Mejora de la selectividad del transductor amperométrico utilizando películas de fenilendiamina nanométricas

Resultados y discusión

Para confirmar las razones de la deposición de membrana adicional en el transductor amperométrico para mejorar su selectividad al peróxido de hidrógeno, fue necesario verificar la sensibilidad y selectividad de este transductor con respecto a posibles interferencias.

Los biosensores se pueden utilizar para mediciones tanto en muestras diluidas como sin diluir. La opción de dilución depende de la concentración de sustancia a analizar y de la sensibilidad del biosensor:si el biosensor puede identificar la sustancia objetivo en concentraciones, que son decenas de veces más bajas que las reales en las muestras, esta última debe diluirse para disminuir la contenido de interferencias y así mejorar la precisión de la matriz. Además, permite reducir decenas de veces el volumen de sustrato necesario para las mediciones.

A veces, la concentración de la sustancia analizada es demasiado baja o la dilución no es deseable por razones técnicas. Para una mejor comprensión de la función del transductor amperométrico, se utilizaron materiales electroactivos de tres concentraciones:(1) relevante para el suero sanguíneo, (2) 20 veces menor que (1), es decir, dilución de 20 veces, y (3) 100- dilución doble. Las respuestas del biosensor a las sustancias electroactivas de tres concentraciones se recibieron usando el transductor desnudo antes de la deposición de la película de PPD, y se calculó la sensibilidad del transductor (Tabla 2). Como se vio, la sensibilidad a la dopamina y al ácido ascórbico fue la más alta, a la cisteína, la más baja. Sin embargo, los ácidos ascórbico y úrico pueden considerarse como los principales interferentes debido a sus concentraciones esencialmente más altas en las muestras biológicas. Las respuestas del transductor a estas sustancias son un orden de magnitud mayor que la respuesta a la sustancia objetivo, el peróxido de hidrógeno. Por lo tanto, el transductor desnudo no es adecuado para mediciones en muestras biológicas debido al impacto pronunciado de las interferencias. Por otro lado, después de una dilución de 100 veces, las respuestas a la cisteína y la dopamina se volvieron insignificantes, y la respuesta a todos los interferentes en total fue solo alrededor del 20% de la respuesta al peróxido de hidrógeno, lo que significa que en algunos casos, el sensor puede ser utilizado incluso sin modificaciones adicionales.

Actualmente, solo hay información fragmentada con respecto a los métodos de deposición de membrana de PPD en transductores. Por lo tanto, en la siguiente etapa del trabajo, se evaluó cuál de los dos métodos más comunes y prometedores es más factible.

En el primer método, las membranas de PPD se depositaron sobre la superficie del electrodo de disco de platino mediante electropolimerización de moléculas de monómero fenilendiamina utilizando potencial variable (voltamperometría cíclica). Los transductores con electrodos de referencia y auxiliares se colocaron en una celda de trabajo con solución de fenilendiamina y se obtuvieron varios voltamogramas cíclicos [7]. En la Fig. 1 se muestra un ejemplo del experimento. Durante el primer voltamograma cíclico (CVA), se observó un aumento significativo en la corriente en el rango de potencial de 0,5 a 0,9 V debido a la oxidación de fenilendiamina. Durante el segundo CVA y subsiguientes, la corriente disminuyó significativamente, lo que indica una menor velocidad de electropolimerización. Sin embargo, como mostraron los siguientes experimentos, la formación de la membrana de PPD se prolongó durante todo el CV.

Voltamogramas cíclicos obtenidos en la electropolimerización de fenilendiamina en la superficie del transductor

El segundo método de deposición de membrana de PPD consiste en la oxidación de fenilendiamina a un potencial constante de + 0,7 V durante un tiempo fijo (40 min) [11]. La comparación de las respuestas de los transductores cuando se utilizan ambos métodos de deposición se muestra en la Tabla 3. A continuación, las respuestas a las sustancias electroactivas sin la membrana de PPD se tomaron como 100%. Las membranas, depositadas por ambos métodos, impidieron los interferentes con bastante eficacia; solo se observó una sensibilidad débil a la cisteína. Por otro lado, la sensibilidad del transductor al peróxido de hidrógeno después de la voltamperometría aumentó 2,6 veces. Esto puede explicarse por la electroactivación del platino durante la voltamperometría, pero no por el efecto de la membrana de PPD. Este aumento de la sensibilidad al peróxido de hidrógeno se observó también después de obtener voltamogramos cíclicos en tampón fosfato sin fenilendiamina. Después de la deposición de la membrana a un potencial constante, no se reveló ninguna electroactivación y las respuestas al peróxido de hidrógeno no cambiaron. Por lo tanto, se reveló que el uso de voltamperometría cíclica era preferible por tres razones:menos tiempo para una deposición (20 frente a 40 min), inhibición más eficiente de la cisteína y aumento de las respuestas al peróxido de hidrógeno.

Sin embargo, la voltamperometría cíclica tiene una desventaja:los voltamogramas pueden obtenerse simultáneamente en un solo electrodo (incluso usando un multiplexor), mientras que la deposición de la membrana a un potencial constante permite la conexión simultánea de 8 a 16 electrodos de trabajo (según el tipo de multiplexor). Por lo tanto, el trabajo adicional debe centrarse en la optimización de las condiciones de los voltamogramas cíclicos para disminuir el tiempo de pretratamiento del transductor.

Se supone que la electropolimerización de la DP por CV y ​​la amperometría de potencial constante se producen por diferentes vías a través de un mecanismo bastante complicado [12]. Por tanto, CV implica un alto potencial aplicado, lo que conduce a la generación de oligómeros de PD menos conjugados. Por esta razón, se supone que en la polimerización PD por CV, los poros son más grandes y la permeabilidad de la capa de PPD es mayor si se compara con la polimerización a potencial constante [8, 13]. Sin embargo, como se señaló en la sección “Antecedentes”, diferentes autores llegaron a conclusiones contradictorias sobre el método preferencial de depósito de DP y, en muchos casos, CV dio buenos resultados. En nuestra opinión, tanto el CV como la amperometría de potencial constante pueden proporcionar la generación de membranas de PPD con buenas propiedades permselectivas, y la optimización es necesaria para cada caso particular.

La membrana de PPD era claramente visible en la superficie del electrodo como una película de color marrón dorado transparente uniforme. Para confirmar que es PPD de hecho, la polimerización de PD se confirmó adicionalmente mediante espectroscopía. El espectro de reflectancia difusa UV-vis de la película (Fig. 2) muestra bandas de absorbancia intensas a 222 y 315 nm, similares a las bandas del monómero y relacionadas con las transiciones de electrones en los anillos aromáticos [14], mientras que la absorbancia sin rasgos distintivos a 400-800 nm, disminuyendo constantemente con la longitud de onda relacionada con π - π * Transiciones de electrones en un sistema aromático altamente conjugado de polímero PPD conductor.

Espectros de reflectancia difusa UV-vis de m -membrana de fenilendiamina y PPD, formada en el electrodo de Pt

Para una mejor interpretación de los resultados obtenidos, sería útil estimar el tamaño de los poros en las membranas de PPD producidas por diferentes métodos. Sin embargo, la determinación directa del tamaño de los poros en la membrana de PPD es casi imposible, ya que la membrana consta de múltiples capas de PD y los poros en las capas inferiores pueden tener diferentes tamaños. Killoran y O'Neill determinaron que el grosor de la membrana eficaz de m -PD era de 15 nm, y el área de la sección transversal de una hebra de polímero oligomérico estimada por del Valle et al. fue de 1 nm [7, 15]. Por tanto, la membrana de PPD contiene aproximadamente 15 capas de polímero. Dado que la membrana de PPD tiene propiedades hidrófobas y aislantes, la membrana debe tener nanoporos perforantes que se estiren hasta la superficie del electrodo y permitan el desvío de las moléculas de peróxido de hidrógeno; de lo contrario, H ₂ O ₂ no se puede oxidar y generar una señal amperométrica. Los poros definitivamente no son uniformes y el diámetro mínimo de los poros debe ser inferior a 1 nm para rechazar las moléculas electroactivas, por lo que es bastante difícil analizar los poros incluso con microscopios de fuerza atómica o electrónica. Por estas razones técnicas, es mucho más fácil estimar la efectividad de la membrana de PPD evaluando la permeabilidad de la membrana para diferentes moléculas. Este enfoque indirecto está muy extendido y permite comparar las características prácticas de diferentes membranas.

Se probó la eficacia de las membranas de PPD depositadas utilizando varios voltamogramas cíclicos (Fig. 3).

Eficiencia de las membranas de PPD depositadas utilizando diferentes números de CVA

La membrana de PPD depositada por un CVA fue obviamente insuficiente para eliminar la influencia de los interferentes. Sin embargo, aquí, el efecto de la electroactivación del platino fue el más fuerte. A mayor aumento del número de voltamogramas, las respuestas a los interferentes disminuyeron, pero al mismo tiempo, la sensibilidad del transductor al peróxido de hidrógeno también disminuyó, probablemente debido a una capa de PPD demasiado gruesa, que impide la difusión de la sustancia. Tres CVA fueron suficientes para la desaparición completa de las respuestas a la dopamina y al ácido úrico, y una disminución significativa de las respuestas al ácido ascórbico y la cisteína. Por lo tanto, se tomaron tres CVA para el óptimo y se aumentó la concentración de fenilendiamina hasta la eliminación completa del impacto interferente (Fig. 4).

Eficiencia de las membranas de PPD depositadas a diferentes concentraciones de fenilendiamina

En particular, el uso de fenilendiamina 5 mM fue suficiente para eliminar las respuestas a los interferentes de pequeñas concentraciones que quedan después de la dilución de la muestra, pero deficiente para trabajar con muestras sin diluir. Un aumento de la concentración de fenilendiamina a 20 mM y tres CVA resultó ser suficiente para la eliminación completa del impacto de la cisteína y una disminución de las respuestas al ácido ascórbico al nivel más bajo (0.1% de la respuesta al ácido ascórbico sin membrana de PPD). El uso de una concentración de fenilendiamina más alta (hasta 100 mM) dio como resultado una disminución doble de la sensibilidad del transductor al peróxido de hidrógeno, probablemente debido a una capa de PPD demasiado gruesa. Por tanto, la deposición de la membrana de PPD utilizando tres CVA en fenilendiamina 30 mM es un procedimiento óptimo. Como un voltamograma duró aproximadamente 2 minutos, la deposición de la membrana en un sensor tomó 6 minutos.

A continuación, se estudió la estabilidad de la membrana de PPD. Después de la deposición de las membranas de PPD, los sensores se colocaron en el tampón de trabajo durante 2 h, y se midieron las respuestas al peróxido de hidrógeno, ácido ascórbico y cisteína para evaluar los cambios en la permselectividad de la membrana (Fig. 5). Se encontró que las respuestas al peróxido de hidrógeno aumentaron ligeramente durante el trabajo, mientras que las pequeñas respuestas a los interferentes se hicieron aún más pequeñas. Probablemente, sucedió porque el ácido ascórbico y la cisteína obstruyeron gradualmente algunos poros grandes en la capa de PPD. Este experimento demostró que la membrana de PPD se puede utilizar sin una pérdida significativa en su selectividad al peróxido de hidrógeno durante al menos 2 h.

Estabilidad de la membrana de PPD durante 2 horas. Las respuestas a tres sustancias se normalizaron a la respuesta inicial a la sustancia correspondiente después de la deposición de PPD

Se investigó la estabilidad de almacenamiento de la membrana de PPD. Los sensores con membranas de PPD depositadas se almacenaron secos durante 8 días a -18 ° C; periódicamente, los sensores se descongelaron y se midieron las respuestas al peróxido de hidrógeno, ácido ascórbico y cisteína (Fig. 6). Durante este período, la sensibilidad de los sensores al peróxido de hidrógeno aumentó 2,5 veces; la sensibilidad al ácido ascórbico y la cisteína no cambió. Este efecto se puede explicar por el lento hinchamiento de la membrana de PPD que condujo a una mejora de la difusión del peróxido de hidrógeno a través de la capa de PPD.

Estabilidad de almacenamiento de la membrana PPD. Las respuestas se normalizaron a la respuesta a H ₂ O ₂ el primer día

Finalmente, se validó la eficacia de la membrana de PPD en el análisis de muestras biológicas reales. Los transductores sin membranas mostraron señales débiles después de la adición de suero sanguíneo a la celda de trabajo debido a la presencia de compuestos electroactivos. Sin embargo, después de la deposición de la membrana, no se obtuvieron respuestas. Se obtuvieron resultados similares con el lisado de neuronas. Estos experimentos demuestran que el método desarrollado de deposición de PPD en electrodos de disco de platino es eficaz y los transductores modificados se pueden utilizar para trabajar con muestras biológicas complejas.

Es útil comparar el método para la deposición de PPD desarrollado en este trabajo con los métodos informados anteriormente (Tabla 4).

Como se ve, el método presentado es el más rápido y las propiedades de bloqueo de la membrana obtenida son mejores o al menos no peores que las de otras membranas de PPD.

Conclusiones

Investigamos las condiciones de deposición de una membrana semipermeable a base de polifenilendiamina destinada a disminuir el impacto de las sustancias que interfieren en el funcionamiento del biosensor. Se demostró que la electropolimerización de fenilendiamina mediante voltamperometría cíclica era más fácil y proporcionaba mejores propiedades de la membrana en comparación con la electropolimerización a potencial constante. Se investigó la dependencia de la eficacia de la membrana de PPD en el número de voltamogramas cíclicos y la concentración de fenilendiamina. Se demostró que el impacto de las sustancias que interfieren en el funcionamiento del sensor se puede eliminar por completo utilizando tres voltamogramas cíclicos en fenilendiamina 30 mM. Por otro lado, cuando se trabaja con muestras diluidas, es decir, concentraciones más bajas de sustancias electroactivas, es razonable disminuir la concentración de fenilendiamina a 5 mM, lo que daría como resultado una mayor sensibilidad del transductor al peróxido de hidrógeno debido a una capa de PPD más delgada. La membrana de PPD se puede utilizar sin pérdida significativa de su selectividad al peróxido de hidrógeno durante al menos 2 h de funcionamiento continuo y se puede almacenar al menos 8 días. Se demostró que el transductor con membrana de PPD no es sensible a las sustancias electroactivas presentes en las muestras biológicas y puede utilizarse para la creación de biosensores.

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