Nanoestructuras de oro en crecimiento para la absorción celular selectiva por formas

Experimental

Materiales

El ácido oleico (OA, 90%) se adquirió de Alfa Aesar. Nitrato de plata (AgNO ₃ ), bromuro de didecil dimetilamonio (DDAB, 98%), ácido cloroáurico (HAuCl ₄ .3H ₂ O, 99,999%), D - (-) - ácido isoascórbico (AsA, 98%), borohidruro de sodio (NaBH _4, ≥ 96%), ácido 11-mercaptoundecanoico (MUA, 98%) y O- [2- (3-mercaptopropionilamino) etil] -O-etilpolietilenglicol (PEG-SH) de peso molecular 5000 Da se adquirieron de Sigma-Aldrich . Se adquirió bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB, 99% +) de Acros Organics y citrato de sodio dihidrato (citrato de Na, calidad ACS) de Merck. Se utilizaron todos los productos químicos tal como se recibieron sin purificación adicional. Todas las soluciones se prepararon con agua destilada desionizada (resistividad ~ 18,2 μΩ-cm) purificada con el sistema de purificación de agua Simplicity® Millipore.

Síntesis de Au anisotrópico

Las NS de Au anisotrópicas se sintetizaron usando un método de crecimiento de semillas asistido por Ag empleando tensioactivos binarios (Tabla 1). La Figura 1a muestra un esquema del método de síntesis empleado para el crecimiento de NR, THH y BP.

Esquemas de síntesis de Au NS. un Esquema que muestra el mecanismo de crecimiento de semillas asistido por Ag utilizado para la síntesis de diferentes formas de Au NS. b Esquema que muestra un mecanismo de crecimiento de dos semillas para nano makura

En resumen, 5 ml de HAuCl ₄ 0,5 mM .3H ₂ 0 se mezcló primero con 5 ml de solución de CTAB 0,2 M y se dejó agitar. Después de eso, 1.6 mL de 3.75 mM NaBH ₄ se añadió a la mezcla y se dejó reaccionar durante 2 min con agitación para permitir el escape del gas formado durante la reacción. La solución de semillas se utilizó para un mayor crecimiento, después de esperar 30 minutos.

En una reacción de crecimiento típica, se prepararon 15 ml de una mezcla acuosa de CTAB y cotensioactivo en varias proporciones a 80 ° C como se indica en la Tabla 1. Después de enfriar la solución de tensioactivo a temperatura ambiente, 750 μL de solución 4 mM de AgNO ₃ se añadió y se dejó agitar durante 15 min a 35ºC. A esto le siguió la adición de 15 ml de HAuCl ₄ 1 mM .3H ₂ O y se dejó mezclar con agitación durante otros 15 min. Después de eso, se agregaron 135 μL de 0.063 M AsA y 96 μL de semillas de Au, y la reacción se desarrolló durante 24 ha 35 ° C. Los productos se separaron mediante centrifugación. Es importante tener en cuenta que en el caso de OA, el color amarillo inicial de la solución de crecimiento se descarga dentro de los 15 minutos (antes de la adición de semillas), lo que indica la reducción de Au ³⁺ a Au ⁺ . La Figura 1b muestra el esquema para la síntesis del NM, que se basa en un enfoque de crecimiento de dos semillas. El protocolo seguido es similar al informado anteriormente, excepto por la adición de solución de crecimiento intermedio (300 μL) (obtenida casi inmediatamente después de agregar semillas de Au a la primera solución de crecimiento), en lugar de las semillas normales, a una solución de crecimiento fresca y permitiendo la reacción. continuar durante 24 ha 35 ° C.

Síntesis de Au NS esféricas

Las NS esféricas de Au se sintetizaron utilizando un método de Turkevich modificado [44]. En una síntesis típica, se añadieron 10 ml de solución de citrato de sodio 10 mM a un matraz de reacción de 25 ml, mantenido a 70ºC. Diez mililitros de ácido cloroáurico 1,5 mM (HAuCl ₄ . 3H ₂ O) se añadió gota a gota y se dejó reaccionar durante 20 min con agitación vigorosa a 70ºC. La solución se volvió de color rojo violáceo alrededor de 8 minutos después de la reacción. Después de eso, la solución se enfrió a temperatura ambiente y las Au NS esféricas se separaron de la solución sin reaccionar, mediante centrifugación a 14.500 rpm durante 10 min.

Funcionalización superficial de Au NS

Para intercambiar los ligandos en la superficie de las NS de Au, un procedimiento de dos pasos adaptado y modificado de Thierry et al. [45] fue seguido. Las concentraciones de los NS sintetizados se ajustaron a 1 mg mL ⁻¹ antes del inicio de los pasos de funcionalización. El primer paso depende de la introducción de una capa de PEG-SH para reemplazar parcialmente la bicapa de CTAB unida, ya que el tiol tiene una mayor afinidad por la superficie de Au [46]. Además, una capa de PEG-SH proporciona estabilización estérica al NS. En el segundo paso, se reemplaza el CTAB residual y la capa de PEG-SH se intercambia adicionalmente con alcanotiol, MUA. MUA permite la eliminación completa de CTAB de la superficie de Au revestida con PEG-SH con impedimentos estéricos.

En un procedimiento de funcionalización típico, 1 mL de 1 mg mL ⁻¹ La solución de Au NS se mezcló con 1 mL de 1 mg mL ⁻¹ solución de la solución de PEG-SH. La solución mixta se mantuvo con agitación vigorosa permitiendo la sustitución parcial de CTAB con PEG-SH durante 2 h. Después de eso, los NS pegilados se eliminaron mediante centrifugación a 14.500 rpm durante 20 min y se volvieron a dispersar en 1 ml de agua MQ. Para funcionalizar las NS de Au con grupos de ácido carboxílico, se mezclaron 500 μL de la solución NS PEGilada con 250 μL de una solución 10 mM de MUA preparada en etanol / agua y se dejó reaccionar en un baño sónico mantenido a 55 ° C durante 1 h. . Después de eso, las NS de Au revestidas con MUA se separaron del MUA libre usando centrifugación a 14.500 rpm durante 20 min. Los Au NS recubiertos con MUA se redispersaron fácilmente en agua MQ.

Estudios in vitro

Cultivo de células de glioblastoma-astrocitoma

Se cultivaron células de glioblastoma-astrocitoma humano (U-87 MG, ECACC, Sigma-Aldrich, Salisbury, Reino Unido) en medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) con gentamicina al 1,25% (Sigma) y suero bovino fetal al 10% (Autogen Bioclear, Wiltshire, REINO UNIDO). Los cultivos se complementaron con L-glutamina 2 mM, 1% de aminoácidos no esenciales (NEAA, Sigma) y piruvato de sodio 1 mM (NaP, Sigma).

Ensayo LIVE / DEAD®

Un ensayo de viabilidad de células VIVAS / MUERTAS (Invitrogen, Life Technologies) evalúa la integridad de la membrana de las células y consta de dos tintes diferentes:calceína AM (excitación / emisión 494/517 nm) y homodímero 1 de etidio (excitación / emisión 517/617). Nuevo Méjico). En las células vivas, las esterasas intracelulares reaccionan con la calceína AM y producen una fluorescencia verde citoplasmática. El homodímero de etidio-1 (EthD-1) se difunde sobre las membranas celulares dañadas de las células muertas, donde se une a los ácidos nucleicos y emite fluorescencia roja. Después de marcar con NS, se realizó la viabilidad de células LIVE / DEAD® en células de glioblastoma-astrocitoma como lo describe el fabricante. Brevemente, se preparó una solución LIVE / DEAD® en 4.5 mL de PBS con 2.7 μL de calceína (Invitrogen), y se agregaron 12 μL de homodímero de etidio (Invitrogen) a 1:1 ( v / v ) y se dejó reaccionar durante 30 min a 37 ° C antes de la microscopía. Se añadió una tinción nuclear (Hoechst 33258, excitación / emisión 356/465 nm, Sigma) (200 μg mL ⁻¹ ) para visualizar el núcleo y dilucidar cualquier captación nuclear de Au NS. Las imágenes se realizaron en un microscopio fluorescente Axiovert 200 M (Zeiss, Alemania), a aumentos de × 40 o × 10, utilizando AxioVision Rel. 4.3 software. Las imágenes se procesaron posteriormente con ImageJ 1.46.

Evaluación de la toxicidad celular según la concentración

Las células al 70% de confluencia se marcaron con Au NS a concentraciones de NS / volumen de medio de 100 μg mL ⁻¹ , 200 μg mL ⁻¹ , 500 μg mL ⁻¹ y 2 mg mL ⁻¹ y se incubó a 37 ° C durante 24 h en placas de 9 pocillos (Corning®). Se prepararon tres paralelos (pocillos) para cada concentración. Se utilizaron como controles cultivos de glioblastoma-astrocitoma sin marcar, en la misma etapa de confluencia. Los porcentajes de células muertas se calcularon mediante recuento manual. La morfología altamente desordenada de las células de glioblastoma-astrocitoma hace que el conteo automatizado sea menos confiable. Se tomaron tres imágenes superpuestas de células vivas y muertas en cada pocillo, y se calculó el promedio de células vivas y muertas para cada forma. Se hizo lo mismo con la muestra en blanco y se evaluó la viabilidad restando el promedio de muertos / vivos del blanco.

Evaluación de la absorción celular en función del tiempo para nano makura Au NS

Las células al 70% de confluencia se marcaron con nano makura Au NS a concentraciones de NS / volumen de medio de 2 mg mL ⁻¹ y se incubó a 37 ° C durante 2, 6, 12 y 24 h antes del ensayo LIVE / DEAD® con tinción nuclear. Se utilizaron como controles cultivos de glioblastoma-astrocitoma sin marcar, en la misma etapa de confluencia. Se prepararon sedimentos celulares para TEM mediante tripsinación y centrifugación antes de la fijación primaria en paraformaldehído (2% v / v ) y glutaraldehído (2,5% v / v ) en PBS (0,1 M, pH =7,4) durante la noche. Para la fijación secundaria, se prepararon dos fijadores diferentes para una tinción óptima de las membranas intracelulares. Ambos se prepararon en tampón de cacodilato 0,1 M, uno que contenía tetróxido de osmio al 1% ( v / v ) y el otro contiene tetróxido de osmio al 1% ( v / v ) y ferrocianuro de potasio al 1,5% ( v / v ). Una hora después de la fijación secundaria a temperatura ambiente, se realizó una deshidratación escalonada con alcohol, antes de la deshidratación con óxido de propileno, infiltración y corte ultramicrotómico de cortes de 70 nm.

Técnicas de caracterización

Las imágenes STEM de campo brillante (BF) se adquirieron utilizando un microscopio electrónico Hitachi S-5500 que funciona a un voltaje de aceleración de 30 kV. Se adquirieron imágenes de microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (HRTEM) utilizando JEOL 2100 operando a 200 kV. Las distribuciones de tamaño y los potenciales zeta de los NS se midieron utilizando un instrumento Malvern Zetasizer Nano-ZS y el software del propio fabricante. Las mediciones de dispersión dinámica de luz (DLS) se basan en la suposición de partículas esféricas y no son apropiadas para medir los tamaños hidrodinámicos de NS anisotrópicos sin una configuración de múltiples ángulos y un ajuste riguroso de los datos resultantes. Sin embargo, DLS se ha utilizado en este estudio como un medio para realizar un seguimiento cualitativo de los cambios de tamaño que emanan del procedimiento de funcionalización. En todos los casos se utilizó agua MQ como disolvente. Los espectros ultravioleta-visible (UV-Vis) se adquirieron con un espectrofotómetro UV-2401PC (Shimadzu). Los espectros se recogieron en el rango espectral de 200 a 800 nm. Los análisis de espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (XPS) se realizaron utilizando un espectrómetro Kratos Axis Ultra DLD (Kratos Analytical, Reino Unido), equipado con una fuente de rayos X de aluminio monocromatizado (Al, hν =1486.6 eV) que opera a 10 mA y 15 kV ( 150 W). Los espectros de estudio se recogieron en el rango de energía de enlace de 0-1100 eV con una energía de paso del analizador de 160 eV. Se empleó un modo de lente híbrida (electrostática y magnética) junto con un área de análisis de aproximadamente 300 μm × 700 μm.

Resultados y discusión

Síntesis y caracterización de Au NS anisotrópicas

Las NS de Au anisotrópicas se sintetizaron mediante un enfoque de crecimiento mediado por semillas que emplea mezclas de tensioactivos binarios. Cuando se añadieron semillas de Au cubiertas con CTAB (~ 5 nm) a la solución de crecimiento de mezclas de tensioactivos binarios (relación molar de OA CTAB ~ 20:1), se formaron NR de Au de relación de aspecto baja (Fig. 2a y Tabla 2). La imagen HRTEM reveló la morfología monocristalina y de hueso de perro de los NR (recuadro en la Fig. 2a). OA, un ácido graso que también actúa como un agente reductor débil facilita la reducción de Au ³⁺ a Au ⁺ . El cambio en el color de la solución de crecimiento de amarillo a transparente (~ 15 min) confirmó nuestra observación. La adición adicional de ácido ascórbico a la solución de crecimiento aumenta la tasa de reducción de Au ⁺ . Como resultado, los átomos de Au se difunden rápidamente en los extremos {111} [16] facetas de los NR porque el empaquetamiento de las estructuras de micelas mixtas es menos denso en comparación con el lado {110} y el extremo {100} de los NR [25]. Por lo tanto, el crecimiento excesivo de NR en las facetas {111} finales que en las facetas {110} y {100} conduce a la formación de NR de morfología de hueso de perro. Nuestros resultados también sugieren que es poco probable que las facetas {110} estén recubiertas con Au debido a la fuerte interacción de estas facetas con moléculas de surfactante en comparación con otras facetas. También confirmamos el papel de la OA y el ácido ascórbico en la formación de Au NR de la morfología del hueso de perro. Cuando se redujo la concentración de OA o ácido ascórbico en la solución de crecimiento, solo se obtuvieron Au NR. Estos resultados indican la disminución en la tasa de reducción y la tasa de difusión de los átomos de oro, lo que lleva a la formación de Au NR (archivo adicional 1:Figura S1, ESI †).

Imágenes STEM y espectros UV-Vis de Au NS s de diferentes formas. un La imagen BF-STEM de Au NR de morfología de hueso de perro y la imagen HRTEM en el recuadro muestra la naturaleza monocristalina de los NR. b Imagen BF-STEM de Au NSs tetrahexaédricas alargadas (el recuadro es una imagen SEM). c Imagen SEM de Au BP (el recuadro es la imagen SEM de un solo BP). d Imagen TEM de partículas esféricas de Au (la imagen HRTEM en el recuadro muestra la naturaleza policristalina de las partículas de Au). e Imagen BF-STEM de Au NM. f Espectros UV-vis de Au NS de diferentes formas

Cuando se incrementó la concentración de OA en relación con CTAB en la solución de crecimiento (Tabla 1), se obtuvieron NS de Au de forma THH alargada (Fig. 2b y Tabla 2). El cambio en la forma de las Au NS se puede explicar en base a la modificación de las estructuras de micelas mixtas por OA. Las estructuras de micelas mixtas en forma de varilla se forman a una baja concentración de OA. La mayor cantidad de OA en las estructuras de micelas mixtas modifica su estructura a convexa y facilita la formación de THH Au NS alargadas. Nuestro estudio anterior también reveló que un aumento en la concentración de cotensioactivo hace que las estructuras de las micelas mixtas sean más convexas [25]. La forma de Au NS también se puede cambiar reemplazando OA con DDAB. Obtuvimos Au NS de forma bipirámide (BP) mediante el uso de CTAB y DDAB (Fig. 2c y Tabla 2) como se informó en nuestro trabajo anterior [25]. Además, las partículas esféricas de Au se sintetizaron mediante un método de Turkevich modificado (Fig. 2d).

También investigamos la influencia de la solución de semillas en la forma de Au NS. La solución de siembra se tomó de la solución de crecimiento de CTAB y OA (OA:CTAB ~ 20:1) después de 1 min de la reacción y se añadió a la solución de crecimiento fresca que contenía OA:CTAB ~ 20:1. Au NS de nano makura La morfología de (NM) se obtuvo después de completar la reacción de crecimiento (Fig. 2e). La morfología de la NM parece similar a la del hueso de perro. Sin embargo, dado que los NS crecen en todas las direcciones como se muestra en las imágenes TEM tomadas en diferentes ángulos (Fig. 3a y Tabla 2), por lo tanto, llamamos a estos NS NM. Para ilustrar el mecanismo de crecimiento de Au NM, se tomó un pequeño volumen de la solución de crecimiento a diferentes intervalos de tiempo y se analizó la reacción intermedia usando imágenes STEM (Fig. 3b). Cuando se añadieron partículas de semillas recubiertas de CTAB a la primera solución de crecimiento, el color de la solución de crecimiento se convirtió rápidamente en violeta oscuro, lo que indica la formación de NS de Au anisotrópicas. Se agregaron 300 μL de solución de la primera solución de crecimiento a la segunda solución de crecimiento, y luego, se agregaron algunas gotas de la solución a la rejilla TEM inmediatamente.

Morfología y crecimiento de Au NM (nano makura ). un Imágenes TEM de NM tomadas en diferentes ángulos. b Las imágenes BF-STEM muestran los pasos de crecimiento en la formación de NS de Au de tipo NM. La solución tomada de la solución de crecimiento en diferentes momentos se agregó directamente a la rejilla TEM sin purificación

Las imágenes STEM representativas mostraron un crecimiento relativamente más rápido de Au NM en la dirección longitudinal que en la transversal (0 s). Después de 30 s, se observaron NS que se asemejaban a la configuración de pajarita. Ya se observaron NM que tenían tamaños finales alrededor de 3 min de la reacción. No vimos ningún cambio adicional en la forma y el tamaño de los NS después de 30 min y 8 h. Con base en nuestro análisis, se puede plantear la hipótesis de que el crecimiento general de los NM de Au sigue un mecanismo de crecimiento autocatalítico estocástico, similar a las "palomitas de maíz", en el que las semillas individuales permanecen inactivas durante algún tiempo antes de crecer repentina y rápidamente en las formas finales, como lo ha hecho Cortie et al. [47]. Las NM tienen una estructura tridimensional, mostrada por imágenes HRTEM de las NM obtenidas en diferentes ángulos de rotación (Fig. 3a), a diferencia de las NS con forma de hueso de perro reportadas previamente [48, 49].

Se midieron las propiedades ópticas de las Au NS de diferentes formas y los resultados se muestran en la Fig. 2f. Los Au NS muestran características LSPR sintonizables en el rango UV-Vis –– visible –– infrarrojo cercano (IR). Las bandas de plasmón se dividen en multipletes para estructuras anisotrópicas - las bandas longitudinal y transversal, debido a oscilaciones de resonancia a lo largo de diferentes ejes. Los NR muestran al menos tres bandas distintas:516 nm, 679 nm y 796 nm, siendo la más fuerte la del medio. La aparición de una tercera banda puede estar asociada a la polidispersidad de los NR provocada por el efecto de grabado del ácido oleico. Esto conduce a la formación de nanobarras con bordes ásperos. Se observan picos de resonancia tanto transversal como longitudinal (557 y 760 nm, respectivamente) para NM, que tiene una superficie más irregular que las nanovarillas. Sin embargo, para estructuras más grandes (THH y BP), se observan picos LSPR individuales y anchos a 568 nm y 593 nm, respectivamente. Mientras que los espectros UV-vis para THH muestran una semejanza similar con estudios previos [50], los dos modos para BP parecen fusionarse en un pico amplio a diferencia de lo que se observa de otra manera [51]. Esto se puede atribuir a un bajo rendimiento de la forma BP o una centrifugación no selectiva de forma aplicada al Au NS o un recubrimiento desigual que conduce a la anisotropía de la forma en la solución.

Funcionalización superficial de Au NS

Se funcionalizaron NS de Au de diferentes formas utilizando un método de dos pasos, reemplazando el CTAB bicapa con O- [2- (3-mercaptopropionilamino) etil] -O-metilpolietilenglicol (PEG-SH) y posteriormente con MUA. La Figura 4a muestra los diámetros hidrodinámicos de los NS en cada etapa de la funcionalización. Se obtiene un aumento secuencial en los tamaños en comparación con los NS recubiertos con CTAB, para cada NS (excepto para los BP) que indica una funcionalización exitosa. Como las mediciones de DLS se basan en la suposición de partículas esféricas, el análisis de determinación del tamaño para los NS anisotrópicos debe aproximarse a los NS esféricos que tienen los mismos coeficientes de difusión que los NS anisotrópicos.

Tamaños y potenciales zeta de las Au NS. un Variación de los tamaños de DLS de las Au NS después de cada etapa de funcionalización. b Variación de los potenciales zeta de Au NS con cada etapa de funcionalización. X -axis representa la nanoestructura de Au de diferentes formas (nanobarras NR, THH tetrahexaedros, NM nano makura , BP bipirámide, SP esférica)

Esto aclara una ligera disminución en el tamaño de los BP recubiertos con PEG-SH y también respalda los datos de UV-vis anteriores. Como resultado de la funcionalización, las cargas superficiales de los NS disminuyen enormemente como se muestra en la Fig. 4b. El tensioactivo catiónico se desplaza fácilmente con PEG-SH, que se reemplaza adicionalmente por MUA debido a una mayor afinidad hacia la superficie de Au. Debido al pequeño tamaño de MUA, tiene una mayor flexibilidad para desplazar CTAB que permanece en los NS, incluso después de la PEGilación. Los valores de potencial zeta finales de los NS revestidos con MUA reflejan superficies cargadas negativamente para todos los NS excepto para los NR. Esta discrepancia puede estar relacionada con el recubrimiento desigual de los pequeños NR o su polidispersidad, y el principio de medición aplicado. Para los NS esféricos, la carga superficial negativa inicial se debe al recubrimiento de citrato. Sin embargo, grandes magnitudes de los potenciales zeta para todos los NS aseguran la estabilidad de los NS en soluciones acuosas. Las mediciones de XPS realizadas en las NS de Au después de cada etapa de funcionalización, es decir, con PEG-SH seguido de MUA muestran un contenido muy bajo de bromo en la superficie, lo que confirma la eliminación del CTAB unido en grandes cantidades de las superficies de las NS. (Tabla 1, ESI).

Además, un recubrimiento de los NS con PEG-SH y MUA no cambia drásticamente sus características ópticas. Sin embargo, el ensanchamiento de picos secuencial se obtiene después de la funcionalización para los NS anisotrópicos (archivo adicional 1:Figura S3, ESI †). Esto puede deberse a diferentes ejes de rotación de los NS debido a anisotropía, recubrimiento no uniforme, aumento de tamaño (datos DLS), polidispersidad de las muestras o una combinación de los anteriores. Como las propiedades ópticas de las NS de Au dependen de la forma, la superficie, el tamaño y el estado de agregación, también lo hacen sus interacciones con las células. Los estudios de interacción celular pueden revelar hasta qué punto se absorben las Au NS, sus efectos citotóxicos y pueden apuntar a futuras aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico.

Interacción celular de Au NS de diferentes formas

Generalmente, las NS de Au entran en la célula a través de la endocitosis, que puede ser mediada por un receptor o independiente del receptor, por fagocitosis dependiente de actina o por otras rutas endocíticas actualmente desconocidas [52]. Describir qué ruta toma el SN es de vital importancia, ya que en última instancia determina el destino intracelular del SN [53]. Los estudios han demostrado que el mecanismo de captación intracelular depende de las propiedades fisicoquímicas, la RA y las características superficiales del SN, así como del tipo de célula [54,55,56,57,58]. La carga de las moléculas estabilizadoras de la superficie será efectivamente la carga del NS [59]. Los NS cargados positivamente tienen una fuerte adsorción de proteínas en medios biológicos y pueden dañar gravemente las membranas de las células. Debido a esto, es preferible una carga neutra o negativa para evitar una fuerte adsorción en las membranas celulares y / o la adsorción de proteínas [26, 60]. Además, la forma de las NS determinará hasta qué punto la cobertura superficial de las moléculas estabilizadoras es uniforme o no [61].

Aquí, todas las NS de Au, excepto las NS esféricas, se sintetizaron con el agente tensioactivo CTAB. Las NS de Au se funcionalizaron con MUA para obtener una superficie cargada negativamente antes de los estudios de interacción celular. Posteriormente, se incubaron conjuntamente las Au NS estables recubiertas con MUA con células de glioblastoma-astrocitoma humano durante 24 h, y se evaluó el efecto de la forma y la concentración sobre la citotoxicidad con un ensayo LIVE / DEAD®, complementado con una tinción nuclear para resaltar las Au NS intracelulares .

La muerte celular más alta se observó con NM a alta concentración (Fig. 5a), con una muerte celular cercana al 20% después de la corrección del blanco. Las otras NS no mostraron la misma tendencia en la citotoxicidad, lo que podría indicar que las NM se absorben a una tasa / volumen más alta que las otras formas [62]. El recuento de células para estas formas mostró una citotoxicidad por debajo del 5% después de la corrección en blanco (para imágenes de todas las formas, consulte el archivo adicional 1:Figura S4, ESI †).

Efecto de Au NS en células de glioblastoma-astrocitoma. un Percentage cell death of glioblastoma-astrocytoma cells as a function of concentration of AuNSs. Incubation time was 24 h. Images b –m are acquired after incubation of makura -shaped AuNSs in glioblastoma-astrocytoma cells taken at several time points up to 24 h. b TEM shows an invagination of the cellular membrane (m membrane, scale bar = 1 μm), and c halogen and d fluorescence images show association of makura-shaped AuNSs at the cellular membrane. e Uptake of makura-shaped AuNSs were observed after 6 h (scale bar = 500 nm), f with uptake in intracellular vesicles (v vesicle, scale bar = 2 μm). g Staining of the nucleus (n ) suggests that makura-shaped Au NSs were excluded from the nucleus. h TEM images taken after 12 h suggest uptake via macropinocytosis (scale bar = 500 nm), with i intravesicular location of makura-shaped AuNSs (vm vesicular membrane, scale bar = 500 nm). j Intracellular compartmentalization was also visible from the microscopy. Uptake of makura-shaped AuNSs continued at 24 h as seen in TEM images k (scale bar = 2 μm) and l (scale bar = 5 μm). m Detachment of glioblastoma-astrocytoma cells from the surface was observed, which most likely is an indication of cell death

The data presented here suggest that size plays a minor role in cytotoxicity in glioblastoma-astrocytoma cells. For instance, the small spherical NSs (15 nm) showed the same uptake/cytotoxicity as the large BPs (650/270 nm). Based on previous studies, we expected the NRs to give the highest cytotoxicity, due to their AR and surface charge. Positively charged NSs are considered to be particularly toxic as they can induce apoptosis [63] and cause the production of reactive oxygen species [64]. However, in the data presented here, the positively charged NRs did not show increased cell death compared to any other shape (Fig. 5a). This might be explained as follows:the surface charge of NS was determined with zeta potential measurements, an approach based on spherical particle assumption (Table 2). Thus, the reported charge of the NRs most likely misrepresents their actual charge. Although the AR of the rods synthesized here is large (2.8), their overall size falls in a size range that shows good uptake in cells (20–50 nm). [30, 65] A previous study has suggested that the size of NS does not only seem to govern endocytosis but also exocytosis. For instance, the removal half-life of 14 nm AuNS was much faster than removal half-life of 74 nm AuNS [26]. Here, the smaller Au rods and spheres, may, therefore, have been removed via exocytosis, which may explain their low cytotoxicity.

The main feature of the NM is not their size, but their irregular structure, and it appears from the image in Fig. 5a that shape has been the determining factor for the high uptake. However, an irregular morphology may have undermined the surface coverage of MUA and as such decreased the solution stability of the NM. Also, we cannot exclude that as two-dimensional cell studies are affected by gravity, a low stability in the cell medium increases the likelihood of sedimentation which can propel the endocytosis.

To get further insight into the uptake mechanism and interactions, we followed uptake of NM at high concentration (2 mg mL ⁻¹ ) with light microscopy and TEM for 24 h. The images show that after 2 h of co-incubation, the NM associate with the cellular membrane (Fig. 5c, d) and are engulfed by the cells (Fig. 5b, e). The mechanism of endocytosis seems to be initially receptor-mediated (Fig. 5b) and at later stages through macropinocytosis (Fig. 5h). The latter is believed to occur when large objects enter a cell, and the aggregation of NSs may have induced macropinocytosis. This might mean that the initial solution stability of the Au NM is sufficient, but that with time they aggregate and are taken up as larger species, most likely due to protein adsorption. Uptake of any extracellular NS in an intracellular vesicle involves wrapping of the cell membrane. If many such wrapping events occur, this alters the global elasticity of the cell membrane, which in turn affects the membrane integrity. If many macropinocytosis events occur, the membrane integrity may be severely impaired. This is believed to be one of the effects for the cytotoxicity observed for the NM.

Once inside the cell, it appears that the Au NM align at the periphery of the vesicles, adhering to the vesicular membrane (Fig. 5i). The endosome seems to be trafficked towards the nucleus (Fig. 5f, g, and l), which is consistent with previous studies that show that Au NSs taken up via receptor-mediated endocytosis may eventually end up in the Golgi apparatus [53, 66]. The uptake appears to continue upto 24 h (Fig. 5k), owing to the high concentration gradient of Au NS in the cell culture media [59].

At 24 h with co-incubation, the morphology of the cells changes (Fig. 5m), going from star-shaped to a more rounded shape with less visible filopodia [67], followed by detachment from the surface. Although this study does not go further in the molecular events following uptake of NS, a detachment of filopodia may suggest that NM can interact with the cytoskeleton and cause detachment and apoptosis.

We extended the cytotoxicity assay beyond 24 h and investigated the result of co-incubation at 48 and 72 h, the reason being that few cell studies are performed at these time points [68, 69], and the main argument being that cellular uptake reaches a plateau at 24 h [70]. Our results show (Additional file 1:Figure S5, ESI†) that beyond 24 h, the cells continued to detach from the flask surface, i.e., cell death and uptake continue beyond 24 h. As we cannot exclude that starvation of the cells would have increased the cytotoxicity and detachment, a cytotoxic response is a dynamic process likely to evolve over time differentially.

Conclusions

In summary, we have synthesized five different shapes of Au NSs using a seed-mediated growth approach (nanorods, nanomakura , tetrahexahedral, bipyramidal) and the Turkevich method (spherical). These NSs have different sizes:the smallest being the NRs and the largest being the BPs, ranging from 22 to 156 nm. Their optical properties measured using UV-vis spectroscopy show LSPR span from UV, visible, to near IR. High values of zeta potential render good stability in aqueous solution. With an aim to exchange the cationic surfactant on the surface, a two-step functionalization protocol was employed to replace the CTAB with PEG thiol and MUA.

After coating, the NSs showed a decrease in surface charge, coupled with an increase in size, proving successful functionalization. In vitro studies were performed for all the synthesized NSs involving co-incubation with glioblastoma-astrocytoma cells for 24 h. The greatest cytotoxic response (~ 20%) was observed with NM at high concentration, which is consistent with higher uptake. An in––depth study with TEM revealed a time-dependent internalization in cancer cells via endocytosis and macropinocytosis. This successful internalization of the Au NM in cancer cells, coupled with their unique physicochemical properties, render them suitable for hyperthermia and drug delivery to cancer cells while being simultaneously imaged.

Abreviaturas

AgNO₃ :

Silver nitrate

Au:

Gold

BF:

Bright filed

BPs:

Bipyramids

CTAB:

Cetyltrimethylammonium bromide

DDAB:

Didecyldimethylammonium bromide

DLS:

Dispersión de luz dinámica

EMEM:

Eagle’s Minimal Essential Medium

EthD-1:

Ethidium homodimer-1

GBM:

Glioblastoma multiforme

HAuCl4:

Cholorauric aicd

HRTEM:

Microscopía electrónica de transmisión de alta resolución

IR:

Infrarrojos

LSPR:

Localized surface plasmon resonance

MUA:

11-Mercaptoundecanoic acid

Na-citrate:

Sodium citrate dihydrate

NM:

Nanomakura

NRs:

Nanorods

Ns:

Nanostructure

OA:

Oleic acid

PEG-SH:

O-[2-(3-Mercaptopropionylamino) ethyl]-O-ethylpolyethylene glycol

STEM:

Scanning transmission electron microscopy

TEM:

Microscopía electrónica de transmisión

THH:

Tetrahexahedra

UV-Vis:

Ultravioleta visible

XPS:

Espectroscopia de fotoelectrones de rayos X

Nanopartículas de MnO2 con plantilla de membrana de cáscara de huevo:Síntesis fácil y descontaminación con clorhidrato de tetraciclina Evaluación de la toxicidad de las nanopartículas de PEG-PCCL e investigación preliminar sobre su efecto antitumoral de la carga de paclitaxel