lactona— se recolectaron de mercados locales.

Preparación de aptámeros vía SELEX

Se siguió protocolo de evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX) para aislar aptámeros con alta afinidad por rongalita. Biblioteca inicial ssDNA 82-mer (5'-GACATATTCAGTCTGACAGCG-N₄₀-GATGGACGAATATCGTCTAGC-3') se incubó con rongalita, secuencias no unidas se lavaron, y aptámeros unidos se amplificaron por PCR. Tras 12 ciclos de enriquecimiento —incluyendo contra-selección contra compuestos estructuralmente relacionados— secuenciación clonal produjo dos aptámeros de alta afinidad: A09 y B09. Sus secuencias se listan abajo y fueron sintetizadas por Tsingke Biological Technology.

• Aptámero primario A09 (biotinilado): 5'-Biotina-GACATATTCAGTCTGACAGCGGAAGCGGGTCAGTCCAACTCACGGTCTCGCATGCACGGGAGATGGACGAATATCGTCTAGC
• Aptámero secundario B09 (biotinilado): 5'-Biotina-GCTAGACGATATTCGTCCATCTCCCGTGCATGCGAGACCGTGAGTTGGACTGACCCGCTTCCGCTGTCAGACTGAATATGTC-HS-3'

Producción de AuNP

Nanopartículas de oro (~40 nm diámetro) se sintetizaron por reducción de citrato de HAuCl₄ siguiendo protocolo estándar. Tamaño y monodispersidad confirmados por espectroscopía UV/Vis (λ_max ≈ 530 nm) y microscopía electrónica de transmisión (TEM). Aptámero secundario B09 se conjugó a AuNP incubando 1 mL solución AuNP con 4 µL de 100 µM B09, seguido de precipitación inducida por sal, centrifugación y resuspensión en 1 mL PBS (pH 7,4) conteniendo 5 % BSA, 5 % sacarosa, 1 % PEG₂₀₀₀₀ y 0,05 % Tween-20.

Diseño de tira lateral

El ensamblaje LFSA (Fig. 3) involucró almohadilla de muestra, almohadilla conjugado oro, membrana NC (Pall 90) y almohadilla absorbente en tarjeta soporte. Almohadilla muestra pre-tratada con PBS + 3 % BSA + 0,05 % Tween-20 y secada 2 h a 37 °C. Almohadilla conjugado oro recibió B09-AuNP. Línea de prueba en membrana NC se creó depositando 1 µL biotina-A09 (10 µM) mezclado con 10 µL estreptavidina (1 mg mL⁻¹) 1 h a 4 °C, mientras línea control consistió en estreptavidina sola. Tras secado, tira se cortó en secciones 40 mm y almacenó overnight a 37 °C.

Prueba de especificidad

Tiras se desafiaron con 80 µL de 10 µg mL⁻¹ rongalita, formalina o agua desionizada. Aparición de línea roja de prueba distinta confirmó especificidad, mientras línea control permaneció visible bajo todas condiciones.

Prueba dosis-dependiente

Concentraciones rongalita (0, 0,8, 1, 5, 10 µg mL⁻¹) preparadas en PBS y 80 µL aplicado a almohadilla muestra. Línea roja visible en 15 min definió límite detección, observado a 1 µg mL⁻¹.

Prueba muestras alimentarias

Cinco muestras alimentarias sospechosas de contener rongalita se extrajeron (1 g + 10 mL agua). Tras filtración, 80 µL cada extracto se probaron en LFSA. Resultados validados cruzadamente por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC).

Resultados y discusión

Afinidad y especificidad de aptámeros

Regresión no lineal de curvas saturación (Fig. 4a) produjo constantes disociación 61,1 ± 16,4 nM para A09 y 39,8 ± 12,7 nM para B09, confirmando unión fuerte y específica a rongalita (Fig. 4b).

Rendimiento del ensayo

LFSA formato sándwich produce línea roja de prueba cuando AuNP-B09 une rongalita y es capturado por A09 inmovilizado. Línea control, formada por estreptavidina uniendo exceso AuNP-B09, confirma integridad ensayo (Fig. 5). Prueba especificidad contra formalina y agua desionizada no produjo falsos positivos, y límite detección establecido en 1 µg mL⁻¹ —muy por debajo niveles reportados en muestras alimentarias contaminadas.

Análisis muestras alimentarias confirmó presencia rongalita en varios productos, corroborado por HPLC (Tabla 1). Robustez ensayo atribuida a tampón optimizado (PBS pH 7,4 + 5 % BSA + 5 % sacarosa + 1 % PEG₂₀₀₀₀ + 0,05 % Tween-20) y selección membrana NC Pall 90, que proporcionó flujo óptimo y unión no específica mínima.

Comparado con métodos cromatográficos (GC, HPLC), LFSA ofrece sensibilidad comparable eliminando necesidad instrumentación sofisticada y tiempos procesamiento extendidos. Su bajo costo, operación paso único y lectura visual lo hacen ideal para inspecciones seguridad alimentaria in situ y cumplimiento regulatorio.

Conclusiones

Hemos desarrollado LFSA formato sándwich confiable y rentable que detecta rongalita en matrices alimentarias con límite 1 µg mL⁻¹. El ensayo aprovecha especificidad de aptámeros duales y claridad óptica AuNP, permitiendo cribado inmediato in situ. Esta plataforma puede desempeñar papel fundamental mitigando contaminación alimentaria por rongalita y salvaguardando salud pública.

Abreviaturas

AuNP:

Nanopartículas de oro

HPLC:

Cromatografía líquida de alto rendimiento

LFIA:

Inmunoensayo de flujo lateral

LFSA:

Ensayo de tira lateral

Membrana NC:

Membrana de nitrocelulosa

POCT:

Pruebas punto de atención

SELEX:

Evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial

TEM:

Microscopía electrónica de transmisión