Detección rápida de rongalita mediante un ensayo de tira de flujo lateral tipo sándwich con un par de aptámeros

Resumen

Se diseñó un ensayo de tira de flujo lateral en sándwich (LFSA) utilizando un par de aptámeros funcionalizados con nanopartículas de oro (AuNP) para evaluar la presencia de rongalita en productos agroalimentarios. Más específicamente, un aptámero A09 primario marcado con biotina inmovilizado en una membrana recubierta de estreptavidina y un aptámero B09 secundario conjugado con AuNP se desarrollaron como sondas de captura y señalización, respectivamente. Este sistema permite la detección directa y exitosa de rongalita en muestras de alimentos con concentraciones tan bajas como 1 μg / mL, simplemente observando el cambio de color del control LFSA y la línea de prueba.

Antecedentes

La rongalita (hidroximetilsulfinato de sodio) es un reactivo industrial que se usa típicamente para teñir en tina [1] o para polimerización en emulsión [2] como agente reductor. La rongalita también se puede encontrar en acondicionadores de agua (p. Ej., Reducción de cloro y cloramina) [3], en removedores de color de cabello cosméticos comerciales a pesar de la generación de formaldehído (un carcinógeno humano conocido), o incluso en formulaciones farmacéuticas como antioxidante [4] . Este compuesto también provocó efectos adversos en China tras su incorporación en varios productos agroalimentarios [5]. Este ensayo desarrollado proporciona una plataforma confiable de detección de rongalita en el sitio y puede contribuir a resolver problemas de seguridad alimentaria.

Los aptámeros, oligonucleótidos monocatenarios y oligopéptidos se han considerado como alternativas perfectas a los anticuerpos debido a su alta especificidad, producción fácil y reproducible, fácil modificación y menor respuesta inmunogénica [6]. Estudios recientes han revelado el gran potencial de los aptámeros como sondas biológicas para el direccionamiento de fármacos, la biodetección y el desarrollo de nuevos fármacos [7]. Se han desarrollado ensayos electroquímicos [8] y de aptámeros ligados a enzimas [9] con un par de aptámeros como una herramienta prometedora para la detección de rongalita. Sin embargo, estos métodos suelen sufrir largos tiempos de análisis y procedimientos complejos, lo que dificulta sus aplicaciones [10].

El ensayo de tira de flujo lateral (LFSA, también llamado ensayo de tira) se desarrolló por primera vez en 1956 como una extensión lógica de la tecnología de prueba de aglutinación del látex [11]. Como enfoque de un solo paso, LFSA ha atraído una atención significativa para la detección en el sitio de múltiples analitos debido a su formato fácil de usar, bajo costo de producción, uso que ahorra tiempo y estabilidad a largo plazo en una amplia gama de condiciones [ 12]. A pesar de estas características positivas, las aplicaciones prácticas de la plataforma de tiras de flujo lateral basada en aptámeros no se han comercializado todavía, y solo se han informado unos pocos ensayos de tiras cromatográficas basadas en aptámeros para la detección de rongalita en muestras de alimentos [13]. . En vista de la alta incidencia de asuntos de seguridad alimentaria y el uso común de rongalita como aditivo alimentario ilegal, es necesario desarrollar un LFSA basado en aptámeros para la detección rápida e in situ de este compuesto en muestras de alimentos.

Se pueden desarrollar dos tipos de sensores de aptámeros de banda de flujo lateral, a saber, el competitivo y el tipo sándwich [14]. La plataforma tipo sándwich es muy adecuada cuando hay un par de aptámeros disponibles para una molécula diana específica. En el presente trabajo, se emplearon nanopartículas de oro específicas (AuNP), que se sabe que son los nanomateriales más prometedores para el desarrollo de sensores de aptámeros (por ejemplo, propiedades físico-químicas), para el desarrollo de una sonda de detección de aptámeros de tira sándwich de flujo lateral. Mientras tanto, los procesos de conjugación de aptámeros se han demostrado previamente en AuNP mediante quimisorción o adsorción física, lo que proporciona una plataforma simple pero sensible para el sensor de aptámeros que luego se utilizó como sonda de señalización en este estudio [15]. Debido a las ventajas derivadas del uso de AuNP y aptámeros, se desarrolló un ensayo de flujo lateral visible, rápido, de un solo paso e in situ para el análisis de rongalita en muestras de alimentos. Para lograr este sensor aptámero tipo sándwich, se utilizaron dos sondas aptámeros (A09 / B09) que sirven como sondas de captura y señalización. Los resultados positivos de este biosensor se confirmaron aún más mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

Métodos

Materiales y reactivos

La rongalita fue proporcionada por Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. HAuCl ₄ (citrato trisódico deshidratado) se adquirió de Sigma Aldrich (EE.UU.). NaCl, BSA, sacarosa, formalina, PEG20000 y Tween20 eran de Beijing Biotopped Science and Technology Co., Ltd.

Las membranas NC (es decir, pall 90, pall 170 y Millipore 135) son de Pall Corporation y Millipore Corporation, por separado, y se compran de Jiening Biotech Company.

Se compraron muestras de alimentos, ersi (hebras cuadradas y delgadas de pastel de arroz en China), fideos, tofu y glucono-δ-lactona-tofu, en los mercados cercanos.

Preparación de aptámeros mediante la evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX)

El proceso SELEX comprende los siguientes pasos (Fig.1):(i) incubación de la diana con una biblioteca de ADN aleatoria, (ii) aislamiento del ADN unido a la diana, (iii) amplificación del ADN por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , (iv) preparación de ADN monocatenarios para la biblioteca de la siguiente ronda, (v) repetición de los pasos i-iv durante 5 a 15 ciclos que implican el cribado con contador de intervalos con sustancias no objetivo para eliminar los ADNss inespecíficos, y (vi) clonación y secuenciación final de la biblioteca enriquecida [16].

Proceso típico de selección de aptámeros (SELEX)

Los aptámeros se cribaron siguiendo los pasos descritos anteriormente. Brevemente, se sintetizó una biblioteca de aptámeros de ssDNA inicial que consta de 82-mer nucleótidos con una secuencia central aleatoria larga basada en 40 de cada aptámero (Tsingke Biological Technology). La secuencia aleatorizada del conjunto de aptámeros de ssDNA es 5′-GACATATTCAGTCTGACAGCG-N40-GATGGACGAATATCGTCTAGC-3 ′, donde N significa un nucleótido aleatorizado de A, G, C o T.

En esta investigación, el cebador 1 (5′-GACATATTCAGTCTGACAGC-3 ′) y el cebador 2 (5′-GCTAGACGATATTCGTCCATC-3 ′) se utilizaron para la amplificación de la biblioteca.

Para seleccionar aptámeros que se unen específicamente a rongalita, la biblioteca de ssDNA aleatoria sintetizada se añadió a la placa con rongalita. A continuación, el ssDNA no unido se eliminó mediante lavado; el ssDNA unido se recuperó y amplificó mediante PCR. La afinidad de unión de los aptámeros aumentó gradualmente a medida que aumentaba la ronda de selección.

La especificidad y K _d El valor de los aptámeros individuales se determinó de manera similar a los métodos de Tang [17].

Las secuencias de aptámeros utilizadas en este trabajo fueron las siguientes:

Aptámero primario A09,

5′-Biotina-GACATATTCAGTCTGACAGCGGAAGCGGGTCAGTCCAACTCACGGTCTCGCATGCACGGGAGATGGACGAATATCGTCTAGC
Aptámero secundario B09,

5′-Biotina-GCTAGACGATATTCGTCCATCTCCCGTGCATGCGAGACCGTGAGTTGGACTGACCCGCTTCCGCTGTCAGACTGAATATGTC-HS-3 ′

Estas secuencias de aptámeros (A09 y B09) se sintetizaron y adquirieron de Tsingke Biological Technology.

Producción de AuNP

Las AuNP se sintetizaron mediante la reducción de citrato de HAuCl ₄ protocolo [18]. La producción monodispersa de AuNP con el tamaño adecuado se confirmó mediante espectrofotometría UV / Vis (Thermo Scientific ™ Evolution 60S). Se sintetizaron AuNP de forma esférica (aproximadamente 40 nm de diámetro) y de color rojo intenso. El tamaño de estos AuNP sin modificar se estimó mediante el uso de la ley de Beer-Lambert a 530 ± 2 nm y microscopía electrónica de transmisión (Fig. 2) (JEOL Ltd. JEM-1011).

El aptámero secundario B09 conjugado con AuNP se preparó siguiendo los protocolos descritos [18]. Brevemente, se incubó 1 mL de las AuNP preparadas con 4 μL de la solución de aptámero B09 secundario (100 μM) y la mezcla se almacenó en un cajón a temperatura ambiente durante al menos 16 h. Posteriormente, se añadió gota a gota un molar de NaCl al vial con una suave agitación manual hasta alcanzar una concentración final de 0,1 M en la mezcla. Los viales se almacenaron en un cajón durante al menos 1 día antes de su uso. Los aptámeros tiolados no conjugados se eliminaron mediante centrifugación a 12.000 g durante 20 min a 4ºC. Los tubos se retiraron de la centrífuga y se obtuvo un líquido sobrenadante transparente, estando las nanopartículas en el fondo de los tubos. La mezcla se centrifugó durante 5 min más en caso de sobrenadante de color rojo. Se pipeteó suavemente el sobrenadante y las nanopartículas se dispersaron finalmente en 1 ml de tampón PBS (solución salina tamponada con fosfato) 0,01 M (pH =7,4) que contenía BSA al 5%, sacarosa al 5%, PEG20000 al 1% y Tween20 al 0,05%.

Diseño de banda de flujo lateral

El LFSA se diseñó como se muestra en la Fig. 3. Brevemente, la tira contenía varias almohadillas superpuestas en una muestra de tarjeta de respaldo (GF-08, 20 × 300 mm), conjugado de oro, membrana de nitrocelulosa (NC) (Pall 90, 60 × 300 mm) mm) y almohadillas de absorción (H-5076, 20 × 300 mm). La longitud del solapamiento fue de 2 mm. La almohadilla de muestra se sumergió en un tampón PBS 0,01 M (pH =7,4) que contenía BSA al 3% y Tween20 al 0,05% y posteriormente se secó a 37ºC durante 2 h. La almohadilla de conjugado de oro se trató con un tampón PBS 0,01 M (pH =7,4) que contenía BSA al 5%, sacarosa al 5%, PEG20000 al 1% y Tween20 al 0,05%. Los AuNP funcionales se rociaron posteriormente con un rociador (XYZ3010-1429) sobre la almohadilla de conjugado de oro tratado. Se incubó un microlitro de aptámero de biotina-A09 (10 μM) con 10 μL de estreptavidina (1 mg / mL) durante 1 ha 4 ° C. La estreptavidina conjugada con aptámero se recubrió posteriormente con un dispensador (XYZ3010-1429) en una membrana NC para formar la línea de prueba, mientras que la estreptavidina (1 mg / ml) se recubrió con el instrumento para formar la línea de control. Después de eso, la membrana NC tratada se secó a 37 ° C durante 2 h para su inmovilización. Finalmente, se ensamblaron las tiras y la LFSA se cortó en tiras de 40 mm de ancho y se almacenó a 37 ° C durante la noche hasta su uso.

Imágenes TEM de AuNP (40 nm)

Configuración típica de tira de prueba de flujo lateral (formato sándwich)

Prueba de especificidad

Se agregaron ochenta microlitros de una solución de rongalita (10 μg / mL) a la almohadilla de muestra de las tiras ensambladas. Este paso se repitió para los otros objetivos contrarios, incluida la formalina y el agua desionizada para las pruebas de especificidad. Se utilizó agua desionizada como control. Debería aparecer una línea roja en el área esperada con líneas. Cada control se repitió dos veces.

Prueba dependiente de la dosis

De manera similar a la prueba específica, se prepararon soluciones de rongalita con concentraciones variables (0.8, 1, 5 y 10 μg / mL). Se añadieron ochenta microlitros de la solución de rongalita a la almohadilla de muestra de las tiras ensambladas. La observación de color rojo dentro de los 15 minutos en la línea de prueba se consideró como el criterio para determinar el límite de detección.

Prueba de muestra de alimentos

Para evaluar la viabilidad y precisión de esta nueva LFSA, se recolectaron cinco muestras de alimentos que posiblemente contenían rongalita agregada de un mercado alrededor del instituto. Se extrajo un gramo de muestra con 10 mL de agua. Luego, se aplicaron 80 μL de cada solución de extracto de muestra a la tira de flujo lateral basada en aptámeros para la detección de rongalita. Estos resultados fueron confirmados por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

Resultados y discusión

Las constantes de especificidad y disociación ( K _d ) de los aptámeros seleccionados

Se incubaron diferentes concentraciones de aptámeros A09 y B09 con una cantidad fija de rongalita. Las curvas de saturación que representan la absorbancia medida a 450 nm frente a la correspondiente concentración de aptámero de entrada se muestran en la Fig. 4a. Se utilizó un análisis de regresión no lineal para K _d cálculo de valor. El K _d El valor de A09 es 61,12 ± 16,36 nM y B09 es 39,81 ± 12,73 nM. Como se muestra en la Fig. 4b, la afinidad de unión entre A09 / B09 y rongalita es alta.

un Medición de K _d valor de A09 y B09. GraphPad Prism se utilizó para realizar un análisis de ajuste de curado no lineal para K _d cálculo. b La afinidad de unión específica entre A09 / B09 y rongalite

Especificidad y sensibilidad

El aptámero A09 marcado con biotina (que captura el aptámero) se unió a la estreptavidina revestida inicialmente en la membrana. Esta línea fue seleccionada como línea de prueba. Mientras tanto, la estreptavidina se alineó en la zona de control.

Como se muestra en la Fig. 5a, una vez que el aptámero secundario de AuNP (como sonda de señalización) se une a rongalita, el aptámero primario alineado en la zona de prueba se une a otro sitio de este compuesto. Debe aparecer una línea roja generada por AuNP en la zona de prueba en caso de análisis positivo. Con respecto al experimento de control, la estreptavidina en la zona de control captura el aptámero B09 marcado con AuNP restante modificado con biotina, proporcionando así una señal de control en todo momento.

Especificidad ( a ) y sensibilidad ( b ) de LFSA para rongalita. un Se agregaron 80 μL de una solución de rongalita (10 μg / mL) a la almohadilla de muestra de las tiras ensambladas. Este paso se repitió para los otros objetivos contrarios, incluida la formalina para las pruebas de especificidad. Se utilizó agua desionizada como control. b Se prepararon soluciones estándar de rongalita con concentraciones variables (0, 0,8, 1, 5 y 10 μg / ml). Se pipetearon 80 μL de las soluciones estándar en la almohadilla de muestra, y la observación del color rojo en 15 minutos en la línea de prueba se consideró como el criterio para determinar el límite de detección

Como se muestra en la Fig. 5b, el resultado muestra que la rongalita se detectó fácilmente a simple vista en concentraciones tan bajas como 1 μg / ml.

Estas muestras de alimentos se analizaron mediante la LFSA desarrollada en este documento y los resultados se muestran en la Tabla 1.

Curiosamente, la línea de control no se mantuvo después de cada LFSA. Las altas concentraciones de iones de sal o rongalita pueden producir una señal débil en la zona de control. Por lo tanto, la composición del tampón resuspendiente afecta críticamente el rendimiento de la tira de prueba. Según los resultados obtenidos, se eligió un tampón PBS 0,01 M (pH =7,4) que contenía 5% de BSA, 5% de sacarosa, 1% de PEG20000 y 0,05% de Tween20 como tampón de resuspensión.

La composición de las distintas almohadillas tiene un efecto dramático en el rendimiento del ensayo de tira. Entre las diversas alternativas, la membrana NC resultó ser el soporte sólido más adecuado para la adsorción e hibridación de ácidos nucleicos. NC se ha utilizado ampliamente como panel de señales en la banda de flujo lateral, ya que proporciona tasas de flujo suficientes [19]. Para estos ensayos pueden ser adecuados tipos de membranas NC de diferentes tamaños con caudales respectivos. En este trabajo, se probaron tres membranas NC de uso común (es decir, pall 90, pall 170 y Millipore 135) compradas a Jiening Biotech Company. Pall 90 se eligió aquí como la membrana NC más adecuada para LFSA.

Se han desarrollado numerosas tecnologías para la detección de rongalita. Sin embargo, pocos se han aplicado ampliamente en la detección in situ, principalmente debido a los altos costos asociados y los protocolos complejos, como GC y HPLC, que son engorrosos para el operador diario. LFSA, un enfoque de un solo paso, se ha convertido en una plataforma perfecta debido a su formato fácil de usar, bajo costo de producción y conveniencia. A pesar de la peor sensibilidad que las tiras cromatográficas, LFSA sería un método prometedor en el campo de las pruebas en el punto de atención.

LFSA tiene todavía una sensibilidad más baja que las tiras cromatográficas. Además, las tecnologías LFSA que utilizan aptámeros muestran algunas ventajas inherentes sobre el inmunoensayo de flujo lateral (LFIA, método basado en anticuerpos) y esto independientemente de los avances recientes en este campo. Aunque también se pueden diseñar ensayos similares utilizando anticuerpos, los sensores de aptámeros ofrecen estabilidad y ventajas económicas. Además, los aptámeros son más flexibles para desarrollar diferentes formatos ya que están compuestos por ácidos nucleicos que tienen hibridación intra e intermolecular, replicación enzimática y características de fácil determinación de secuencia. En virtud de estas propiedades positivas, se han desarrollado numerosos sensores de aptámeros para ensayos multiplexados.

Además, LFSA puede utilizar diferentes etiquetas, incluidos los puntos cuánticos desarrollados recientemente [20] y los fósforos de conversión ascendente [21]. Sin embargo, entre todas las etiquetas informadas, las AuNP son las más utilizadas para LFSA. La propiedad más notable de la etiqueta Au radica en su capacidad para colorear la membrana NC permitiendo la observación directa a simple vista. Esta característica diferencia a LFSA de los costosos métodos de laboratorio actuales, lo que hace que esta tecnología sea una herramienta analítica conveniente.

Las pruebas en el lugar de atención (POCT) se han propuesto como una herramienta ideal para reducir los costos de estas pruebas. La plataforma de biosensores LFSA, el ensayo más conocido, se utiliza actualmente para POCT [22]. La plataforma de biosensores LFIA incluye principalmente formatos sándwich y competitivos (o de inhibición). En general, los ensayos en formato sándwich se diseñan en el caso de moléculas diana que tienen al menos dos epítopos. En este documento se desarrolló un aptámero doble unido a rongalita en dos sitios de unión diferentes que contiene sondas de captura y señalización ensambladas en el formato de tipo sándwich.

Conclusiones

Se desarrolló con éxito un LFSA fácil y de bajo costo con formato sándwich para la detección rápida in situ de rongalita. El ensayo involucró un par de aptámeros conjugados con AuNP. Después de optimizar algunos parámetros clave, el ensayo desarrollado proporcionó una alta sensibilidad con valores límite de detección tan bajos como 1 μg / mL. Esta tecnología podría usarse fácilmente para estudiar la contaminación de muestras de alimentos con rongalita. Este ensayo proporciona una plataforma confiable de detección de rongalita en el sitio y puede contribuir a resolver problemas de seguridad alimentaria.