SPIO mejora la presentación cruzada y la migración de las CD y la SPIO aniónica influye en los efectos nanoadyuvantes relacionados con la interleucina-1β

Métodos y materiales

Preparación del SPIO

Para preparar SPIO, se empleó un método de coprecipitación fácil como se informó anteriormente [24]. En resumen, una solución mixta de FeCl ₃ y FeSO ₄ (relación molar Fe ³⁺ :Fe ²⁺ =2:1) se preparó en atmósfera de nitrógeno y se agitó enérgicamente a 37 ° C durante 30 min. Un precipitado de color negro de Fe ₃ O ₄ Se formaron nanopartículas y se lavaron inmediatamente cinco veces con agua destilada mediante separación magnética. El Fe ₃ O ₄ luego se dispersó en agua destilada a una concentración de 3 mg / mL a un pH de 3. Finalmente, la suspensión se aireó (con aire) a 95 ° C y se separaron los SPIO marrón.

SPIO recubierto con DMSA (SPIO / D ^- ) y SPIO recubierto con APTS (SPIO / A ⁺ ) se prepararon revistiendo SPIO con ácido meso-2,3-dimercaptosuccínico (DMSA) y 3-aminopropiltrimetoxisilano (APTS), respectivamente. Para SPIO / D ^- , se añadió una solución acuosa de DMSA en una relación molar de 1:40 a 100 ml de solución de SPIO. Después de una reacción de 4 h con agitación continua, el SPIO / D ^- se separó a una velocidad de 500 rpm a 50 ° C. Para SPIO / A ⁺ , Se añadió APTS a la solución de SPIO en una relación molar de 0,2:1 con agitación vigorosa durante 5 h. Luego, el precipitado se disolvió con un imán permanente y se lavó con agua desionizada y la solución se trató usando ondas ultrasónicas. La solución resultante se lavó repetidamente con agua y el SPIO / A ⁺ finalmente se secaron en un polvo a 37 ° C al vacío.

Ratones

Se compraron ratones C57BL / 6 y ratones C57BL / 6 transgénicos con proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) del Centro de Investigación de Animales Modelo de la Universidad de Nanjing y se alojaron en condiciones libres de patógenos específicos (SPF) en el Laboratorio Central de la Universidad de Nanjing. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Nanjing, China.

Cultivo celular

Las CD murinas se generaron a partir de la médula ósea de ratón, como se describió anteriormente [25]. En resumen, los monocitos de médula ósea de ratones C57BL / 6 de 8 semanas de edad se separaron de sus fémures y tibias. Posteriormente, las células se cultivaron en RPMI-1640 (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) Junto con suero bovino fetal (FBS) al 10%, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos murinos (GM-CSF) 10 ng / ml; Gibco, EE. UU.) Y 1 ng / ml de interleucina-4 murina (IL-4, PeproTech, Rocky Hill, Nueva Jersey, EE. UU.). El medio de cultivo se reemplazó con medio fresco cada 2 días. Las CD inmaduras generalmente se recolectaron el día 6. Las CD de EGFP se derivaron de ratones C57BL / 6 transgénicos con EGFP de acuerdo con el método mencionado anteriormente.

Las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) congeladas descongeladas se dejaron reposar durante la noche en medio completo, es decir, X-VIVOTM 15 (Lonza Group Ltd., Basilea, Suiza) =1:1. Después de la centrifugación en gradiente de densidad, las PBMC se suspendieron en medio durante 4 h. Las CD humanas de las células adherentes se cultivaron a 37 ° C en un medio que contenía GM-CSF humano (100 ng / ml; R&D Systems, Minneapolis, MN, EE. UU.) E IL-4 humana (10 ng / ml; PeproTech, Rocky Hill, EE. UU.) Nueva Jersey, EE. UU.). La mitad del medio se cambió los días 2 y 4. Las CD humanas inmaduras se recolectaron el día 5. El virus de Epstein-Barr del citomegalovirus y las células T específicas del virus de la influenza (CEF) se derivaron de células suspendidas, que se cultivaron en medio CMX que contenía MHC. -I péptido CEF restringido (20 ng / mL, Panatecs, Heilbronn, Alemania, PA-CEF-002) durante aproximadamente 48 h. Las células T específicas de CEF se expandieron con 1000 U / ml de IL-2 humana (Peprotech, Rocky Hill, NJ, EE. UU., 200–02) en medio CMX durante 12 días. Para IL-2, el medio se reemplazó con medio fresco cada 3 días.

Caracterización

La morfología y el tamaño del SPIO se determinaron utilizando un microscopio electrónico de transmisión (TEM, Advanced Microscopy Techniques, Danvers, MA). Se utilizó un patrón de difracción de rayos X (XRD) para identificar los espectros del catalizador. También se midió el ensayo de potencial zeta para determinar las cargas superficiales de las nanopartículas recubiertas con diferentes polímeros. El SPIO / A ⁺ y SPIO / D ^- Se prepararon nanopartículas con valores de pH que oscilaban entre 3 y 8. Las mediciones del potencial Zeta se realizaron con un analizador de potencial Zetasizer Nano ZS90 (Malvern, Reino Unido). Las propiedades magnéticas de las nanopartículas se analizaron a 37 ° C utilizando un magnetómetro de muestra vibrante (Lakeshore 7407).

Ensayo CPRG

El B ₃ Línea de células T Z (un CD8 ⁺ Hibridoma de células T) puede expresar el gen LacZ cuando su receptor de células T se acopla a un epítopo de ovoalbúmina (OVA) 258-265 en presencia de la molécula H-2Kb MHC-I. CD (2 × 10 ⁴ ) y OVA (100 μg / mL, Sigma-Aldrich) se cultivaron con SPIO, SPIO / A ⁺ o SPIO / D ^- a 37 ° C. Seis horas después, las CD se cultivaron conjuntamente con B ₃ Z (2 × 10 ⁵ ) durante la noche. Se realizó un ensayo de rojo de clorofenol-β-galactosidasa (CPRG, Sigma-Aldrich, EE. UU.) Para determinar la producción de β-galactosidasa de la B ₃ Celdas Z En este ensayo, la densidad óptica (DO) a 595 nm indica la capacidad de presentación cruzada de antígenos de las CD.

Ensayo de apoptosis celular

Se empleó la clasificación de células activadas por fluorescencia (FCS) para explorar los efectos de diferentes concentraciones de SPIO sobre la viabilidad de las CD. En resumen, las CD inmaduras se incubaron con SPIO marcado con Anexina V y PI (Biouniquer, CHN), y la expresión de Anexina V y PI en las CD se examinó mediante FCS.

Imágenes de intensidad de fluorescencia in vivo

Para explorar la migración de países en desarrollo in vivo, se preinyectó TNF-α (60 ng / ratón) en las almohadillas de ambas patas traseras ( n =8). Después de 24 h, EGFP-DC etiquetados con SPIO (2 × 10 ⁶ ) en 40 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) se inyectaron en las almohadillas de las patas izquierdas de los ratones C57BL / 6, y se inyectó el mismo número de EGFP-DC sin marcar en el lado derecho. Para examinar el nivel de EGFP-DC que migran a los ganglios linfáticos, se empleó un sistema de imágenes Maestro (CRi, Woburn, MA, EE. UU.). Los ganglios linfáticos disecados se observaron utilizando filtros de excitación de 484 nm y filtros de emisión de 507 nm. Las imágenes fluorescentes que muestran fluorescencia verde se analizaron luego con el software Living Image (v 2.50; Caliper Corporation, Newton, MA, EE. UU.). Se utilizaron análisis de microscopía confocal para determinar la inmunohistoquímica. Los ganglios linfáticos congelados se cortaron en secciones de 5 μm de grosor y luego se fijaron, y las secciones se incubaron con anticuerpo de proteína verde fluorescente (GFP) (Invitrogen), con anticuerpo de cabra Alexa Fluor 488 nm (Invitrogen) utilizado como anticuerpo secundario. Se utilizó un microscopio de barrido láser confocal (Fluoview, Fv10i; Olympus) para observar las muestras.

Ensayo de presentación cruzada de antígenos DC humanos in vitro

Las CD humanas cultivadas (2 × 10 ⁴ ) se sembraron en una placa de fondo redondo de 96 pocillos a la que SPIO / A ⁺ y SPIO / D ^- Se agregaron nanopartículas (100 μg / mL) combinadas con proteína pp65 de citomegalovirus (CMV) (1 μg / mL, MACS), y la proteína CMV pp65 y el péptido CEF (1 μg / mL, péptidos Think) se usaron por separado como controles. Después de 6 h, las células T específicas de CEF (2 × 10 ⁵ ) se añadieron a las CD humanas durante 12 h. Brefeldin A (10 μg / ml, Sigma-Aldrich, EE.UU.) se mantuvo en el medio durante otras 6 h. Después de la estimulación y activación, se recolectaron células T específicas de CEF y se tiñeron con anticuerpos humanos contra CD3, CD4, CD8 e IFN-γ (Invitrogen, EE. UU.). Después de la tinción, las muestras se analizaron mediante un citómetro de flujo LSR II personalizado (BD, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE. UU.). Los datos recopilados se analizaron con el software FlowJo (Tree Star, Ashland, OR, EE. UU.).

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

Se empleó un kit Ready SET-Go de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) de IL-1β de ratón (eBioscience, EE. UU.) Y un kit de ELISA de IL-1β humana (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) Para determinar la secreción de IL -1β por países en desarrollo. Se utilizó una placa ELISA (Costar, EE. UU.) Recubierta con 100 μL / pocillo de IFN-γ para capturar anticuerpos durante la noche a 4 ° C y se bloqueó con tampón ELISA. Luego se agregaron muestras y estándares a los pocillos y se incubaron durante 2 ha 37 ° C. Se detectó IFN-γ biotinilado. Las muestras se midieron utilizando un lector de microplacas con una configuración de DO de 450 nm (BioTek, EE. UU.).

Análisis estadístico

Los datos se analizaron mediante el paquete estadístico de ciencias sociales (SPSS 13.0, Chicago, IL, EE. UU.). Los resultados se presentaron como la media ± DE, y las diferencias entre los grupos de control y de prueba se evaluaron mediante un análisis de varianza unidireccional, t de Student de dos colas pruebas y análisis de varianza de doble factor. Diferencias en * P <0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

Resultados

Caracterización de SPIO

La morfología y el tamaño del SPIO sintetizado se observaron mediante TEM. La imagen TEM mostró que SPIO tenía un tamaño medio de 8,7 nm y una forma esférica (Fig. 1a). El análisis XRD mostró seis picos que coincidían claramente con el estándar γ-Fe ₂ O ₃ reflexiones (Fig. 1b). Los resultados del magnetómetro vibratorio demostraron que el SPIO obtenido poseía un comportamiento superparamagnético, con una magnetización de saturación de 60,4 emu / g mejor que el Fe ₃ O ₄ (Figura 1c). El gráfico DLS mostró que la distribución de tamaño del SPIO es de 22 nm en solución (Fig. 1d). Para confirmar que las CD contenían SPIO, se realizó una tinción con azul de Prusia para verificar que las CD contenían hierro (Fig. 1e).

Caracterización de SPIO. un Imagen TEM del SPIO obtenido. b Patrón XRD del catalizador de nanopartículas que indica que el material es γ-Fe ₂ O ₃ . c Curvas de magnetización del SPIO y Fe ₃ obtenidos O ₄ nanopartículas. d Diámetro hidrodinámico de SPIO. e Morfología de los países en desarrollo marcados con 50 μg / ml de SPIO después de 12 h de incubación:países en desarrollo no etiquetados y países en desarrollo marcados con tinción de azul de Prusia

Presentación cruzada de CD activada por SPIO

Para estudiar más a fondo el efecto de las CD marcadas con SPIO sobre la activación de las células T en un sistema murino, el nivel de B ₃ La activación de las células T Z se determinó examinando la producción de β-galactosidasa mediante el ensayo CPRG. En este estudio se adoptó una concentración fija de 100 μg / mL de OVA y cinco proporciones de dosis de SPIO (1, 5, 10, 25 y 50 μg / mL después de 6 h). A medida que aumentaba la concentración de SPIO, el grado de activación de B ₃ Las células Z aumentaron gradualmente y alcanzaron una estabilidad de 25 μg / mL (Fig. 2a). Para investigar si la viabilidad de las CD marcadas con las diversas concentraciones de SPIO se vio influenciada, las CD y las CD marcadas con SPIO se analizaron mediante FCS después de la tinción con Anexina V y PI. Los resultados indicaron que el porcentaje total de CD de anexina V / PI a concentraciones de SPIO de 10, 25 y 50 μg / ml no difirió significativamente, mientras que el porcentaje de células apoptóticas aumentó después de la carga con 100 μg / ml de SPIO (Fig.2b ). Las moléculas coestimuladoras de superficie de las CD marcadas con diversas concentraciones de SPIO fueron observadas por FCS. La expresión de CD80 y CD86 tuvo un aumento detectable a 25 μg / mL en comparación con aquellos sin marcaje SPIO (Fig. 2c). Las CD marcadas con 25 μg / mL de SPIO no mostraron cambios en la apoptosis celular en diferentes puntos de tiempo (Fig. 2d). Usamos 25 μg / mL en los siguientes experimentos.

Influencias de la presentación cruzada de DC y la biocompatibilidad después del etiquetado con SPIO. un Presentación cruzada de países en desarrollo mejorada a diferentes concentraciones de SPIO. b CD apoptóticas y CD marcadas con SPIO examinadas por FCS en diferentes concentraciones (10, 25, 50 y 100 μg / mL). c Fenotipos de los países en desarrollo, incluido CD11c ⁺ CD80 ⁺ y CD11c ⁺ CD86 ⁺ después de marcar con SPIO (10, 25, 50 μg / mL). Las CD estimuladas con LPS (1 μg / mL) se utilizaron como controles positivos. d CD apoptóticas cargadas con 25 μg / ml de SPIO examinadas por FCS en diferentes puntos de tiempo (6, 12, 18 y 24 h)

Etiquetado de EGFP-DC con señales de EGFP mejoradas de SPIO en los ganglios linfáticos secundarios

Las EGFP-DC se derivaron con éxito de ratones transgénicos con EGFP in vitro, y las imágenes de microscopía de fluorescencia confocal mostraron que casi todas las EGFP-DC presentaban fluorescencia verde (Fig. 3a). Para investigar si la fluorescencia verde de EGFP-DC podría verse afectada por SPIO, se llevó a cabo FCS. Los resultados mostraron que la expresión de fluorescencia de EGFP no se debilitó después del marcaje con SPIO (Fig. 3b, c). Luego, se inyectaron las EGFP-DC marcadas con SPIO de 25 μg / ml en las almohadillas de las patas traseras del lado derecho de los ratones C57BL / 6 y se inyectaron EGFP-DC sin marcar en el lado opuesto. Las señales de EGFP se midieron en el ganglio linfático poplíteo (PLN) y el ganglio linfático inguinal (ILN), que son los ganglios linfáticos centinela y los ganglios linfáticos secundarios, respectivamente. Los resultados mostraron que la migración de EGFP-DC marcadas con SPIO y EGFP-DC no marcadas en los ganglios linfáticos centinela alcanzó un pico el día 7. No se observaron diferencias significativas en la señal de EGFP entre los dos grupos, mientras que se detectó una reducción significativa en el grupo PLN el día 14. Las señales de EGFP detectadas en el grupo ILN fueron consistentes con las del grupo EGFP-DC marcado con SPIO en el cuarto día y el séptimo día, lo que indicó que las DC marcadas con SPIO migraron a la linfa secundaria nodos (Fig. 3d-f).

Migración y ubicación de EGFP-DC después del etiquetado con SPIO. un Microscopía confocal de barrido láser de EGFP-DC marcadas con nanopartículas de SPIO de 25 μg / ml después de 12 h de incubación. b , c Intensidad de fluorescencia de las EGFP-DC marcadas con SPIO después de 12 h. Imágenes ópticas in vitro de los ganglios linfáticos de drenaje después de la retrotransfusión de EGFP-DC marcadas con SPIO en diferentes días. El TNF-α se inyectó por primera vez en la almohadilla del pie del ratón con anticipación para promover la migración de EGFP-DC. d - e Imágenes ópticas in vitro y análisis de la intensidad de la señal de los ganglios linfáticos en diferentes días después de la inyección de EGFP-DC con o sin SPIO. f Las células EGFP positivas de los ganglios linfáticos que drenan se detectaron mediante microscopía confocal láser

Presentación cruzada de DC murinos afectados de SPIO modificada con carga diferente

Los SPIO se recubrieron con APTS o DMSA. Para verificar la carga superficial del SPIO, medimos la característica del potencial zeta. Los potenciales zeta del SPIO / A ⁺ y SPIO fueron positivos, mientras que el potencial zeta de SPIO / D ^- mostró una carga negativa en solución cuando el valor de pH era 7 (Fig. 4a). La ultraestructura de las CD marcadas con SPIO recubiertas con polímeros cargados de manera diferente se observó mediante TEM. Las CD tratadas con SPIO parecían densas en electrones en comparación con las células no tratadas, y numerosas SPIO se agruparon en el citoplasma. El SPIO / A ⁺ fueron engullidos por endosomas en el citoplasma, mientras que una mayor cantidad de SPIO / D ^- se encontraron en el citoplasma de las CD, y casi todas estas nanopartículas estaban rodeadas por estructuras de membrana de varias capas que se parecían a los lisosomas (Fig. 4b). Examinamos si el SPIO cargado de manera opuesta podría desencadenar diferentes niveles de IL-1β. Según nuestros resultados, los países en desarrollo cargados con SPIO / A ⁺ y SPIO / D ^- indujo una secreción dependiente de la dosis de IL-1β. Independientemente de la concentración, encontramos que SPIO / D ^- indujo niveles significativamente más altos de IL-1β que SPIO / A ⁺ (Figura 4c). Debido a la obvia correlación entre IL-1β y la vía TLR3, para estudiar más a fondo el efecto de IL-1β en la activación de las células T, las CD se derivaron de ratones con inactivación de TLR3 y se cultivaron conjuntamente con SPIO / A ⁺ , SPIO / D ^- y OVA. Los controladores de dominio cargados con SPIO / A ⁺ + OVA podría activar efectivamente B ₃ Células T Z, lo que significa que la molécula TLR3 en las CD era definitivamente necesaria para la presentación cruzada (Fig. 4d).

SPIO recubierto con cargas diferentes afectó la presentación cruzada de DC y la secreción de IL-1β. un El potencial zeta dependiente del pH de SPIO recubierto con moléculas cargadas de manera diferente. b Ubicaciones de nanopartículas con diferentes cargas en países en desarrollo bajo TEM. c IL-1β inducida por SPIO recubierta con moléculas cargadas de manera diferente. d Presentación cruzada de SPIO / A ⁺ + OVA y SPIO / D ^- + OVA por DC a través de la vía TLR3

SPIO modificado con recubrimientos con carga opuesta promovió la presentación cruzada de antígenos por las CD humanas y se vio afectado por IL-1β

Para explorar la relación entre IL-1β y la presentación cruzada, seleccionamos el inhibidor de caspasa-1 YVAD y descubrimos que podría inhibir significativamente la secreción de IL-1β de las CD humanas después del pretratamiento con lipopolisacárido (LPS) 50 μM durante 3 h (Fig. . 5a). Además, encontramos que YVAD podría inhibir la secreción de IL-1β de las CD humanas causadas por SPIO / A ⁺ y SPIO / D ^- (Figura 5b). Luego investigamos si las CD humanas podrían usarse como APC efectivas y presentar CMV pp65 de forma cruzada con células T específicas de CEF. Para medir la presentación cruzada de antígenos, se introdujo tinción intracelular (ICS) para determinar el porcentaje de CD3 ⁺ específicos de antígeno CD8 ⁺ IFN-γ ⁺ y CD3 ⁺ CD4 ⁺ IFN-γ ⁺ Células T por FCS. DC cargados con SPIO / A ⁺ combinado con la proteína CMV pp65 indujo más CD3 ⁺ CD8 ⁺ IFN-γ ⁺ y CD3 ⁺ CD4 ⁺ IFN-γ ⁺ Células T que DC cargadas con SPIO / D ^- . Nuestros datos mostraron que el inhibidor de caspasa-1 YVAD aumentó significativamente las respuestas de células T inducidas por SPIO / D ^- + Proteína pp65 del CMV, mientras que inhibe parcialmente las respuestas de las células T inducidas por la SPIO / A ⁺ + Proteína pp65 de CMV (Fig. 5c, d). Estos resultados indicaron que se necesita un nivel moderado de activación de IL-1β para una presentación cruzada eficiente y que un nivel alto de activación de IL-1β suprime la presentación cruzada en las CD.

SPIO recubierto con cargas opuestas afecta la función de las CD humanas a través de la vía IL-1β. un Después del pretratamiento con LPS durante 3 h, se incubaron DC humanas con concentraciones crecientes de YVAD (1, 10, 25 y 50 μM), y luego se recogieron los sobrenadantes para un ELISA de IL-1β. b YVAD puede inhibir la secreción de IL-1β de las CD humanas a través de SPIO / D ^- . SPIO / A ⁺ y SPIO / D ^- afectan la presentación cruzada de DC influenciada por IL-1β. c CD3 ⁺ CD8 ⁺ IFN-γ ⁺ y d CD3 ⁺ CD4 ⁺ IFN-γ ⁺ Las células T se analizaron mediante tinción intracelular utilizando FCS

Discusión

La inmunoterapia ha sido un foco de investigación en estudios clínicos y experimentales desde el desarrollo de la biotecnología. Sin embargo, los ensayos clínicos previos de vacunas tradicionales de DC diseñadas para provocar inmunidad no han inducido suficientes respuestas inmunes [26]. Las nanopartículas representan un tipo de adyuvante y pueden promover la función de las CD para activar las células T [27]. Los rasgos más característicos de nuestro SPIO incluyen su biocompatibilidad y su aplicación de etiquetado de CD como adyuvante inmunológico. Las imágenes TEM muestran que nuestro SPIO tiene un tamaño medio de 8,7 nm en estado seco y una forma esférica (Fig. 1a). La tinción con azul de Prusia demostró que los SPIO son susceptibles de ser fagocitados por las CD (Fig. 1e), lo que indica la eficiencia de la ingestión.

Se ha informado que SPIO tiene amplias aplicaciones biomédicas, como en el etiquetado celular, la administración de fármacos, la resonancia magnética y la hipertermia magnética [28], que son aplicaciones que requieren biocompatibilidad. Por lo tanto, debe investigarse si las CD marcadas con SPIO tienen influencia sobre la apoptosis de las CD. Nuestros datos sugirieron que no hubo diferencias significativas en la apoptosis de DC cuando las DC se marcaron con menos de 50 μg / ml de SPIO (Fig. 2b). En el siguiente estudio, elegimos la proteína OVA como proteína modelo y B ₃ Células T Z como células T efectivas para observar si SPIO puede afectar la presentación cruzada de las CD. Nuestros resultados indican que las CD marcadas con SPIO pueden facilitar notablemente la presentación cruzada de OVA y la activación de B ₃ Células T Z. Las moléculas de superficie CD80 y CD86, que son marcadores de las CD maduras, son dos factores coestimuladores críticos necesarios para la activación de las células T. A 25 μg / mL, el B ₃ activado Las células T Z aumentaron con la dosis de nanopartículas y finalmente se estabilizaron (Fig. 2a). Además, la expresión de CD80 y CD86 en la superficie de las CD alcanzó un máximo (Fig. 2c). Por lo tanto, adoptamos la concentración de 25 μg / mL y encontramos que la apoptosis de las CD es independiente del tiempo (Fig. 2d), lo que demostró las excelentes funciones nanoadyuvantes y la biocompatibilidad de SPIO.

Para examinar la influencia de SPIO en la migración de DC, utilizamos EGFP-DC, que presentaron fluorescencia verde bajo la microscopía de fluorescencia confocal, para cocultivar con 25 μg / mL de SPIO durante 12 h. Observamos que la expresión de la fluorescencia de EGFP no se debilitó después del marcado con SPIO. En última instancia, la migración de las CD a los órganos linfoides secundarios es el parámetro clave para evaluar la eficacia de las vacunas basadas en CD. En nuestro estudio anterior, durante las primeras 24 h, las CD marcadas con SPIO no se detectaron en una cantidad significativa en los ganglios linfáticos secundarios [29]. Para determinar aún más si este fenómeno cambió con el tiempo, se recolectaron e inyectaron EGFP-DC marcadas y no marcadas en las almohadillas de las patas de los ratones para evaluar el potencial de SPIO en la migración de las DC. Nuestros resultados mostraron que apareció fluorescencia verde en el ILN los días 4 y 7 (Fig. 3d-f), lo que demuestra que SPIO puede facilitar la migración de EGFP-DC a los ganglios linfáticos secundarios. Esta propiedad se puede aplicar para restringir la metástasis de tumores y activar una mayor cantidad de células CTL en más ganglios linfáticos.

En nuestro estudio, hemos explorado las propiedades adyuvantes de SPIO con carga opuesta y el posible mecanismo subyacente a los cambios en la función de las CD. Se ha demostrado que la carga superficial de las nanopartículas de óxido de hierro influye en la eficiencia de absorción celular [30, 31]. En nuestra investigación anterior, informamos que la SPIO catiónica podría mejorar la presentación cruzada de antígenos y, en consecuencia, la activación de las células T, mientras que la SPIO aniónica se asoció con la autofagia. [16] Varias nanopartículas metálicas pueden inducir respuestas inflamatorias [32, 33]. Se ha informado que las nanopartículas de óxido de hierro activan NLRP3, rompen las membranas de los lisosomas, liberan catepsina B e inducen la secreción de IL-1β [34]. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que las nanopartículas de SPIO con carga opuesta podrían tener diferentes funciones para estimular la producción de IL-1β en las CD tanto murinas como humanas. En la Fig. 4a, nuestro análisis de potencial zeta mostró que el SPIO recubierto con APTS portaba cargas positivas, mientras que el SPIO recubierto con DMSA portaba cargas negativas. Bajo el TEM, encontramos que los SPIO cargados de manera diferente se agruparon en diferentes posiciones en el citoplasma (Fig. 4b). Para investigar la diferencia entre la presentación cruzada de SPIO / A ⁺ y SPIO / D ^- , exploramos la secreción de IL-1β en CD murinas inducida por nanopartículas cargadas de manera diferente. Evaluamos las respuestas de las CD murinas después del tratamiento con SPIO / A ⁺ y SPIO / D ^- . Exposición a SPIO / D ^- indujo la activación abierta de la secreción de IL-1β en comparación con la exposición a SPIO / A ⁺ (Figura 4c). Este fenómeno reveló en parte que la presentación cruzada de antígenos inducida por SPIO / D ^- no es tan eficiente como el inducido por SPIO / A ⁺ . Además del análisis CPRG del aumento de B ₃ Activación de células T Z después del cocultivo de DC murinas con SPIO / A ⁺ + OVA demostró que las nanopartículas cargadas positivamente pueden funcionar mejor cuando se usan como adyuvantes inmunes. Los receptores de tipo Toll (TLR) son importantes para desencadenar respuestas inmunitarias, como TLR3, y finalmente pueden resultar en la producción de inflamasomas, la activación de la proteína caspasa-1 y la secreción de citocina IL-1β [35]. Para demostrar si TLR3 está relacionado con la presentación cruzada de antígenos influenciada por nuestro nanoadyuvante, se emplearon DC knockout de TLR3 en nuestro estudio. TLR3 ^{- / -} DC cargados con SPIO / A ⁺ + OVA y SPIO + OVA estimularon eficazmente el B ₃ Activación de células T Z (Fig. 4d), lo que indica que la molécula TLR3 en las CD era necesaria para la presentación cruzada. En conjunto, estos resultados aclararon que los polímeros cargados de manera diferente en la superficie de las nanopartículas deben considerarse al investigar sus efectos sinérgicos sobre las respuestas inmunes activadas.

Nuestros datos muestran que las nanopartículas con carga opuesta podrían inducir la producción de IL-1β, mientras que SPIO / D ^- podría hiperactivar la secreción de IL-1β. Sin embargo, en comparación con SPIO / A ⁺ , SPIO / D ^- indujo un nivel más bajo de B ₃ Activación de las células T Z. Por lo tanto, especulamos que la producción aberrante de IL-1β puede contribuir a la disfunción celular en las CD. La mayoría de los estudios sobre adyuvantes de nanomateriales explotan CD de ratones, mientras que pocos han utilizado CD de humanos [36, 37]. Para verificar aún más nuestra hipótesis, usamos YVAD, que ha demostrado ser un inhibidor de caspasa-1 eficaz (Fig. 5a, b), para suprimir la secreción de IL-1β de las CD humanas. Se seleccionó la proteína CMV pp65 como antígeno modelo, y se usaron células T específicas de CEF expandidas in vitro como células de respuesta. La proteína CMV pp65 es una proteína inmunológicamente dominante que activa fácilmente CD8 ⁺ y CD4 ⁺ Células T para producir citocinas, en particular IFN-γ [38]. El péptido CEF se utilizó como control positivo para verificar que la adición de YVAD no afectaría la activación de las células T porque puede presentarse a las células T directamente. Curiosamente, con el uso de YVAD, las respuestas de las células T en el SPIO / A ⁺ grupo fueron ligeramente restringidos, mientras que las respuestas en el SPIO / D ^- grupo aumentado (Fig. 5c, d). La influencia de IL-1β en la presentación cruzada de DC proporcionó evidencia concluyente de que un nivel bajo de IL-1β inducido por SPIO / A ⁺ es necesario para la presentación cruzada de antígenos, y un alto nivel de IL-1β en el citosol inhibirá la función de las CD.

Conclusiones

Como se muestra en el resumen gráfico en la Fig. 6, SPIO puede promover la maduración, migración y presentación cruzada de países en desarrollo. La actividad de IL-1β moderada está relacionada en parte con la presentación cruzada de antígenos de las CD. Además, las nanopartículas cargadas negativamente pueden activar el exceso de IL-1β y posteriormente inhibir las funciones de las CD. En resumen, nuestros resultados indican que SPIO exhibe muchas propiedades biológicas y tiene un potencial adyuvante prometedor. Estos hallazgos ayudarán a identificar la elección óptima de nanoadyuvantes para el desarrollo de vacunas de DC en el futuro.

Resumen gráfico de SPIO como nanoadyuvante para países en desarrollo. SPIO mejora la función de los CD al promover la carga de los CD; por tanto, las CD marcadas con SPIO pueden migrar a las ILN activas en un órgano inmunitario y pueden ofrecer un nuevo enfoque en la inmunoterapia del cáncer. Los SPIO con carga aniónica activan las respuestas protectoras de IL-1β al activar la caspasa-1 en las CD, lo que afecta la presentación de antígenos a las células T activas

Abreviaturas

APC:

Células presentadoras de antígenos

APTS:

3-aminopropiltrimetoxisilano

ATP:

Trifosfato de adenosina

CPRG:

Rojo de clorofenol-β-d-galactopiranósido

CTL:

Célula T citotóxica

DAMP:

Patrones moleculares asociados a daños

DC:

Célula dendrítica

DMSA:

Ácido meso-2, 3-dimercaptosuccínico

EGFP:

Proteína verde fluorescente mejorada

IL-1β:

Interleucina-1β

MHC-I:

Complejo mayor de histocompatibilidad clase I

NLRP3:

Dominios NACHT, LRR y PYD que contienen proteína 3

OVA:

Ovoalbúmina

PAMP:

Patrones moleculares asociados a patógenos

SPIO:

Nanopartículas de óxido de hierro superparamagnéticas

SPIO / A ⁺ :

SPIO recubierto con APTS

SPIO / D ^- :

SPIO recubierto con DMSA

TLR:

Receptores tipo peaje

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