Deposición MAPLE asistida por láser de nanopartículas de conversión ascendente funcionalizadas con anticuerpos mejora el cultivo celular

Resumen

Un sustrato de cultivo celular de alto rendimiento depende de una superficie óptima que soporte la función y comunicación celular. Trabajos recientes demuestran que recubrimientos nanoestructurados pueden mejorar la adhesión celular, pero los métodos convencionales basados en solución a menudo introducen contaminantes. La evaporación láser pulsada asistida por matriz (MAPLE) ofrece una ruta limpia y no destructiva para depositar biopolímeros sobre diversos sustratos. En este estudio, sintetizamos nanopartículas de conversión ascendente (UCNPs) NaGdF₄:Yb³⁺,Er³⁺ y sus contrapartes funcionalizadas con inmunoglobulina-G (IgG) mediante un método de una sola olla. Las UCNPs exhiben un diámetro promedio de 50 ± 8 nm, y las imágenes TEM confirman la presencia de IgG en sus superficies. Usando un láser Nd:YAG de 532 nm (10 Hz), depositamos UCNPs —con y sin IgG— en platos de cultivo con fondo de vidrio mediante MAPLE. Luego se sembraron células endoteliales de vena umbilical humana (HUVECs) en estos sustratos y se compararon con controles de vidrio recubiertos con gelatina. Los ensayos de viabilidad celular revelaron ausencia de citotoxicidad, mientras que el análisis morfológico mostró una mejor adhesión y proliferación en ambas superficies recubiertas con UCNPs. Estos hallazgos demuestran que las UCNPs depositadas por MAPLE y funcionalizadas con anticuerpos pueden servir como recubrimientos biocompatibles y de alto rendimiento para aplicaciones de cultivo celular.

Introducción

Las células epiteliales recubren las superficies internas y externas del cuerpo humano, desempeñando un doble papel como barrera física y participante activo en procesos fisiológicos como función de barrera, señalización y defensa inmune [1]. En ingeniería de tejidos, la interacción entre células y superficies de sustrato es un determinante crítico de la adhesión, morfología y función celular. Los recubrimientos proteicos tradicionales —colágeno, gelatina, fibronectina— se han empleado durante mucho tiempo para mejorar la adhesión celular en superficies de vidrio o plástico. Avances recientes muestran que recubrimientos nanoestructurados pueden modular el comportamiento celular proporcionando señales topográficas y aumentando el área superficial efectiva, mejorando así la adhesión y proliferación [2-4].

Las nanopartículas de conversión ascendente (UCNPs) dopadas con iones lantánidos, como NaGdF₄:Yb³⁺,Er³⁺, exhiben excitación eficiente en infrarrojo cercano (NIR) y emisión visible o NIR, ofreciendo ventajas para imagen de tejido profundo y biosensores debido a su baja fototoxicidad y alta fotoestabilidad [5-9]. La funcionalización superficial de UCNPs con biomoléculas —avidina, ADN, anticuerpos— ha permitido imagen dirigida, sensado y etiquetado celular [19-21]. Sin embargo, se ha explorado limitado el uso de UCNPs funcionalizadas con anticuerpos como recubrimientos de superficie para cultivo celular.

Las técnicas de deposición convencionales (sol-gel, spin coating, dip coating) sufren de espesor incontrolado, residuos de solvente y potencial desnaturalización de biomoléculas. La evaporación láser pulsada asistida por matriz (MAPLE) evita estos problemas al atrapar el material objetivo en una matriz de solvente congelado; la energía láser es absorbida por la matriz, llevando a una transferencia suave del material al sustrato sin ablación directa de la biomolécula [24,25]. MAPLE se ha aplicado en administración de fármacos, electrónica orgánica y recubrimientos biomédicos [31-35], pero su impacto en sustratos de cultivo celular permanece poco explorado.

En este trabajo, reportamos la síntesis de UCNPs NaGdF₄:Yb³⁺,Er³⁺ y sus análogos funcionalizados con IgG, seguida de deposición MAPLE en platos de cultivo con fondo de vidrio. Luego evaluamos la biocompatibilidad e influencia en el comportamiento de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC), proporcionando una base para futuras aplicaciones en ingeniería de tejidos.

Métodos/Experimental

Materiales

Todos los reactivos fueron grado analítico: Gd(NO₃)₃·6H₂O (99,9 %), Yb(NO₃)₃·5H₂O (99,9 %), Er(NO₃)₃·5H₂O (99,9 %), NaF (≥ 99 %), polietilenoimina ramificada (PEI, Mw ≈ 800), anti-IgG humano (específico Fab, etiquetado FITC), DAPI, Faloidina-TRITC, y solventes (glicol etileno, isopropanol). Los materiales se compraron a Sigma-Aldrich, Fisher Scientific y Caledon.

Síntesis de UCNPs Con y Sin IgG por Proceso de Una Olla

Las UCNPs (NaGdF₄:Yb³⁺,Er³⁺) se sintetizaron vía ruta hidrotérmica modificada. En breve, 720 mg Gd(NO₃)₃·6H₂O, 170 mg Er(NO₃)₃·5H₂O, 160 mg Yb(NO₃)₃·5H₂O y 20 mL glicol etileno se mezclaron en un matraz de tres cuellos. Se añadió 0,7 g PEI, seguido de adición gota a gota de 336 mg NaF disueltos en 10 mL glicol etileno. La mezcla se calentó a 200 °C bajo nitrógeno y reflujo durante 6 h. El producto se recogió por centrifugación, se lavó con etanol y agua, y se secó a 60 °C.

Para la funcionalización con IgG, 15 mg de polvo UCNP se dispersaron en 15 mL agua destilada, luego se añadieron 5 mL tampón salino borato (pH 8) y 20 µg IgG. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 h, luego se lavó y pelletizó por centrifugación. El conjugado, UCNPs-IgG, se almacenó en tampón acuoso.

Esquema de síntesis de una olla de UCNPs y UCNPs-IgG.

Deposición de UCNPs Con/Sin IgG por MAPLE

La deposición MAPLE se realizó usando un sistema MAPLE 2000 (PVD Products, Inc.) con láser Nd:YAG de 532 nm. La solución de nanopartículas (1 % en peso en isopropanol) se congeló en un portaobjetos refrigerado con nitrógeno líquido. Parámetros láser: 10 Hz, ancho de pulso 200 µs, fluencia 150 mJ cm⁻², área de punto 0,63 cm². Sustratos de vidrio, pre-recubiertos con 2 % en peso de gelatina, se posicionaron a 4,5 cm del blanco y se mantuvieron a 25 °C bajo 1 × 10⁻⁶ Torr. Los portaobjetos de blanco y sustrato rotaron a 10 rpm y 25 rpm, respectivamente, durante una deposición de 2 h. Las películas resultantes se caracterizaron por EDX, FTIR y espectroscopía de fotoluminiscencia (PL).

Esquema de deposición MAPLE de UCNPs y UCNPs-IgG.

Caracterización de Materiales

Las UCNPs y UCNPs-IgG pre-deposición se examinaron por microscopía electrónica de transmisión (TEM, Philips CM-10, 80 kV). Los espectros de infrarrojo por transformada de Fourier (FTIR) se registraron en un Bruker Vector 22 (600–4500 cm⁻¹, resolución 4 cm⁻¹, 64 barridos). Los espectros PL se midieron con un espectrofluorómetro QuantaMaster 40 (Horiba). Las películas post-deposición se inspeccionaron por EDX (Hitachi S-3400 N con INCA PentaFET-x3) y microscopía confocal (Zeiss LSM 5 Duo). La citocompatibilidad se evaluó mediante ensayo MTT en HUVECs cultivados durante 24 h.

Estudio de Comportamiento Celular

HUVECs (ATCC) se sembraron a ~1 × 10⁵ células por plato en sustratos de vidrio (control gelatina, UCNPs, UCNPs-IgG). Tras 24 h de incubación a 37 °C, las células se fijaron con formalina al 4 %, se tiñeron con Faloidina-TRITC (actina) y DAPI (núcleos), y se imagenaron por microscopía confocal. Área celular, longitud de conexión, longitud celular y recuento celular se cuantificaron usando ImageJ.

Ensayo de Citotoxicidad

MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolio bromuro) se añadió al medio de cultivo tras 24 h, incubado 3 h, y la absorbancia se midió a 490 nm usando un lector Bio-Tek EL340I. Los experimentos se realizaron en triplicado.

Resultados y Discusión

Caracterización de UCNPs y UCNPs-IgG Antes de la Deposición MAPLE

Las imágenes TEM confirman la morfología cúbica de las UCNPs con diámetro promedio de 50 ± 8 nm. TEM de alta resolución revela un espaciado de red de 0,312 nm, correspondiente al plano (111) de NaGdF₄ cúbico (JCPDS 27-0697). Tras la conjugación con IgG, el tamaño de partícula aumenta a 54 ± 8 nm, y la capa de anticuerpo (~10 ± 5 nm) es visible como un halo periférico (Fig. 3b).

Micrografías TEM de a UCNPs y b UCNPs-IgG antes de deposición MAPLE.

El XRD en polvo muestra picos característicos a 32°, 37°, 54° y 65° (111, 200, 220, 311), confirmando la fase cúbica (Fig. 4).

Perfil XRD de nanopartículas de conversión ascendente NaGdF₄:Yb³⁺,Er³⁺.

Los espectros FTIR revelan picos de amina (1515 cm⁻¹, 1511 cm⁻¹) de PEI e IgG, estiramientos –CH₂–/C-C (2987, 2900, 1400 cm⁻¹), y bandas de carboxilo y amida (1249, 1650 cm⁻¹) confirmando la unión de IgG (Fig. 5).

Espectros FTIR de UCNPs-IgG y UCNPs, respectivamente, hechos por proceso de una olla.

Caracterización de UCNPs Tras Deposición MAPLE

El mapeo EDX de sustratos de vidrio recubiertos con UCNPs y UCNPs-IgG confirma la presencia de Gd, Er, Yb y F (Fig. 6a,b). Las mediciones PL muestran emisión verde (540 nm) y roja (650 nm) retenidas bajo excitación a 980 nm, con solo variaciones menores de intensidad atribuibles a defectos superficiales o error de medición.

Espectros EDX de a muestras tras tratamiento MAPLE y b muestras sin tratamiento MAPLE (vidrio desnudo).

El FTIR de las superficies recubiertas confirma further la preservación de grupos funcionales: la banda –OH a 3648 cm⁻¹ (IgG) aparece solo en UCNPs-IgG (Fig. 7a), mientras que la banda de amina a 1575 cm⁻¹ es evidente en UCNPs (Fig. 7b). La ausencia de estas bandas en vidrio desnudo (Fig. 7c) subraya la deposición exitosa de las capas de nanopartículas.

Espectros FTIR de vidrio desnudo y vidrio recubierto con UCNPs-IgG y UCNPs, respectivamente.

Comportamiento Celular en los Diferentes Recubrimientos

Las imágenes confocales tras 24 h de cultivo revelan números celulares comparables en todas las superficies, pero las superficies UCNPs-IgG exhiben mayor extensión celular, prolongaciones citoplasmáticas más largas y mayor conectividad intercelular (Fig. 8). El análisis cuantitativo muestra aumentos del 11,2 % y 22,2 % en área celular para UCNPs y UCNPs-IgG, respectivamente, respecto a controles de gelatina; las longitudes de conexión aumentan 12,5 % y 17,5 %; las longitudes celulares crecen 8,2 % y 17,3 %; y los recuentos celulares aumentan ~8 % en superficies recubiertas con nanopartículas (Fig. 9). Estas métricas confirman que tanto UCNPs como UCNPs-IgG mejoran la adhesión y extensión endotelial sin inducir citotoxicidad.

Micrografías confocales de HUVECs en a control, b UCNPs, y c UCNPs modificados con IgG.

HUVECs cultivados en diferentes recubrimientos: a área celular, b longitud de conexión, c longitud celular, d recuento celular.

Efecto del Recubrimiento en la Viabilidad Celular

Los ensayos MTT demuestran >99 % de viabilidad relativa en vidrio desnudo, UCNPs y UCNPs-IgG, superando el >85 % de referencia para materiales biocompatibles. El ligero aumento de viabilidad (105 % para UCNPs, 104 % para UCNPs-IgG) sugiere un efecto estimulante leve de los recubrimientos de nanopartículas, probablemente debido a mayor rugosidad superficial y adsorción de proteínas.

Viabilidad celular de HUVECs en vidrio desnudo, UCNPs, UCNPs-IgG y control recubierto con gelatina.

Conclusiones

Hemos demostrado que UCNPs NaGdF₄:Yb³⁺,Er³⁺ y sus contrapartes funcionalizadas con IgG pueden sintetizarse en un proceso hidrotérmico de una sola olla y depositarse en platos de cultivo de vidrio por MAPLE sin comprometer su integridad estructural o fotoluminiscente. TEM, FTIR, XRD y EDX confirman síntesis, conjugación y deposición exitosas. Los ensayos de biocompatibilidad revelan ausencia de citotoxicidad, mientras que la microscopía confocal muestra adhesión, extensión y redes intercelulares mejoradas de HUVECs en superficies recubiertas con nanopartículas. Estos hallazgos posicionan a las UCNPs depositadas por MAPLE y funcionalizadas con anticuerpos como recubrimientos prometedores de baja contaminación para plataformas avanzadas de ingeniería de tejidos y medicina regenerativa.

Abreviaturas

DAPI:

4′,6-Diamidino-2-fenilindol dihidrocloruro

EG:

Glicol etileno

HUVEC:

Células endoteliales de vena umbilical humana

IgG:

Inmunoglobulina G

MAPLE:

Evaporación láser pulsada asistida por matriz

PEI:

Polietilenoimina

Phalloidin-TRITC:

Faloidina-Tetrametilrodamina B isotiocianato

UCNPs:

Nanopartículas de conversión ascendente