Uso de nanopartículas cargadas de omniscan como agente de contraste de resonancia magnética dirigida al tumor en el carcinoma oral de células escamosas mediante la estrategia de estímulos de gelatinasa

Materiales y métodos

Materiales

Se adquirió metoxi-polietilenglicol-NHS (mPEG-NHS, Mn 5000) de Beijing Jiankai Technology Co (Beijing, China). El péptido escindible con gelatinasa (secuencia:H2N-PVGLIG-COOH) fue sintetizado por Shanghai HD Biosciences Co (Shanghai, China). Omniscan (inyección de gadodiamida) se adquirió de GE Healthcare (Irlanda). Las colagenasas IV se adquirieron en Sigma (EE. UU.).

Síntesis de NP de estímulos y gelatinasas con carga omnidireccional

El copolímero escindible con gelatinasas mPEG-Pep-PCL y mPEG-PCL sin péptido se sintetizaron mediante copolimerización de apertura de anillo como en nuestro trabajo anterior [17]. Los Omn-NP se formularon mediante la técnica de evaporación de disolvente de doble emulsión. Brevemente, se disolvieron 10 mg de copolímero mPEG-Pep-PCL en 1 ml de diclorometano (DCM). Luego, se agregaron 0,1 ml, 0,2 ml y 0,3 ml de Omn, respectivamente. Esta mezcla se emulsionó en 3 ml de una solución acuosa de alcohol polivinílico (PVA) al 3% (p / v) mediante sonicación (XL2000, Misonix, Farmingdale, NY, EE. UU.) Durante 60 s para obtener una emulsión de aceite / agua (o / w). . A continuación, esta emulsión se emulsionó en 5 ml de solución acuosa que contenía 0,5% (p / v) mediante sonicación con PVA durante 60 s. La emulsión w / o / w formada se agitó suavemente a temperatura ambiente en una campana extractora hasta que se evaporó el disolvente orgánico. La solución resultante se filtró para eliminar los fármacos no incorporados. Los blancos-NP se prepararon de la misma manera descrita, sin añadir Omn. Las NP de mPEG-PCL cargadas con Omn (Con-Omn-NP) se sintetizaron con 10 mg de copolímero de mPEG-PCL y 0,2 ml de Omn siguieron los mismos pasos.

Medición del tamaño de partículas y examen de morfología de NP

Los tamaños de partícula y la estabilidad de los Omn-NP y los blancos-NP se midieron mediante dispersión dinámica de luz (DLS) (Brookhaven Instruments Corporation, EE. UU.). Los Omn-NP y los blancos-NP se mantuvieron a temperatura ambiente. Los tamaños de partículas se determinaron mediante DLS cada 2 días para evaluar la estabilidad de las Omn-NP (totalmente durante 6 días). Los valores fueron el promedio de mediciones por triplicado para una sola muestra. El examen morfológico de los NP Omn y los NP en blanco se realizó utilizando un microscopio electrónico de transmisión (TEM) (JEM-100S, JEOL, Japón). Se colocó una gota de suspensión de NP debidamente diluida sobre una rejilla de cobre cubierta con una membrana de nitrocelulosa y se secó al aire a temperatura ambiente. La muestra se tiñó negativamente con solución fosfotúngstica de sodio al 1% (p / v) antes de la observación.

El contenido de carga del fármaco y la eficacia de encapsulación

El contenido de carga de fármaco y la eficacia de encapsulación de Omn-NP se analizaron calculando la concentración de ion gadolinio. Se dividió un mililitro de Omn-NPs con ácido nítrico concentrado y luego la mezcla se diluyó con ácido nítrico diluido. La muestra se analizó mediante espectrometría de emisión atómica de plasma de acoplamiento inductivo (ICP-AES, Optima 5300DV, PerkinElmer, EE. UU.).

Cambios macroscópicos y cambios morfológicos microscópicos de NP en respuesta a colagenasa

Las NP de mPEG-PCL cargadas con omn (Con-Omn-NP) y las NP de mPEG-Pep-PCL (NP de Omn) se incubaron con solución de Hank que contenía colagenasa IV (0,34 mg / ml) a 37 ° C durante 24 h. Los cambios en la transparencia de la solución se observaron a simple vista.

La evaluación de la morfología microscópica de Con-Omn-NP y Omn-NP (incubados con o sin colagenasa) se llevó a cabo utilizando un TEM. Para TEM, se colocó una gota de suspensión de NP en una rejilla de cobre cubierta con una membrana de nitrocelulosa y se secó al aire antes de la observación.

En V itro C ellular U ptake

Las líneas de carcinoma oral de células escamosas humanas (HSC3) fueron amablemente proporcionadas por el Noveno Hospital de Shanghai. Las células tumorales se sembraron en una placa de 24 pocillos a una densidad de 5 × 10 ⁵ células por pocillo y se cultivaron durante 24 h. A continuación, se añadieron NP de mPEG-Pep-PCL cargados con cumarina-6 (12,5 μg / ml calculados por cumarina-6) al medio de cultivo y se incubaron durante 0,5 y 1 ha 37 ° C. El medio de cultivo se aspiró y se lavó tres veces con PBS. Las células se inmovilizaron durante 20 min con etanol absoluto (1 ml por pocillo) y luego se lavaron tres veces con PBS. Las células se observaron mediante citoquímica inmunofluorescente y microscopio de barrido láser confocal (LSM710, Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Berlín, Alemania). La longitud de onda de excitación y emisión fue de 460 nm para la cumarina-6.

Animales

Todos los experimentos con animales se realizaron en total conformidad con las pautas de la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio publicada por los Institutos nacionales de salud de EE. UU. (Publicación de los NIH No 85-23, revisada en 1985) y fue aprobada por la Junta de Revisión de Ética para Estudios con animales del Hospital Estomatológico de Nanjing, Facultad de Medicina de la Universidad de Nanjing. Se adquirieron ratones BALB / c (5-6 semanas, 18-22 g) del Centro de Investigación de Animales Modelo de la Universidad de Nanjing. La salud animal, incluido el peso corporal y las condiciones de la piel, se controló dos veces por semana. Durante el experimento no se observó ulceración, una reducción en la movilidad animal y pérdida de peso.

Establecimiento del modelo OSCC

Las células tumorales se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal (FBS) al 10%, penicilina 100 U / ml y estreptomicina 100 mg / ml a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contenía CO2 al 5%. 2 y 95% de aire. Para establecer un modelo de xenoinjerto de OSCC humano, las células de OSCC humano HSC3 (1 × 10 ⁶ células en 50 µl de solución salina tamponada con fosfato (PBS)) se inocularon por vía subcutánea en la axila derecha de ratones desnudos (3 ratones por grupo). Medimos la dimensión del tumor cada dos días con un calibre. Cuando el diámetro del tumor era de aproximadamente 0,4 a 0,5 cm, los ratones estaban listos para los experimentos de imágenes por resonancia magnética in vivo.

Estudio de resonancia magnética in vivo con Omn-NP y Omn como agente de contraste

Para el estudio in vivo, dividimos a los ratones en dos grupos (A y B). A los ratones del grupo A se les inyectaron Omn-NP a través de la vena de la cola, mientras que a los ratones del grupo B se les inyectó la misma concentración de Omn que a los NP cargados. Ambos grupos fueron escaneados usando el escáner de resonancia magnética Bruker Biospin 7.0 T (Bruker BioSpin, Ettlingen, Alemania). Los parámetros se establecieron de la siguiente manera:campo de visión (FOV), 3,5 × 2,5 cm; grosor de la rodaja, 0,8 mm; TR, 745,2 ms; TE, 7,5 ms. Los cortes axiales de ratón se adquirieron utilizando una secuencia de eco de espín ponderada en T1. Las imágenes se obtuvieron antes y en diferentes momentos después de la administración intravenosa de dos agentes de contraste.

Expresión de MMP2 / 9 en tumores y tejidos normales

Después del examen de resonancia magnética in vivo, los tejidos tumorales, corazón, hígado, bazo, pulmón, riñón y tejidos musculares del modelo de ratones OSCC se seleccionaron para tinción inmunohistoquímica (IHC) para MMP2 y MMP9. Todos los tejidos se disecaron y fijaron en formalina tamponada neutra al 10%, se procesaron de forma rutinaria en parafina y se seccionaron con un grosor de 5 µm. El examen IHC para la expresión semicuantitativa (-, + y ++) de MMP2 / 9 se realizó mediante microscopía óptica.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó utilizando t de Student prueba. Los datos se enumeraron como media ± DE y un valor de p <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados y discusión

Caracterización de nanopartículas mPEG-Pep-PCL

El ¹ H NMR (CDCl ₃ ) los espectros de los copolímeros mPEG-Pep-PCL confirmaron que el péptido se conjugó satisfactoriamente con mPEG y los conjugados mPEG-Pep se conjugaron satisfactoriamente con PCL (Fig. 1a). La relación molar de bloque hidrófilo a bloque hidrófobo (mPEG / PCL) en el copolímero mPEG-Pep-PCL fue de aproximadamente 0,95 basada en la relación integral de -CH2-O- (4,04 ppm) en el segmento de PCL a -CH2-CH2-O ( 3,65 ppm) en el segmento mPEG de ¹ Medición de H NMR.

un ¹ Espectros de resonancia magnética nuclear H (300 MHz, 25 μC) de PEG-Pep-PCL en CDCl3. b El diámetro y el índice de polidispersidad de los NP en blanco y los NP cargados con Omn (0,1 ml, 0,2 ml, 0,3 ml). c La estabilidad de las NP cargadas con Omn (0,1 ml, 0,2 ml, 0,3 ml). d Micrografías TEM de NP en blanco y NP cargadas con Omn. Las barras de error representan las desviaciones estándar de tres medidas independientes

Tamaños de partículas y estabilidad de NP

Los tamaños de partícula y el índice de polidispersidad (PDI) se determinaron mediante DLS (Fig. 1b). No se encontraron diferencias significativas en el tamaño de las partículas entre los tres Omn-NP ( p > 0.05), mientras que se encontraron diferencias significativas entre los Omn-NP y los blancos-NP ( p <0,05). Para el PDI, no se encontraron diferencias significativas entre estos Omn-NPs ( p > 0.05), pero hubo diferencias significativas entre los Omn-NP y los blancos-NP ( p <0.05).

Para la estabilidad de Omn-NP, no se observaron precipitaciones y cambios obvios en los tamaños en los tres Omn-NP (Fig. 1c), lo que indicó que los Omn-NP eran estables.

Estudios morfológicos de NP

Las micrografías TEM de los NP en blanco y los NP Omn se presentan en la Fig. 1d. La forma achatada también se pudo observar tanto en los NP en blanco como en los NP de Omn, y los NP de Omn eran mucho más pequeños que los NP en blanco debido a sus diferentes tamaños. Además, se pudo distinguir claramente el Omn en los NP, que apareció como partículas oscuras en los NP. Esta partícula de Omn podría observarse dispersa dentro de los NP.

Contenido de carga de fármacos y eficacia de encapsulación

El contenido de carga de fármaco y la eficiencia de encapsulación de los tres Omn-NP se muestran en la Tabla 1. El resultado mostró que 0,3 ml de Omn tenían la carga de fármaco más alta, pero la eficiencia de encapsulación era bastante baja, y 0,1 ml de Omn tenía la mayor eficiencia de encapsulación y relativamente cerca carga de fármaco con 0,2 mL y 0,3 mL Omn. Teniendo en cuenta tanto la carga del fármaco como la eficacia de encapsulación, se utilizaron 0,1 ml de Omn-NP en el estudio final de resonancia magnética in vivo. La baja eficiencia de encapsulación también indicó que en el sistema de reacción, el Omn que agregamos fue suficiente para NP.

Cambios morfológicos macroscópicos y microscópicos de Omn-NP y Con-Omn-NP en respuesta a colagenasa IV

Para verificar la escisión de NP en respuesta a gelatinasa (colagenasa IV), se evaluaron los cambios morfológicos macroscópicos y microscópicos de Omn-NP y Con-Omn-NP después de la incubación con solución de Hank que contiene 2 mg / ml de colagenasa IV. A1 y B1 mostraron las soluciones transparentes de Con-Omn-NP antes y después de la incubación con colagenasa IV, y A2 y B2 mostraron que no se encontraron cambios en la morfología microscópica de Con-Omn-NP usando TEM antes y después de la incubación. C1 y D1 mostraron las soluciones de Omn-NP antes y después de la incubación con colagenasa IV. D1 mostró que el líquido se volvió turbio a medida que se producía precipitación en las soluciones de Omn-NP después de 24 h. D2 mostró las imágenes TEM de Omn-NP en respuesta a colagenasas IV, las estructuras de las NP se rompieron (Fig. 2). Este resultado indicó que nuestros NP eran estímulos de gelatinasa:la escisión del péptido rompería los NP y se liberarían los fármacos cargados. Y la característica de escindir el péptido para liberar los fármacos cargados también se demostró mediante la liberación de fármacos y en nuestra investigación anterior [12, 18].

a1 , a2 , b1 , b2 , c1 , c2 , d1 , d2 Cambio morfológico macroscópico y microscópico de NP de mPEG-PCL cargadas con Omn (NP Con-Omn-NP) y NP de mPEG-Pep-PCL cargadas con Omn (NP-Omn) después de la incubación con colagenasa IV

Estudios de captación celular in vitro

La captación celular de las NP cargadas con cumarina-6 se muestra en la Fig. 3. La fluorescencia verde de la cumarina-6 se mostró en el citoplasma de las células HSC3, lo que sugiere que la cumarina-6 entró en el citosol junto con las NP. Como la cumarina-6 estaba atrapada originalmente en las NP, lo que indicaba que nuestras NP podían penetrar eficazmente las barreras de la membrana celular y distribuirse en el citoplasma celular mediante endocitosis.

a, b Estudios de captación celular de HSC3 in vitro de nanopartículas. Imágenes de microscopía confocal de células HSC3 después de la incubación con NP cargadas con cumarina-6

Imágenes de RM en vivo con Omn-NP y Omn como agentes de contraste

Las imágenes se adquirieron antes de que Omn-NP y Omn se administraran por vía intravenosa a una dosis de 0,025 mmol / kg (Gd ³⁺ ) de 2 grupos. Luego se obtuvieron imágenes posteriores al contraste a los 5 min, 15 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 150 min y 180 min después de la inyección (Fig. 4a). ) se calculó y utilizó como indicador cuantificable para la evaluación utilizando Omn-Nps en comparación con Omn. Los resultados mostraron que el TBR máximo para Omn-NP fue de 2,23 ± 0,10 y 1,48 ± 0,01 para Omn, el tiempo de pico fue de 30 minutos para Omn-NP y 5 minutos para Omn, y el tiempo de duración de mejora de la señal fue de 180 minutos para Omn- NP y 30 min para Omn (Fig. 4b). Hubo una diferencia significativa para la TBR máxima y el tiempo de retención entre los dos grupos ( p <0,05). Aunque nuestros Omn-NP tenían una carga de fármaco relativamente baja, se demostró una resonancia magnética in vivo mejorada superior en comparación con Omn solo. Esto también demostró que nuestros Omn-NP eran estímulos de gelatinasa y específicos de tumores.

un , b Imágenes de resonancia magnética axial y gráfico de líneas de la relación de tumor a fondo del modelo de xenoinjerto de COCE humano en las posiciones tumorales indicadas adquiridas con una secuencia ponderada en T1. Las barras de error representan las desviaciones estándar de tres medidas independientes

A pesar de que las técnicas de imagenología avanzadas recientemente, como la tomografía computarizada por emisión de fotón único [19], la tomografía por emisión de positrones (PET) [20] y la imagen óptica [21] se utilizaron en el diagnóstico de COCE, la resonancia magnética sigue siendo la más utilizada y fiable. herramientas para la estadificación de tumores de cabeza y cuello de acuerdo con el sistema de estadificación del cáncer TNM [1] y los quelatos de gadolinio siguen siendo los agentes de contraste de resonancia magnética más utilizados [22].

Para lograr el objetivo de apuntar al tumor específicamente para el agente de contraste de resonancia magnética, se han utilizado estrategias de direccionamiento activo y pasivo [2, 23, 24]. La focalización activa [12] se ha convertido en un área de gran interés en el diagnóstico del cáncer. Los ligandos dirigidos, como aptámero [25], péptido [8], anticuerpo [6] y folato [26], se conjugan con complejos de Gd multiméricos macromoleculares y supramoleculares para unirse a receptores particulares sobreexpresados ​​por células tumorales o vasculaturas. Sin embargo, las propiedades de biocompatibilidad y biodegradabilidad de estos macromoleculares y supramoleculares no son claras y su no biodegradabilidad dificulta la aplicación clínica. Sin embargo, nuestros Omn-NP consisten en PEG, PCL, péptido de escisión de gelatinasa y Omn. El PEG y el PCL tienen excelentes propiedades de biocompatibilidad y biodegradabilidad, y Omn es un agente de contraste de resonancia magnética clínicamente ampliamente utilizado; por lo tanto, se espera que nuestros Omn-NP tengan una excelente bioseguridad.

La modificación del polímero con mPEG hidrófilo podría prolongar la circulación sanguínea y aumentar la acumulación de NP en los tumores. La PEGilación podría reducir la adherencia a las proteínas séricas y crear una superficie sigilosa para prolongar el tiempo de circulación evitando la captación por los sistemas reticuloendoteliales [12, 17]. La concentración de los fármacos encapsulados aumentó específicamente en los sitios del tumor y en este estudio se observó un tiempo de duración de mejora prolongado significativo. Por lo tanto, el momento de pico de TBR fue mucho más tarde y el período de latencia de imágenes fue mucho más largo en el grupo Omn-NP que en el grupo Omn.

Además, la especificidad mejorada y el tiempo de duración prolongado del realce minimizarán la dosis inyectada de iones de gadolinio y, por lo tanto, reducirán el riesgo de fibrosis sistémica nefrogénica, una preocupación en el diseño de agentes de contraste basados ​​en gadolinio [27, 28].

Tinción IHC para MMP2 y MMP9

Los resultados de la tinción IHC para MMP2 y MMP9 de tejidos normales de órganos y tejidos tumorales se muestran en la Fig. 5. Los resultados mostraron que los niveles de expresión de MMP2 y MMP9 en tejidos tumorales eran (++), mientras que en la mayoría de los tejidos normales fueron ( - ). En los tejidos tumorales, el plasma celular y la matriz extracelular se tiñeron visiblemente de marrón, lo que indica niveles más altos de expresión de MMP2 / 9.

un , b Tinción IHC para MMP2 y MMP9 en tejidos normales y tumorales de ratones de xenoinjerto modelo de líneas de carcinoma de células escamosas orales humanas

La familia de las metaloproteinasas de la matriz (MMP) juega un papel clave en la invasión y metástasis del cáncer. Se ha informado que las MMP2 / 9, que también se conocen como colagenasas IV y gelatinasas A / B, son las MMP relacionadas con el cáncer más importantes. Los estudios han revelado una correlación entre la expresión de gelatinasas y los malos resultados de muchos tumores, incluido el COCE [29, 30]. La alta expresión de MMP2 / 9 también se observó en nuestro estudio. Debido a que las MMP son, sin duda, importantes dianas contra el cáncer por su expresión generalizada y su estrecha relación con los cánceres. Por tanto, nuestros Omn-NP podrían utilizarse en casi todos los tumores. Su simplicidad y universalidad tiene un buen potencial de aplicación clínica.

Conclusiones

En este estudio, diseñamos y sintetizamos un nuevo sistema de administración de agentes de contraste de resonancia magnética dirigida a tumores para compensar los defectos de los agentes de contraste utilizados actualmente en la clínica. Se encontró una mayor proporción de tumor a fondo de MRI T1 y un tiempo de circulación sanguíneo prolongado para Omn-NP que para Omn en el modelo de ratones OSCC. Este estudio demuestra que los Omn-NP son prometedores como agentes de contraste de resonancia magnética específicos para tumores para mejorar la especificidad y prolongar el tiempo de circulación en los tejidos tumorales. Teniendo en cuenta las excelentes propiedades de biocompatibilidad y biodegradabilidad de PEG y PCL, y Omn es un agente de contraste de resonancia magnética ampliamente utilizado en la clínica, este sistema de administración de agente de contraste de resonancia magnética dirigido a tumores tiene un buen potencial de aplicación clínica. Además, se harán más esfuerzos para aumentar el contenido de carga de fármaco y la eficiencia de encapsulación de Omn en nuestros NP para una mejor sensibilidad.

Disponibilidad de datos y materiales

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles a pedido del autor correspondiente.

Abreviaturas

NP:

Nanopartículas

Omn:

Omniscan

OSCC:

Carcinoma oral de células escamosas

MMP:

Metaloproteinasa de matriz

Gd:

Gadolinio

mPEG:

Metoxi-poli (etilenglicol)

PCL:

Poli (ε-caprolactona)

Pep:

Péptido

Omn-NPs:

NP mPEG-Pep-PCL con Omniscan

Con-Omn-NPs:

NP mPEG-PCL con Omniscan

IRM:

Imágenes por resonancia magnética

EPR:

Permeabilidad y retención mejoradas

DCM:

Diclorometano

PVA:

Alcohol polivinílico

DLS:

Dispersión de luz dinámica

PDI:

Índice de polidispersidad

TEM:

Microscopio electrónico de transmisión

ICP-AES:

Espectrometría de emisión atómica de plasma acoplada inductivamente

DMEM:

Medio Eagle modificado de Dulbecco

FBS:

Suero fetal bovino

IHC:

Inmunohistoquímico

PBS:

Solución salina tamponada con fosfato

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