Un nuevo inmunosensor magnetoelástico para la detección ultrasensible del antígeno carcinoembrionario

Resumen

Se desarrolla un nuevo inmunosensor inalámbrico para la detección ultrasensible del antígeno carcinoembrionario. La dimensión óptima de los microchips, como unidades sensibles magnetoelásticas, se evaluó mediante simulación y experimentos. Los efectos únicos de la amplificación de la señal y la biocompatibilidad de las partículas de oro contribuyen a la estabilidad y sensibilidad del sensor. Además, para mejorar la sensibilidad, las concentraciones de trabajo de anticuerpo y BSA se seleccionan para que sean 50 mg / ml y 0,1%, respectivamente. Las imágenes de microscopio de fuerza atómica arrojan luz sobre el análisis biológico. El inmunosensor nano-magnetoelástico exhibe una respuesta lineal al logaritmo de concentraciones de antígeno carcinoembrionario (CEA) que van desde 0.1 a 100 ng / mL, con un límite de detección de 2.5 pg / mL. El biosensor diseñado tiene las ventajas de una excelente estabilidad y sensibilidad hacia CEA.

Antecedentes

El cáncer es una de las enfermedades mortales del mundo [1]. El cáncer en los pacientes puede detectarse clínicamente cuando la concentración de biomarcadores tumorales alcanza una cierta cantidad en suero [2]. Por lo tanto, es muy necesario lograr ensayos sensibles, rápidos y precisos para los marcadores tumorales, que proporcionen una estrategia eficaz para el diagnóstico del cáncer [3]. El antígeno carcinoembrionario (CEA) pertenece a una familia de glicoproteínas de superficie celular con un peso molecular de 180-200 kDa. Fue descubierto por primera vez en tejido de cáncer de colon humano en 1965 [4, 5]. El CEA suele presentarse en niveles muy bajos (0 ~ 5 ng / ml) en la sangre de adultos sanos [6]. Generalmente, un nivel anormal de CEA puede considerarse un signo de cáncer, como carcinoma gástrico [7], carcinoma pancreático [8], carcinoma colorrectal [9], carcinoma de pulmón [10] y carcinoma de mama [11]. Significa que CEA podría usarse como un biomarcador tumoral. La monitorización del nivel de CEA en sangre podría utilizarse para advertir, detectar y diagnosticar cánceres. Mientras tanto, el CEA también se puede utilizar para la investigación de seguimiento de aquellos que han sido tratados clínicamente. La sensibilidad del CEA a la recurrencia tumoral es superior al 80%, lo que es más temprano que el examen clínico y patológico. Por tanto, la observación continua del CEA proporciona una base importante para el diagnóstico y pronóstico de los efectos curativos [12].

Los biosensores responden a reconocimientos específicos de señales medibles de salida molecular biológica por alguna disciplina, lo que permite respuestas rápidas, alta sensibilidad y bajo costo. Recientemente, se han estudiado intensamente biosensores inmunológicos, como el inmunoensayo enzimático [13], el inmunoensayo fluorado [14] y el inmunoensayo electroquímico [15,16,17]. Debido a su excelente especificidad y sensibilidad, los inmunosensores proporcionaron medios prometedores para el análisis de biomarcadores tumorales, incluso cuando los compuestos diana se encuentran en concentraciones muy bajas [18,19,20,21].

La nanotecnología está proporcionando métodos novedosos para la aplicación de nanopartículas (NP) en la tecnología de biosensores. Los NP de metal exhiben muchas características especiales, que proporcionan plataformas notables para interconectar elementos de bioreconocimiento [22, 23]. Los inmunoensayos basados en NP han atraído una gran atención para los investigadores [24, 25, 26]. Los biosensores magnetoelásticos no se ven afectados por la temperatura ambiente y el pH con una alta sensibilidad de respuesta. Por tanto, en este estudio propusimos un método de inmunoensayo magnetoelástico basado en nanopartículas de oro (AuNPs) y microchips magnetoelásticos. Se desarrolló con éxito un inmunosensor para detectar biomarcadores CEA.

Resultados y discusión

En vista de la forma de cinta del microchip magnetoelástico (ME), la permeabilidad magnética es mayor a lo largo de su longitud [27]. Los resultados preliminares han demostrado que la anchura y el grosor óptimos del chip ME fueron de 1 mm y 28 μm, respectivamente [28]. Se utilizó simulación para optimizar la longitud del chip, como se muestra en la Fig. 1b.

Longitud óptima del chip ME. un El desplazamiento relativo es diferente con la variación de longitud. b Se utilizó simulación para optimizar la longitud del chip

El desplazamiento relativo es diferente con la variación de longitud en la Fig. 1a. El desplazamiento relativo máximo se obtiene cuando la longitud es de 6 mm en el análisis modal de primer orden. Significa la sensibilidad teóricamente más alta. Por lo tanto, las dimensiones óptimas del chip se diseñaron como 6 mm × 1 mm × 28 μm en este documento.

En la figura 2 se ilustra un diagrama esquemático del biosensor Nano-ME. En primer lugar, el chip Nano-ME se trató químicamente con cisteína para fabricar las películas moleculares autoensambladas (SAM) en la superficie, como una capa funcional para la inmovilización de CEAAb. Luego, la albúmina de suero bovino (BSA) promueve el rendimiento de CEAAb al reducir la unión no específica y el impedimento estérico. Se tomaron imágenes de microscopio de fuerza atómica (AFM) para observar la morfología de la superficie del chip. Como se indica en la Fig. 3a, el espesor de la capa SAM fue de 120 nm. La formación de imágenes en la Fig. 3b revela que el CEAAb se unió covalentemente a la capa SAM con una rugosidad creciente. En la Fig. 3c se muestra claramente que el CEA se reconoció específicamente y se combinó de manera efectiva, con una altura aproximada de 200 nm y un tamaño mayor.

Esquema del biosensor Nano-ME construido

Imágenes AFM de la capa SAM ( a ). Capa CEAAb-SAM ( b ). Complejo de CEA-CEAAb ( c )

En una determinada dimensión del chip, la concentración de anticuerpo es un factor importante relacionado con la sensibilidad del inmunosensor. Por lo tanto, fue necesario evaluar las señales de respuesta de diferentes concentraciones de CEAAb (20, 50, 70 y 100 μg / mL, como se muestra en la Fig. 4a). Los resultados muestran que la respuesta óptima se obtuvo a aproximadamente 448 Hz (Fig. 4b), cuando la concentración de CEAAb es de 50 μg / mL. Si la concentración de CEAAb aumentaba a 70 μg / ml, la respuesta comenzaba a disminuir debido al impedimento estérico y la repulsión electrostática [29].

un La curva de respuesta de frecuencia frente a CEAAb. b Histograma de frecuencia

En principio, el CEA se reconoce específicamente con anticuerpos, lo que conduce a la disminución de la frecuencia de respuesta. La Figura 5a muestra la curva de respuesta en tiempo real del inmunosensor hacia CEA. Mientras tanto, adquirimos una curva de ajuste lineal en la Fig. 5b.

Respuesta en tiempo real ( a ) y curvas de ajuste ( b ) del biosensor versus CEA

Generalmente, la respuesta estable del sensor se logró a los 40 min (Fig. 5a). El cambio de la frecuencia de resonancia se registró con las concentraciones correspondientes de CEA. El cambio de Hz depende linealmente del logaritmo de las concentraciones de CEA que oscilan entre 0,1 y 100 ng / ml ( R ² =0,9688), con el límite de detección de 2,5 pg / mL (Fig. 5b). Hasta donde sabemos, el rango lineal y el límite de detección son obviamente más bajos que los de los métodos anteriores [28]. Los resultados demostraron que se estableció con éxito un método inalámbrico y altamente sensible hacia CEA.

Conclusiones

En esta contribución, se desarrolló con éxito un inmunosensor Nano-ME para la detección altamente sensible de CEA basado en el chip ME. AuNPs y BSA mejoraron eficazmente la sensibilidad y la estabilidad. El inmunosensor Nano-ME propuesto exhibe amplios rangos de determinación de CEA de 0.1 a 100 ng / mL con un límite de detección bajo de 2.5 pg / mL. Por lo tanto, se logró la determinación precisa de CEA por el inmunosensor preparado con resultados satisfactorios. Beneficiándose de su especificidad, simplicidad y reproducibilidad, la plataforma propuesta muestra una aplicación prometedora en el desarrollo de la detección de cáncer no invasiva.

Métodos

Bajo el campo magnético variable en el tiempo, el microchip ME vibra a lo largo. En el campo magnético modulado para hacer vibrar el microchip ME, la energía del campo magnético se convierte en energía potencial elástica para alcanzar el valor máximo. Debido a la forma del chip sensor en forma de cinta, la permeabilidad magnética es mayor a lo largo de su longitud; por tanto, un campo magnético incidente genera vibraciones longitudinales en el sensor desde casi cualquier orientación excepto la normal al plano basal del sensor. Dado por la ecuación. (1):

$$ {f} _0 =\ frac {1} {2L} \ sqrt {\ frac {E} {\ rho \ left (1 - {\ nu} ^ 2 \ right)}} $$ (1)

donde E denota módulo de elasticidad, v es la razón de Poisson, ρ es la densidad del material del sensor y L es la dimensión longitudinal del chip. Cuando la temperatura de prueba, la humedad y otros parámetros ambientales son constantes, el cambio de frecuencia de resonancia del sensor magnetoelástico depende sensiblemente solo del cambio de masa (△ m ) en su superficie, como lo indica la Ec. (2)

$$ \ frac {\ triangle f} {\ triangle m} =- \ frac {f_0} {2M} $$ (2)

Basado en Eq. (2), el cambio de frecuencia de resonancia es proporcional a la cantidad de CEA. Por lo tanto, las concentraciones de CEA se pueden lograr mediante el cambio de frecuencia, donde f ₀ es la frecuencia de resonancia inicial, M es la masa inicial, △ m es el cambio de masa, y △ f es el cambio en la frecuencia de resonancia del sensor. La ecuación 2 muestra que la sensibilidad del sensor (△ f / △ m ) es inversamente proporcional a la masa magnetoelástica inicial (M) del sensor. Los sensores con dimensiones físicas más pequeñas tienen una masa inicial más baja, lo que resulta en una mayor sensibilidad. El signo negativo en la ecuación representa una disminución en la frecuencia (△ f ) a una adición de masa no magnetoelástica (△ m ) en el sensor. Por lo tanto, la unión de los organismos objetivo a la superficie del biosensor provoca un aumento de masa con una disminución correspondiente en la frecuencia de resonancia fundamental.

Las bases magnetoelásticas de la aleación Metglas 2826MB (Fe40Ni38Mo4B18) fueron procesadas por Honey well Corporation (Morristown, NJ, EE.UU.). Se adquirieron CEA, anticuerpo CEA, albúmina de suero bovino (BSA, 99%) y solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH =7,4) de Sangon (Shanghai, China). Acetona, isopropanol, etanol, 1-etil-3-carbodiimida (EDC) y N -hidroxisulfosuccinimida (NHS) se adquirieron de Sigma-Aldrich Corporation (Saint Louis, MO, EE.UU.). Todos los demás reactivos fueron de calidad analítica. El agua ultrapura se obtuvo del sistema Mill-Q (Milli-pore, EE. UU.). AFM Park System (ND-100, Corea), plasma (P3C, Shanghai, China), ohmímetro de Gauss (GM500), analizador de red vectorial ZNB (R&S, Alemania), cortador láser (AV3620A, Qingdao, China) y medidor de gauss HT20 (Hengtong, Shanghai).

La base de aleación ME se cortó con láser en microchips de 6 mm x 1 mm x 28 μm, luego se limpió por ultrasonidos con acetona, isopropanol, etanol y agua desionizada durante 5 min y se secó con nitrógeno. La activación de la modificación de la superficie de los microchips limpios se procesa mediante un método de plasma. Ambos lados del microchip se pulverizaron con una capa de cromo (100 nm), seguido de un recubrimiento con una capa de AuNP (40 nm) para fabricar chips Nano-ME. El chip Nano-ME trata con plasma con oxígeno de alta pureza (0,9999) y luego se sumerge en una solución de cisteamina 40 mM y se mantiene durante 12 ha temperatura ambiente. Después de eso, los chips Nano-ME se modificaron biológicamente y se incubaron con diferentes concentraciones de CEAAb durante 1 ha 37 ° C en presencia de 1-etil-3-carbodiimida (EDC) y N -hidroxisulfosuccinimida (NHS). El CEAAb se activó en primer lugar con 10 mg / ml de EDC y 10 mg / ml de NHS. Finalmente, el chip Nano-ME, modificado por CEAAb, se realizó con BSA al 0,1% durante 30 minutos.

El biosensor Nano-ME se construyó de la siguiente manera:se envolvió un tubo de vidrio con la bobina y se conectó a un analizador de redes vectoriales. Mientras tanto, la adición de campo magnético proporcionó corriente alterna para hacer que la bobina produzca un campo magnético alterno. La frecuencia de resonancia del biosensor Nano-ME puede obtenerse mediante un analizador de redes vectoriales. Se agregaron diferentes concentraciones de CEA (0-100 ng / mL) en el tubo de ensayo y se registró el cambio de frecuencia cada 5 min hasta los 40 min. Después de eso, el chip Nano-ME se enjuagó con PBS para la caracterización de AFM.

Abreviaturas

AFM:: Microscopio de fuerza atómica
AuNPs:: Nanopartículas de oro
BSA:: Albúmina de suero bovino
CEA:: Antígeno carcinoembrionario
CEAAb:: Anticuerpo CEA
EDC:: 1-etil-3-carbodiimida
Hz:: Frecuencia
YO:: Magnetoelástico
NHS:: N -Hidroxisulfosuccinimida
PBS:: Solución salina tamponada con fosfato
SAM:: Molecular autoensamblante

Preparación y caracterización de transistores de película fina de CuAlO2 nanocristalinos de tipo p procesados en solución Síntesis fácil y actividad fotocatalítica de luz visible mejorada de nuevos compuestos de heterounión p-Ag3PO4 / n-BiFeO3 para la degradación del tinte

Nanomateriales

Materiales poliméricos

Biologicos

Teñir

Especias