Cómo los Nanotubos de Carbono de Pared Múltiple Promueven el Desarrollo de Raíces Laterales en Tomate vía Señalización de Óxido Nítrico

Resumen

Numerosos estudios revelaron que los nanotubos de carbono de pared múltiple (MWCNTs) son tóxicos para plantas. Sin embargo, si o cómo los MWCNTs influyen en la formación de raíces laterales (RL), componente importante de la adaptabilidad del sistema radicular a diversas señales ambientales, sigue siendo controvertido. En este informe, hallamos que los MWCNTs pueden entrar en raíces de plántulas de tomate. La administración de MWCNTs promovió la formación de RL en tomate de manera aproximadamente dependiente de la dosis. La producción endógena de óxido nítrico (NO) fue desencadenada por MWCNTs, confirmada por método reactivo Griess, resonancia paramagnética electrónica (EPR) y microscopía confocal de barrido láser (LSCM), junto con el captador de NO. Existe una relación causa-efecto entre MWCNTs y NO en la inducción del desarrollo de RL, ya que la síntesis de NO y formación de RL desencadenadas por MWCNTs fueron bloqueadas obviamente por la eliminación de NO endógeno con su captador. La actividad de enzima generadora de NO nitrato reductasa (NR) aumentó en respuesta a MWCNTs. La inhibición de NR por tungstato no solo deterioró la producción de NO, sino que también abolió la formación de RL inducida por MWCNTs. La adición de N^G-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME), inhibidor de enzima tipo sintasa óxido nítrico (NOS) mamífera, no influyó en formación de RL. Colectivamente, proponemos que NO podría actuar como molécula señalizadora downstream en control de MWCNTs del desarrollo de RL, al menos parcialmente vía NR.

Introducción

Existen muchas aplicaciones biológicas y biomédicas de nanotubos de carbono [1, 2]. Debido a la capacidad única de penetrar fácilmente membranas celulares, la bioseguridad de nanotubos de carbono es siempre tema de debate [3, 4]. Mientras tanto, como la producción y uso de nanotubos de carbono crece rápidamente, es importante caracterizar mecanismos detallados de su citotoxicidad en humanos y mamíferos, y recientemente en plantas [3,4,5,6,7,8,9]. Es bien sabido que plantas y sus comunidades son muy importantes para humanos y ambiente, y están en riesgo de exposición a nanotubos de carbono, debido a acumulación en suelos mediante aplicación fertilizantes biosólidos [6, 10, 11]. Como miembros importantes de nanotubos de carbono, la toxicidad de nanotubos de carbono de pared múltiple (MWCNTs), consistentes en múltiples capas enrolladas de grafeno, ha sido ampliamente investigada. Estudios en mamíferos revelaron que exposición a MWCNTs y nanotubos de carbono de pared simple indujo daño oxidativo y activación NF-κB en queratinocitos humanos y células A549 [9, 12]. MWCNTs y nanotubos pared simple pueden fusionar con membrana plasmática, causando daño celular por peroxidación lipídica y estrés oxidativo [9, 11, 13, 14]. Citotoxicidad y estrés oxidativo por MWCNTs, y respuestas inflamatorias modestas, observadas en células endoteliales vena umbilical humana [15]. Estudio previo sugirió que toxicidad primaria MWCNTs en espinaca roja derivaba principalmente de sobreproducción especies reactivas oxígeno (ROS), y efectos tóxicos revertidos por ácido ascórbico suplementado [7]. En este sentido, MWCNTs considerado nuevo factor estresante para organismos, ya sea animales o plantas.

Formación de raíces laterales (RL), determinante importante de arquitectura radicular, considerada indicador de respuesta adaptativa a diversos estreses [16]. En plantas superiores, formación RL influenciada por fitohormonas y amplia gama señales ambientales, incluyendo disponibilidad agua, nutrientes, estrés abiótico como hipoxia y estrés metales pesados [17,18,19]. Mientras tanto, amplia evidencia confirmó que formación RL no solo actúa como soporte físico, sino que también contribuye a absorción agua y nutrientes para crecimiento y desarrollo vegetal [19,20,21]. Diferentes claves ambientales podrían desencadenar varios fenotipos respuesta morfogénica inducida por estrés (SIMR), incluyendo promoción formación RL e inhibición elongación raíz [17]. La regulación de formación RL también controlada estrechamente por fitohormonas, como auxina, y activación genes reguladores ciclo celular en respuesta a auxina sugerida [19, 22]. Mientras, participación de algunas moléculas pequeñas en organogénesis radicular inducida por auxina confirmada en pepino, tomate, soja, colza [23,24,25,26,27]. Estas moléculas pequeñas incluyen peróxido hidrógeno (H₂O₂), óxido nítrico (NO), monóxido carbono (CO), gas hidrógeno (H₂).

Entre estas, NO, gas radical libre, ha mostrado múltiples funciones fisiológicas en plantas [28, 29]. Además de mejora adaptación vegetal contra estreses, funciones NO incluyen promoción desarrollo pelos radiculares, enraizamiento adventicio, formación RL [30,31,32,33], aunque recursos enzimáticos de biosíntesis NO en esos procesos sigue siendo elusivo. En animales, síntesis NO desde L-arginina catalizada por enzima hemocontenida sintasa óxido nítrico (NOS) [34]. Aunque gen(es) codificando enzimas NOS no identificado en plantas, actividad tipo NOS mamífera detectada ampliamente [35, 36], e inhibidores NOS mamíferos, como N^G-nitro-L-arginina metil éster hidrocloruro (L-NAME), pueden inhibir generación NO en plantas [25, 33, 36,37,38,39]. Importantemente, amplia evidencia genética reveló que NO puede producirse por nitrato reductasa (NR), enzima conocida responsable metabolismo nitrógeno en plantas [28]. Participación producción NO mediada NR en cierre estomático y aclimatación fría demostrada genéticamente [37, 38]. Nuestro estudio previo mostró síntesis NO dependiente NR involucrada en formación RL mediada por gas hidrógeno inducida por auxina [39].

Hasta ahora, diferentes respuestas en formación RL, promoción o inhibición, reportadas respectivamente en varias especies vegetales suplementadas con nanomateriales, incluyendo MWCNTs [40,41,42,43], nanopartículas oro (Au NP [44]), óxido zinc (ZnO NP [45, 46]), dióxido titanio (TiO₂ NP [46]), óxido grafeno (GO [47,48,49]) (Tabla 1), y ningún estudio ha proporcionado prueba definitiva de papel NO en respuestas arriba. En este estudio, detección NO endógeno por método Griess, microscopía confocal láser (LSCM), y análisis resonancia paramagnética electrónica (EPR) revelaron nivel NO aumentado en plántulas tomate tratadas MWCNTs. Después, se observó formación RL. Estudiamos más participación NO en formación RL desencadenada MWCNTs, manipulando niveles NO endógenos usando captador NO y antagonistas inhiben NR y actividad tipo NOS mamífera. Experimento adicional reveló que NO dependiente NR podría ser, al menos parcialmente, esencial para formación RL en respuesta MWCNTs. Este trabajo abre nueva ventana para entender efectos biológicos nanomateriales en plantas.

Materiales y Métodos

Reactivos

Salvo indicación contraria, todos los demás químicos se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EE. UU.). MWCNTs, comprados a Sigma-Aldrich, caracterizados como descrito previamente [50]. Diámetro externo, interno, y longitud MWCNTs: 6–12 nm, 2,5–5 nm, 1–9 μm respectivamente. Tras tratamiento sonicación, suspensión coloidal homogenizada esterilizada y usada.

Otras nanopartículas carbono obtenidas Nanjing XFNANO Materials Tech Co., Ltd., incluyendo nanotubos carbono pared simple (SWCNTs, XFS22; pureza >95%, diámetro 1–2 nm, longitud 5–30 μm, área superficial especial >1075 m²/g), grafeno (XF001W; pureza ~99%, diámetro 0,5–5 μm, espesor ~0,8 nm, ratio monocapa ~80%, área BET 500–1000 m²/g; resistividad eléctrica ≦0,30 Ω·cm), carbono activado (AC, XFP06; pureza >95%, tamaño partícula 5±1 μm, volumen poro 1–1,2 cm³/g, poro 2,0–2,2 nm, área superficial especial ~1500–1700 m²/g).

Adicionalmente, nitroprusiato sódico (SNP) usado como compuesto liberador NO [30,31,32,33]. 2-(4-Carboxifenil)-4,4,5,5-tetrametilimidazolina-1-oxilo-3-óxido sal potásica (cPTIO) considerado captador NO [51,52,53,54]. Tungstato (Tg; inhibidor NR [28, 33, 37, 55,56,57]) y N^G-nitro-L-arginina metil éster hidrocloruro (NAME; inhibidor enzima tipo NOS mamífera [25, 33, 36,37,38,39]) también aplicados. En este estudio, concentraciones químicos arriba determinadas en experimentos piloto, desde los cuales se observaron respuestas significativas.

Material Vegetal, Condiciones Crecimiento y Determinación Formación RL

Tomate (Solanum lycopersicum L.) semillas "Jiangshu 14" suministradas amablemente Institutos Agrícolas Jiangsu, Nanjing, Jiangsu, China. Semillas seleccionadas tamaño idéntico germinaron agua destilada 25±1 °C oscuridad 3 días. Plántulas idénticas seleccionadas con radículas 2–3 mm transferidas a 6 mL soluciones tratamiento conteniendo concentraciones indicadas MWCNTs, 200 nM ácido 1-naftilacético (NAA; auxina conocida), 0,1 mM SNP, 0,2 mM cPTIO, 20 μM tungstato (Tg), 0,2 mM NAME, y otras nanopartículas carbono, incluyendo 5 mg/mL SWCNTs, grafeno, carbono activado (AC), solos o combinados para tiempos indicados. Plántulas crecieron en incubadora iluminada (25±1 °C) intensidad luz 200 μmol m⁻² s⁻¹ fotoperíodo 14/10 h (luz/oscuridad).

Tras tratamientos, se tomaron fotos, y número y longitud raíces laterales emergidas (>1 mm) por plántula determinados usando software Image J (https://rsb.info.nih.gov/ij/) [39, 58]. Como descrito previamente, solo segmentos inductores RL usados para análisis subsiguiente.

Imagen Distribución MWCNTs por Microscopía Electrónica Transmisión

Distribución MWCNTs en raíz plántula tomate caracterizada usando microscopía electrónica transmisión (TEM; JEOL, JEM-200CX, Tokyo, Japón). Preparación muestra para análisis TEM según protocolo previo [59].

Imagen NO Endógeno por Microscopio Confocal Láser

Imagen NO realizada usando sonda fluorescente NO bastante específica 4-amino-5-metilamino-2′,7′-difluorofluoresceína diacetato (DAF-FM DA). Tras lavado exhaustivo sonda, imágenes obtenidas usando microscopio confocal Zeiss LSM 710 (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania, excitación 488 nm, emisión 500–530 nm análisis NO). En experimento, 20 muestras individuales seleccionadas aleatoriamente medidas por tratamiento. Fotografías representativas resultados idénticos.

Contenido NO Determinado por Ensayo Reactivo Griess

Según métodos descritos previamente [50], contenido NO determinado con ensayo reactivo Griess. Importantemente, para evitar interferencia por contenidos concentrados nitrato y nitrito en plantas, muestras idénticas preincubadas 200 μM cPTIO (captador NO) 30 min consideradas muestras blanco. Tras adición reactivo Griess 30 min, absorbancia registrada 540 nm, contenido NO determinado comparación curva estándar NaNO₂.

Determinación NO con Resonancia Paramagnética Electrónica (EPR)

Según métodos previos [39, 55, 60], determinación nivel NO usando resonancia paramagnética electrónica (EPR) realizada. Capa disolvente orgánico usada determinar NO en espectrómetro Bruker A300 (Bruker Instrument, Karlsruhe, Alemania) condiciones: temperatura ambiente; frecuencia microondas 9,85 GHz; potencia microondas 63,49 mW; frecuencia modulación 100,00 kHz.

Determinación Actividad Nitrato Reductasa (NR)

Actividad NR detectada espectrofotométricamente 540 nm según método previo [57]. Nitrito producido determinado espectrofotométricamente 540 nm adición 1 mL 1% (p/v) sulfenilamida en 3 M HCl junto 1 mL 0,02% (v/v) n-(1-naftil)-etilendiamina.

Análisis Estadístico

Cuando se indica, resultados expresados valores medios ± EE tres experimentos independientes con tres réplicas biológicas cada. Análisis estadístico realizado software SPSS Statistics 17.0. Para análisis, prueba múltiple Duncan (p < 0,05) elegida apropiada.

Resultados

MWCNTs no solo Entran en Células Raíz, sino que Promueven Formación RL

Formación RL determinante mayor arquitectura sistemas radiculares. Para investigar efecto MWCNTs en formación RL, plántulas tomate 3 días incubadas con rango concentraciones MWCNTs (0,05, 0,5, 5, 50 mg/mL) 3 días. Aplicación 1-naftilacético (NAA) considerado control positivo. En experimento, tanto número como longitud RL determinados como dos parámetros formación RL. Como Fig. 1, comparado muestras control, MWCNTs exógenos indujeron significativamente formación RL manera aproximadamente dependiente dosis, efecto máximo 5 y 50 mg/mL. Respuesta inducible similar observada administrando 200 nM NAA. Considerando costo MWCNTs y respuesta inducible formación RL, 5 mg/mL MWCNTs aplicado en experimentos siguientes.

Formación RL tomate inducida MWCNTs manera aproximadamente dependiente dosis. Plántulas 3 días tratadas 200 nM NAA y concentraciones indicadas MWCNTs respectivamente. Número y longitud RL emergidas (>1 mm) por plántula determinados tras 3 días tratamiento. 30 (10×3) plantas en tres réplicas biológicas, experimentos 3 veces. Datos medias ± EE. Dentro cada conjunto, barras denotadas misma letra no difirieron significativamente p < 0,05 según prueba múltiple Duncan

Para validar función específica MWCNTs en inducción formación RL, investigamos si otras alotropías MWCNTs también tienen efectos inducibles. Como Fig. 2a, todos estos nanomateriales carbono exhibieron efectos tóxicos crecimiento tallo (datos no mostrados). Interesantemente, aplicación MWCNTs, SWCNTs, grafeno, carbono activado concentración idéntica (5 mg/mL) resultó diferencialmente en aumentos número y longitud RL, comparado plantas control sin químicos (Fig. 2b). Entre estos químicos, respuesta inducible máxima descubierta en plántulas tomate incubadas MWCNTs.

Cambios formación RL respuesta diferentes nanopartículas carbono. Plántulas 3 días tratadas agua destilada (Con), 5 mg/mL MWCNT, SWCNTs, grafeno, carbono activado (AC) respectivamente 3 días más. a Fotos representativas tomadas. b Número y longitud RL emergidas (>1 mm) por plántula determinados también. Barra escala = 50 mm. 30 (10×3) plantas tres réplicas biológicas, experimentos 3 veces. Datos medias ± EE. Dentro cada conjunto, barras misma letra no difirieron significativamente p < 0,05 según Duncan

Con ayuda microscopía electrónica transmisión (TEM), distribución MWCNTs evaluada fácilmente. Resultados Fig. 3 revelaron MWCNTs, aplicados exógenamente, absorbidos por plántulas tomate, y distribución MWCNTs encontrada en células raíz. Este resultado entendible, ya que raíces plántulas cultivadas directamente en solución líquida conteniendo MWCNTs.

Distribución MWCNTs raíces tomate. Imágenes TEM plántulas 3 días tratadas agua destilada (Con; a) o 5 mg/mL MWCNTs (b) 1 día. Flecha roja pared celular, flecha blanca MWCNTs

Síntesis NO Inducida MWCNTs y Formación RL Posterior Sensibles a cPTIO, Captador NO

Para investigar si NO también involucrado en formación RL inducida MWCNTs, función NO en formación RL elicita MWCNTs evaluada manipulando niveles NO endógenos usando compuesto liberador NO y captador. Similar resultados previos [31], administración nitroprusiato sódico (SNP) resultó inducción formación RL, y respuesta aditiva observada aplicando SNP y MWCNTs juntos (Fig. 4). Al añadir 2-(4-carboxifenil)-4,4,5,5-tetrametilimidazolina-1-oxilo-3-óxido sal potásica (cPTIO; captador NO), respuestas promoción formación RL causadas MWCNTs deterioraron significativamente. Solo, cPTIO inhibió desarrollo RL comparado control sin químicos, indicando papel importante NO endógeno en organogénesis radicular.

Formación RL inducida MWCNTs sensible eliminación NO endógeno cPTIO, su captador. Plántulas 3 días tratadas agua destilada, 5 mg/mL MWCNT, 0,1 mM SNP, 0,2 mM cPTIO, solos o combinados 3 días. Después, número y longitud RL emergidas (>1 mm) por plántula determinados. 30 (10×3) plantas tres réplicas biológicas, experimentos 3 veces. Datos medias ± EE. Dentro cada conjunto, barras misma letra no difirieron significativamente p < 0,05 según Duncan

Para evaluar más papel importante NO endógeno en respuesta MWCNTs, curso temporal producción NO in vivo detectado primero método reactivo Griess. Durante determinación arriba, filtrado idéntico pretratado cPTIO considerado blanco para resultados precisos. Observado producción NO raíces plántulas tomate aumentó dramáticamente hasta 24 h tras tratamiento MWCNTs y luego recuperó niveles iniciales (48 h; Fig. 5a). Nivel máximo NO endógeno desencadenado MWCNTs 24 h abolido obviamente cPTIO, captador NO, sugiriendo papel específico NO.

Producción NO inducida MWCNTs bloqueada cPTIO, captador NO. Plántulas 3 días tratadas agua destilada y 5 mg/mL MWCNTs con o sin 0,2 mM cPTIO respectivamente. a Cambios actividad NR (izquierda), producción NO (derecha) método Griess. b Tras tratamiento 24 h, señal NO analizada LSCM (izquierda) y EPR (derecha). Barra escala = 0,1 mm. Datos medias ± EE. Barras misma letra no difirieron significativamente p < 0,05 según prueba múltiple Ducan

Para confirmar resultados arriba, ambos LSCM y ESR adoptados. Primero, cambios niveles NO endógenos raíces plántulas tomate monitoreados etiquetando NO usando sonda fluorescente permeable celular bastante específica NO DAF-FM DA e imagen LSCM. Similar resultados previos (Fig. 5a), presencia cPTIO, intensidad fluorescencia dependiente DAF-FM aumentada MWCNTs abolida grandemente (Fig. 5b). Resultados implicaron fluorescencia desencadenada DAF-FM relacionada niveles NO endógenos raíces plántulas tomate.

Producción NO inducida MWCNTs confirmada espectroscopía EPR. Como esperado, raíces plántulas tratadas 24 h MWCNTs presentaron estructura triple hiperfina típica complejo NO. Sin embargo, adición cPTIO abolió señal arriba, indicando exposición MWCNTs resultó fuerte producción NO (Fig. 5b). Colectivamente, datos sugirieron síntesis NO podría ser requerida para formación RL desencadenada MWCNTs en plántulas tomate.

NR Podría Ser Responsable Producción NO Inducida MWCNTs y Formación RL Posterior

Ya que NR y NOS tipo mamífero son dos enzimas principales relacionadas síntesis NO en plantas, tanto tungstato (inhibidor NR) como NAME (inhibidor NOS mamífero) aplicados experimento subsiguiente. Aquí, tratamiento tungstato suprimió sustancialmente promoción formación RL en raíces plántulas tomate tratadas MWCNTs (Fig. 6). Comparativamente, inducción formación RL desencadenada MWCNTs no inhibida fuertemente adición NAME, indicando NOS tipo mamífero podría no ser enzima síntesis NO objetivo responsable producción NO elicita MWCNTs. También observado ligera pero no significativa disminución formación RL en plántulas tomate cuando tungstato o NAME aplicados por separado.

Cambios formación RL respuesta MWCNTs y dos inhibidores síntesis NO. Plántulas 3 días tratadas 5 mg/mL MWCNT, 20 μM tungstato (Tg), 0,2 mM NAME, solos o combinados 3 días. Después, número y longitud RL emergidas (>1 mm) por plántula determinados. 30 (10×3) plantas tres réplicas biológicas, experimentos 3 veces. Datos medias ± EE. Dentro cada conjunto, barras misma letra no difirieron significativamente p < 0,05 según Duncan

Papel NR en formación RL desencadenada MWCNTs examinado más monitoreando producción NO respuesta MWCNTs aplicados con o sin tungstato. Comparado cambios producción NO endógena (Fig. 5a), análisis curso temporal actividad NR mostró tendencia similar (Fig. 7a), también pico 24 h tras tratamiento MWCNTs. Resultados sugirieron aumento producción NO inducido MWCNTs principalmente resulta actividad NR aumentada. Consistentemente, inhibición producción NO dependiente NR por tungstato confirmada método Griess (Fig. 7b), LSCM, y EPR (Archivo Adicional 1: Figura S1).

Producción NO inducida MWCNTs bloqueada tungstato, inhibidor NR. Plántulas 3 días tratadas agua destilada y 5 mg/mL MWCNTs con o sin 20 μM tungstato (Tg). Cambios actividad NR (a) y producción NO (b) método Griess. Datos medias ± EE. Barras misma letra no difirieron significativamente p < 0,05 según prueba múltiple Ducan

Discusión

Fitotoxicidad consideración significativa entender impacto ambiental potencial nanopartículas [4, 7, 61,62,63]. Abundante evidencia reveló MWCNTs tóxicos plantas, incluyendo inducir daño oxidativo, inhibir germinación semilla, crecimiento y desarrollo raíz [11, 63, 64]. Sin embargo, como fenotipo SIMR, ramificación raíz mediante formación RL componente importante adaptabilidad sistema radicular diversas claves ambientales [17]. En este trabajo, integramos análisis biológico, farmacológico, bioquímico para mostrar participación producción NO mediada NR en formación RL inducida MWCNTs, al menos parcialmente en condiciones experimentales. Además, función NO en organogénesis radicular estimulada MWCNTs enfatizó roles centrales este segundo mensajero involucrado procesos desarrollo vegetal y adaptación contra estrés [29,30,31,32,33, 37, 38].

Primero, confirmamos 5 mg/mL MWCNTs (DE 6–12 nm) podían entrar tejidos raíz (Fig. 3). Después, inducción formación RL tomate observada (Fig. 1), imitando roles inducción NAA y SNP (Fig. 4), compuesto liberador NO conocido [30, 31]. Respuestas inducidas similares descubiertas árboles resiníferos [41], lechuga [42], Arabidopsis [43] desafiados MWCNTs (DE 6–13 nm, ~9,5 nm, 30–40 nm respectivamente). Por ejemplo, aplicación MWCNT prístino (p-MWCNT) o MWCNT carboxil-funcionalizado (c-MWCNT) (diámetro promedio 9,5 nm) promovió desarrollo RL plántulas lechuga [42]. Por el contrario, inhibición raíz primaria e incluso formación RL simultáneamente encontradas soja sometida MWCNTs (DE 20–70 nm [40]). Comparando datos diámetro externo MWCNTs (Tabla 1), suponemos efectos MWCNTs en formación RL variaron con diámetros, mostrando promoción diámetro menor e inhibición diámetro mayor. Ciertamente, mecanismo relacionado debe investigarse cuidadosamente. Fenómeno similar confirmado tolerancia salinidad vegetal [50]. Combinado resultados arriba, deducido función nanomateriales puede variar especie, y viceversa, diferentes tipos nanomateriales causar diversos efectos biológicos. Sin embargo, otros factores influyentes, como diferentes dosis MWCNTs [48] e incluso condiciones crecimiento vegetal, no fácilmente descartables.

Comparado otros nanomateriales, incluyendo SWCNT, grafeno, AC concentración idéntica, inducción máxima formación RL e incluso efectos tóxicos crecimiento tallo observados MWCNTs (Fig. 2). Estos podrían relacionarse características físicas especiales MWCNTs, un tipo nanomateriales con alta conductividad eléctrica, gran área superficial específica, alta relación aspecto, notable estabilidad térmica [65]. Efectos tóxicos nanomateriales ampliamente reportados pepino, col, zanahoria, cebolla etc. [66, 67].

Amplia evidencia mostró NO, actuando molécula señalizadora, regula amplia gama procesos vegetales adaptación ambiental a desarrollo, último incluyendo germinación semilla y organogénesis radicular [29, 68,69,70,71,72,73]. Nuestro experimento subsiguiente reveló NO puede involucrarse formación RL inducida MWCNTs. Aunque varios métodos imagen producción NO células vegetales aplicados, desventajas, incluyendo falta sensibilidad e interferencia moléculas independientes NO, pueden existir cada método [74]. Así, tres métodos responsables imagen y determinación NO, incluyendo método Griess, LSCM, EPR, junto aplicación cPTIO, captador NO, aplicados condiciones experimentales. Usando tres métodos, observamos aumento producción NO endógena inducida MWCNTs en plántulas tomate abolida cPTIO (Fig. 5), captador NO [30,31,32]. Importantemente, este proceso correlacionado respuesta biológica formación RL inducida MWCNTs, severamente bloqueada cuando cPTIO aplicado simultáneamente (Fig. 4).

Evaluación adicional respuestas y fuente(s) potenciales NO inducido MWCNTs exógenos reveló producción NO y formación RL posterior atribuible actividad NR. En plantas, producción NO principalmente genera NR y proteína tipo NOS mamífero [28]. Sin embargo, gen NOS planta aún no identificado [35, 75, 76], aunque algunos experimentos usando inhibidores enzima NOS mamífera proporcionaron evidencia vía L-arginina dependiente producción NO [36, 76]. NR confirmado fuente más importante NO en plantas [28]. Estudios previos mostraron producción NO dependiente NR funciona señal relacionada nitrato involucrada regulación arquitectura raíz [32, 33]. Además, producción NO dependiente NR estrechamente asociada aclimatación fría [38], tolerancia salinidad [50], cierre estomático inducido ácido abscísico [77]. Nuestros resultados revelaron tungstato (inhibidor NR) deterioró obviamente formación RL inducida MWCNTs, especialmente longitud RL (Fig. 6). Por el contrario, solo ligera disminución longitud RL, y no diferencia significativa número RL cuando L-NAME (inhibidor NOS mamífero) usado. Consistentemente, ensayo bioquímico mostró actividad NR aumentada obviamente MWCNTs (Fig. 7a), paralela cambios producción NO (Fig. 5a). Respuestas arriba bloqueadas totalmente tungstato (Fig. 7a, Archivo Adicional 1: Figura S1). Dedujimos así que aumento producción NO endógena inducida MWCNTs principalmente atribuible vía NR. Ciertamente, evidencia genética adicional debe investigarse.

Conclusiones

En resumen, proporcionamos evidencia mostrando producción NO inducida MWCNTs vía NR podría ser requerida para formación RL tomate y esto resumido Fig. 8. Importantemente, hallazgos arriba proporcionan insights mecanismo molecular intrincado funciones MWCNTs en plantas.

Representación esquemática propuesta formación RL tomate inducida MWCNTs principalmente vía producción NO dependiente NR. Papel enzima tipo NOS mamífera preliminarmente descartado

Disponibilidad Datos y Materiales

Todos los datos disponibles completamente sin restricción.

Abreviaturas

CO:

Monóxido carbono

cPTIO:

2-(4-Carboxifenil)-4,4,5,5-tetrametilimidazolina-1-oxilo-3-óxido sal potásica

DAF-FM DA:

4-Amino-5-metilamino-2′,7′-difluorofluoresceína diacetato

EPR:

Resonancia paramagnética electrónica

GO:

Óxido grafeno

H₂:

Gas hidrógeno

H₂O₂:

Peróxido hidrógeno

L-NAME:

N^G-Nitro-L-arginina metil éster

RL:

Raíz lateral

LSCM:

Microscopía confocal láser

MWCNTs:

Nanotubos carbono pared múltiple

NAA:

Ácido 1-naftilacético

NO:

Óxido nítrico

NOS:

Sintasa óxido nítrico

NR:

Nitrato reductasa

ROS:

Especies reactivas oxígeno

SIMR:

Respuesta morfogénica inducida estrés

SNP:

Nitroprusiato sódico

SWCNTs:

Nanotubos carbono pared simple

TEM:

Microscopía electrónica transmisión

Tg:

Tungstato