Un dispositivo portátil basado en sensor térmico plasmónico para la detección y cuantificación de ensayos de flujo lateral

Resumen

Las pruebas en el lugar de atención (POCT) se utilizan ampliamente para el diagnóstico temprano y el seguimiento de enfermedades. El ensayo de flujo lateral (LFA) es una herramienta comercial exitosa para POCT. Sin embargo, LFA a menudo adolece de una falta de cuantificación y sensibilidad analítica. Para resolver estos inconvenientes, hemos desarrollado previamente un LFA térmico utilizando nanopartículas de oro plasmónicas para el contraste térmico en un dispositivo portátil. Aunque esta metodología mejora significativamente la sensibilidad analítica en comparación con la detección visual convencional, aún persisten problemas de cuantificación. En este estudio, optimizamos las condiciones de funcionamiento del dispositivo utilizando modos de detección térmica por conducción y radiación que permiten la cuantificación de LFA. El límite de detección de las tiras que contienen simplemente nanopartículas se redujo 5 veces (modo de conducción) y 12 veces (modo de radiación) en comparación con la detección visual tradicional. Se estudió el efecto de la temperatura ambiente para ambos métodos de detección mostrando que el modo de radiación se ve más afectado por la temperatura ambiente que el modo de conducción. Para validar el método de detección térmica, se cuantificó el biomarcador de gonadotropina coriónica humana (HCG) utilizando nuestras tiras de LFA, obteniendo un límite de detección de 2,8 mUI / ml al utilizar el método de detección por radiación.

Introducción

La detección temprana y el diagnóstico rápido son importantes para la detección y el tratamiento de enfermedades. La mayoría de las pruebas médicas consumen mucho tiempo y requieren una preparación complicada de muestras clínicas, instrumentos grandes y profesionales de laboratorio bien capacitados [1]. Esos requisitos han obstaculizado enormemente el tratamiento médico en áreas de recursos limitados. Las pruebas en el punto de atención (POCT) utilizan equipos simples y minimizan el tiempo necesario para obtener resultados clínicamente relevantes, lo que permite a los médicos y pacientes tomar decisiones rápidamente. POCT tiene algunas ventajas obvias, como un tiempo de detección corto, procesamiento rápido de muestras, instrumentación simple y bajos requisitos de operación [2, 3]. Por lo tanto, la aparición de POCT puede ayudar al diagnóstico temprano y rápido de enfermedades, particularmente en áreas con recursos limitados, mejorando así las condiciones médicas. Sin embargo, la baja sensibilidad analítica, los procedimientos operativos complicados y los altos costos de los equipos suelen obstaculizar la aplicación de esta técnica. Por lo tanto, se necesita más trabajo con urgencia para encontrar aplicaciones POCT con la mayoría de las características ideales, mientras se minimizan los inconvenientes.

Para resolver algunos de esos problemas, el ensayo de flujo lateral (LFA) es un muy buen candidato como herramienta de prueba en POCT. LFA es un biosensor de tira en papel, en el punto de atención, que se utiliza para identificar los analitos objetivo en una muestra determinada [4, 5]. La LFA se realiza en una tira de papel (esquema 1b), que consta de una almohadilla de muestra, una almohadilla de conjugado, una almohadilla de absorción y una membrana de nitrocelulosa donde se produce la detección. Entre las ventajas de LFA, cabe mencionar su rapidez y ensayo de un solo paso, rentabilidad, fácil operación, pequeño volumen de muestra y larga vida útil en diferentes condiciones ambientales [6, 7]. El LFA convencional proporciona resultados de "sí o no" mediante la inspección de los cambios de color en la línea de prueba a simple vista, el método de detección más popular para este tipo de ensayos. Por lo tanto, este tipo de enfoque tiende a sufrir una falta de precisión y juicio subjetivo [8]. No obstante, dado que es fácil integrar LFA con dispositivos electrónicos, un enfoque de detección factible es desarrollar lectores de tiras para obtener resultados cuantitativos precisos. Los dispositivos de carga acoplada (CCD) o los sensores semiconductores de óxido de metal complementario (CMOS) se suelen aplicar para capturar imágenes en lectores de tiras. A menudo se adopta software de procesamiento de imágenes para lograr resultados cuantitativos. En estos lectores ópticos, la información óptica obtenida de la reflexión, transmisión o dispersión de la luz de una fuente externa se registra para permitir la cuantificación [9,10,11,12]. En los lectores colorimétricos, la intensidad del color, como el valor de gris o las coordenadas RGB, se recopila de las líneas de prueba y control para analizar las tiras de LFA [13,14,15,16,17]. Un inconveniente de este enfoque es que el tinte puede perder su color con el tiempo por fotodaño, medios mecánicos u otros procesos de degradación, lo que da como resultado una mala repetibilidad y precisión. En aquellos sistemas que recurren a lectores de fluorescencia [18, 19], los fluoróforos orgánicos se exponen a una longitud de onda de excitación específica que induce la emisión del fluoróforo presente en las tiras a una longitud de onda mayor. Esta luz emitida luego se recolecta para obtener una detección cuantitativa. El problema que no se puede ignorar es que los fluoróforos orgánicos habitualmente utilizados en estas aplicaciones sufren fotoblanqueo y degradación química, lo que provoca una atenuación de la señal con el paso del tiempo, requiriendo un manejo específico y un almacenamiento especial [7].

Concepto de detección térmica plasmónica. un El modelo de dispositivo portátil y los componentes principales (arriba) con dos modos de detección diferentes (abajo). b LFA en configuración de detección térmica

Recientemente, la detección térmica se aplica gradualmente a la detección de LFA. La termodetección consiste en el uso de un transductor de calor en el que el calor generado se incrementa en presencia del analito, permitiendo detectar esta señal térmica por dicho transductor. Polo y col. [20] exploró el concepto de detección impulsada por calentamiento plasmónico mediante la detección del antígeno carcinoembrionario (CEA) biomarcador del cáncer utilizando una fuente de luz infrarroja cercana (NIR) para inducir la generación de calor utilizando las propiedades plasmónicas de las nanopartículas de oro anisotrópicas. Qin y col. [21] propuso un método que utiliza contraste térmico para cuantificar LFA utilizando un láser verde como fuente de luz, que mostró una mejora de 32 veces en la sensibilidad analítica. En 2016, Wang desarrolló un lector de contraste térmico similar [22] que mejoró ocho veces la sensibilidad analítica en la cuantificación de LFA. La fuente de luz que se utiliza para inducir la generación de calor por parte del transductor se puede sintonizar en longitudes de onda específicas para evitar que se vea afectada por la presencia de otras moléculas que no absorben en esas longitudes de onda, asegurando la especificidad de detección. El uso de fuentes de luz ubicadas en la región NIR del espectro electromagnético permite evitar la absorción de la luz por la mayoría de las moléculas de origen biológico, particularmente la sangre [23]. Estas ventajas muestran que la detección térmica plasmónica con fuente de luz NIR es un método de detección de LFA prometedor. Sin embargo, en investigaciones anteriores, no se desarrolló ningún dispositivo POCT empleando tiras LFA junto con una fuente de luz NIR.

En este documento, desarrollamos un dispositivo portátil basado en detección térmica plasmónica (esquema 1a) que mejora la sensibilidad analítica en LFA sin modificación adicional de las tiras. La señal se amplificó poniendo en juego la resonancia del plasmón tras la irradiación con láser NIR. La longitud de onda del láser en el prototipo se encuentra dentro del pico de resonancia de plasmón superficial localizado (LSPR) de las nanopartículas (que actúan como transductores de luz a calor en nuestro entorno), generando así calor en la línea de prueba. Luego, la generación de calor es detectada por un sensor térmico ubicado en el dispositivo que mide el calor generado por emisión de infrarrojos (radiación) o por conducción de calor. La cantidad de calor generado es proporcional al número de nanopartículas en la línea de prueba y la potencia de irradiación [24]. No se necesita ninguna operación adicional.

La transferencia térmica tiene tres formas principales:conducción, convección y radiación. Para estudiar el rendimiento de detección de diferentes formas de transferencia térmica, probamos el modo de conducción (contacto) y el modo de radiación (sin contacto) mediante dos tipos de sensores (esquema 1a y archivo adicional 1:Figura S1). Todo el prototipo es compacto y utiliza tecnología de sistema integrado y componentes montados en superficie. Se investigaron los principales factores que influyen en la capacidad de detección para optimizar las condiciones de funcionamiento. Para verificar la capacidad de detección del dispositivo portátil, se cuantificaron las tiras de LFA cargadas directamente con nanopartículas en la membrana y se compararon con la detección visual convencional. Como nuestro método de detección depende de la temperatura, también se estudió el efecto de la temperatura ambiente en la detección de la señal térmica y se obtuvo una curva de calibración para el modo de conducción. Finalmente, los biomarcadores de gonadotropina coriónica humana (HCG) se cuantificaron como modelo para verificar las capacidades de detección de la detección térmica.

Materiales y métodos

Materiales y reactivos

La solución salina tamponada con fosfato (PBS) se adquirió de Lonza®. Se adquirieron clorhidrato de N- (3-dimetilaminopropil) -N-etilcarbodiimida (EDC) y polietilenglicol heterobifuncional (HS-PEG-COOH, PM =5000 g / mol (5 kDa)) de SIGMA®. Tween 20, Triton X100, albúmina de suero bovino (BSA), trehalosa, polivinilpirrolidona (PVP), N -hidroxisulfosuccinimida (S-NHS), hidróxido de sodio, cloruro de sodio, cloruro de oro (III) hidratado y hormona HCG se adquirieron de Aladdin®. La sacarosa, el tetraborato de sodio decahidratado, el ácido bórico, el yoduro de potasio y el tiosulfato de sodio pentahidratado se adquirieron de Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. El borohidruro de sodio se adquirió de Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co., Ltd. Anti-αHCG, anti-βHCG y anti -anticuerpos secundarios de ratón, membrana de nitrocelulosa (NC-a110), almohadilla de muestra (fibra de vidrio BX108), almohadilla de conjugación (fibra de vidrio BX101) y superficies de cloruro de polivinilo (PVC) se adquirieron de JieyYiBiotech ™. El ácido 4-morfolinetanosulfónico (MES) se adquirió en Shanghai Majorbio. Se compró etanol puro de Changshu Yangyuan Chemical Co., Ltd.

Síntesis de nanopartículas (nanoprismas de oro, AuNPrs)

Las nanopartículas utilizadas en este estudio se obtuvieron mediante una variación de nuestro protocolo informado anteriormente [25] que luego se mejoró [26]. Brevemente, un volumen de 220 ml de Na ₂ 0,5 mM S ₂ O ₃ se complementó con 20 μL de KI 0,1 M. Luego, se agregaron gradualmente 110 ml de la solución antes mencionada a una solución que contenía HAuCl ₄ 2 mM. en el transcurso de 30 sy se incubó a temperatura ambiente hasta un tiempo total de 4 min, momento en el que la solución se complementó con 110 mL del Na ₂ restante S ₂ O ₃ + Solución de KI en el transcurso de 30 sy se incubó durante otros 4 min. Finalmente, 100 mL de Na ₂ S ₂ O ₃ sin KI se añadió a la solución resultante y se incubó durante 60 min a temperatura ambiente obteniendo las nanopartículas finales en forma de prisma. Todos los pasos de incubación descritos anteriormente se realizaron sin agitar. Después de la síntesis, las nanopartículas se estabilizaron con PEG (PEGilación). La cantidad de PEG añadida a las nanopartículas se preparó en una proporción de 1:2 (NP a PEG) del peso total de oro usado en la síntesis. Se diluyó PEG en 1 mL de agua Milli-Q y un volumen determinado de NaBH ₄ luego se añadió para alcanzar una relación molar de 1:1 de PEG a NaBH ₄ . El volumen completo del PEG a NaBH ₄ La solución se añadió completamente a las AuNPrs y se ajustó a pH 12 con NaOH 2 M bajo mezcla suave. Finalmente, la solución se sonicó durante 60 min a 60 ° C y luego se centrifugó durante 15 min a 4400 G a temperatura ambiente para separar las AuNPrs del exceso de PEG y los materiales sin reaccionar. Los sedimentos se resuspendieron en agua Milli-Q y se centrifugaron tres veces durante 9 min a 4400 G a temperatura ambiente. Estas muestras finales se diluyeron a una cuarta parte de su volumen original para permitirles decantar a temperatura ambiente durante varias semanas. Después de este tiempo, la capa superior de la solución (que contiene una fracción importante de subproductos de oro nanométricos más pequeños y ligeros) podría eliminarse de los AuNPrs que sedimentan en la parte inferior. La concentración de nanopartículas se obtuvo midiendo su absorbancia (DO) a 400 nm por espectroscopia UV-Vis y aplicando un factor de conversión (ε) de 11,3 mL mg ⁻¹ cm ⁻¹ . Este valor se obtuvo de forma experimental correlacionando la concentración de oro obtenida por ICP con la DO a 400 nm por UV-Vis de los productos finales de la síntesis.

Conjugación de nanopartículas con anticuerpo anti-HCG

Brevemente, se lavaron 3 ml de una solución que contenía 0,5 mg / ml de nanopartículas PEGiladas tres veces con tampón MES 0,1 M pH 5,5 mediante centrifugación durante 9 min a 6000 rpm en una microcentrífuga de mini centrifugado a temperatura ambiente. Las nanopartículas lavadas finales se resuspendieron en 1 ml de volumen final del mismo tampón (tampón MES 0,1 M pH 5,5) y se añadieron 4 mg de EDC y S-NHS a la solución. A continuación, las muestras se incubaron durante 20 min con mezcla suave, se centrifugaron durante 9 min a 6000 rpm min y se lavaron con tampón MES. Luego, se agregaron 20 μL de stock de anticuerpos (200 μg) a la muestra y se incubaron 3 ha 37 ° C seguido de una segunda incubación durante la noche a 4 ° C (sin agitación). Al día siguiente, las nanopartículas conjugadas se centrifugaron (9 min a 6000 rpm) y se lavaron dos veces con tampón borato 5 mM pH 9. Luego, se añadieron 25 mg de BSA a la solución. Después de 1 h de incubación a temperatura ambiente con agitación suave, la muestra se lavó (9 min a 6000 rpm) con tampón de borato suplementado con Tween 20 (5 mM pH 9) y finalmente se almacenó a 4 ° C hasta su uso posterior por no más de 4 –5 días.

Después de la preparación de las nanopartículas, se llevó a cabo el ensamblaje de las tiras reactivas (descrito en ESI).

Carga de nanopartículas en la membrana de las tiras

Para cargar las nanopartículas en la membrana de las tiras, se adquirió la concentración del stock original de nanopartículas PEGiladas (sin anticuerpo) y se realizaron una serie de diluciones en agua Milli-Q, resultando en un rango de concentraciones de 0 (agua pura Milli-Q sin nanopartículas) hasta 10 DO / mL para la concentración máxima, que corresponde a 0.9 mg / mL según el factor de conversión previamente caracterizado por ICP-AES. En aras de la simplicidad y la extrapolación, se prefirieron los valores de DO a la concentración en peso. Por tanto, se añadieron 2 µl de cada una de las diluciones antes mencionadas con una micropipeta directamente sobre la membrana de nitrocelulosa de las tiras y se dejaron secar a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 h. Las tiras secas se almacenaron a temperatura ambiente antes de las pruebas de irradiación.

Para la detección del antígeno HCG en las tiras se realizaron una serie de diluciones del analito (HCG) en PBS. Cada tira se corrió cargando 5 μL de AuNPr conjugado con anticuerpo anti-HCG en la almohadilla del conjugado y 50 μL de la dilución requerida que contenía HCG. Las tiras se secaron de manera similar a la del ensayo anterior.

Desarrollo del dispositivo portátil

El dispositivo portátil (Fig. 1a y archivo adicional 1:Figura S1) se ensambló utilizando tecnología de sistema integrado y componentes montados en la superficie, ya que son de tamaño pequeño y rentables. La composición del prototipo se muestra en la Fig. 1b. La placa base (Archivo adicional 1:Figura S1) es el módulo central del dispositivo, cuya función es procesar los datos y controlar el resto de componentes. Este módulo está compuesto principalmente por el MCU STM32F407, que cuenta con una gran memoria y un funcionamiento de bajo consumo. Se diseñó un circuito de conversión de voltaje en la placa base para proporcionar el suministro de voltaje correcto para cada módulo en el dispositivo.

Detalles del dispositivo portátil. un Dispositivo portátil basado en sensor térmico plasmónico. b Diagrama de composición de hardware, placa base, módulo de sensor y láser e interfaz de usuario. c Cartucho para tiras

Se aplicaron cinco interfaces en la placa base para la conexión con otros módulos. El sensor de temperatura se conectó a la placa base a través de una interfaz IIC para recibir las señales de temperatura transmitidas por el sensor. Para una medición de temperatura precisa, elegimos sensores de temperatura con salida digital. El sensor para el modo de conducción era un sensor semiconductor (ADT7420, Analog Devices) con una resolución de temperatura de 16 bits (0,0078 ° C) y un bajo consumo de energía (700 μW). En el modo de radiación, utilizamos un termómetro de infrarrojos (MLX90614, Melexis) con una resolución de temperatura de 17 bits y un consumo de energía de 3,9 mW. La interfaz entre el módulo de control láser y la placa base consistía en un circuito de control de relé para garantizar una gestión precisa del diodo láser mientras se protegía la placa base de la alta corriente. El módulo láser constaba de tres componentes:(1) el componente de control del láser (archivo adicional 1:Figura S1), (2) un diodo láser (Thorlabs, M9-A64-0200) que proporcionaba una fuente de luz con una longitud de onda de 1064 nm y una salida de potencia óptica máxima de 200 mW, y (3) una lente asférica (Thorlabs, 354330-C) montada en el módulo láser para hacer converger la luz emitida por el diodo láser en un área de 1 mm × 2,5 mm. Estos componentes permitieron iluminar con precisión la línea de prueba en la tira. Se utilizó una pantalla táctil LCD (TaoJinChi Corporation TJC4827K043_01RN, 480 × 272 píxeles) para proporcionar una interfaz gráfica de usuario. La interfaz 4 de la placa se dejó para descargar y depurar el programa. Se instaló una interfaz USB en el dispositivo, que sirvió como puerto de carga para la batería y como puerto de comunicación entre el dispositivo y una computadora externa opcional. El prototipo funcionaba con una batería de litio de 10.000 mAh. Los programas en la MCU fueron compilados por el software IAR (versión 7.50.2.10505). La interfaz gráfica de usuario se diseñó utilizando el software USART HMI.

Diseño de la caja del prototipo y el cartucho de tiras reactivas

Para garantizar que el dispositivo sea fácil de usar y portátil, se diseñaron una carcasa y un cartucho impresos en 3D, mejorando la capacidad antiinterferente y la estabilidad del dispositivo. Se utilizó resina de color blanco como material tanto para la caja como para el cartucho. Para el diseño se utilizó el software Solidworks 2018.

Una caja cuboide (archivo adicional 1:figura S2a) y una placa inferior rectangular (archivo adicional 1:figura S2b) se diseñaron para el dispositivo de acuerdo con la forma de los componentes internos. La carcasa cuboide proporcionó una posición de montaje fija para la pantalla LCD y el módulo de control de diodo láser. Se utilizó una ranura rectangular en el lateral de la carcasa para insertar el cartucho de tiras reactivas. La placa inferior se proporcionó con una batería y una base de montaje de la placa base, lo que permitió que los componentes se sujetaran a la placa inferior sin moverse. Todas las partes de detección se fijaron en la placa inferior. Un marco de soporte para el sensor y el cartucho de tiras se colocó en la placa inferior, poniéndolos en estrecho contacto. Se proporcionó una pista móvil de ajuste fino para el diodo láser y la lente que permite fijar y ajustar la distancia. El tamaño de toda la carcasa fue de 133 mm × 108 mm × 73 mm.

Se diseñó un cartucho especial (Fig. 1c, 15 mm × 4 mm × 70 mm) para la protección de las tiras reactivas. El cartucho tenía tres ventanas, una para la carga de la muestra y dos más para la visualización de la línea de prueba y la línea de control, respectivamente. La ventana de la línea de prueba se diseñó un poco más pequeña que el ancho de la tira reactiva para garantizar que el láser no pueda atravesar la tira reactiva y afectar la detección del sensor. Se elaboró una muesca de respaldo en la parte posterior del cartucho que permite que el sensor conductor toque completamente la parte posterior de las tiras en la posición de la línea de prueba mientras se asegura que el sensor de radiación pueda detectar la temperatura correctamente.

Algoritmo para detección térmica y cálculo de parámetros

Dado que el láser iluminó las nanopartículas, se generó calor en la línea de prueba que provocó cambios de temperatura detectables. Esta generación de calor ( Q , W / m ³ ) depende de la concentración de nanopartículas ( C , OD / mL), el área de iluminación ( A , m ² ) y la intensidad del láser ( I , W / m ² ) [22], de acuerdo con la siguiente fórmula:

$$ Q =CIA $$ (1)

La señal térmica (temperatura) se recogió cuando el láser iluminó las tiras. Como el área de iluminación y la intensidad del láser se mantuvieron constantes, la señal térmica cambia con la cantidad de nanopartículas que se unen a la línea de prueba. Para la cuantificación de la generación de calor, se compararon dos métodos. El primero utilizó los cambios de temperatura (archivo adicional 1:Figura S3) para cuantificar la señal térmica. La variación de temperatura (∆ T ) se calculó para la determinación:

$$ \ Delta T ={T} _ {\ mathrm {end}} - {T} _0 $$ (2)

donde T _final es la temperatura final (máxima) alcanzada al final de la irradiación y T ₀ es la temperatura ambiente inicial registrada por el sensor antes del inicio de la irradiación. Otro método utilizó el cálculo cuantitativo del área bajo la curva (AUC, archivo adicional 1:Figura S3). Este método divide la curva en trapezoides según una frecuencia de muestreo de 10 Hz seguida del cálculo de la suma de todos los trapezoides. La señal térmica se logró dividiendo el área por el tiempo de detección ( t _det ):

$$ \ mathrm {AUC} =\ sum \ limits_ {i =1} ^ n \ left (\ Delta {T} _i + \ Delta {T} _ {i-1} \ right) \ times 0.1 \ div 2 $$ (3) $$ {T} _ {\ mathrm {auc}} =AUC \ div {t} _ {\ mathrm {det}} $$ (4)

Al aplicar ambos métodos en la detección, el análisis AUC dio una mejor repetibilidad de la cuantificación (Archivo adicional 1:Figura S4). Por lo tanto, se seleccionó el análisis AUC para su uso en la cuantificación final del calor.

Para evaluar el rendimiento de los diferentes métodos de detección, evaluamos el LOD de la cuantificación. En cada experimento, medimos una concentración para cuatro muestras (cuatro tiras, n =4). Considerando la desviación estándar (σ ₀ ) del grupo en blanco y la sensibilidad ( S ) que es la pendiente de la curva estándar en un rango lineal, evaluamos el LOD de la siguiente manera:

$$ \ mathrm {LOD} =\ frac {3 {\ sigma} _0} {s} $$ (5)

Procedimiento de ensayo

Todo el procedimiento del ensayo constaba de tres pasos principales:(1) recopilación de datos, (2) detección y adquisición de resultados, y (3) visualización y almacenamiento de resultados. Primero, se cargó la tira reactiva en el cartucho y se insertó en el dispositivo. La medición se llevó a cabo simplemente tocando el botón de detección y escribiendo la información del paciente (opcionalmente, se puede ingresar un código anónimo). La información se transmitió a la unidad de microcontrolador (MCU) y se almacenó. Luego, MCU activó el sensor de temperatura y el diodo láser para comenzar la prueba. Mientras tanto, los datos de temperatura recibidos por la MCU se enviaron a la pantalla LCD para su visualización y trazado en tiempo real. Después de la detección, la MCU calculó el valor AUC y representó el resultado en la pantalla.

Resultados y discusión

Caracterización de las nanopartículas

Los espectros UV-Vis de nanoprims conjugados se muestran en la Fig. 2a, lo que indica que el pico máximo está a 1130 nm. La absorbancia de AuNPr a la longitud de onda del láser (1064 nm) es el 92% por ciento de la absorbancia máxima a 1130 nm. Se recolectaron imágenes SEM y TEM (Fig. 2b, c) para visualizar la morfología de las nanopartículas, lo que confirma la mayoría de formas triangulares.

Caracterización de los nanoprims de oro. un Espectros UV-Vis de las nanopartículas. Imágenes representativas de las nanopartículas no conjugadas visualizadas por b SEM y c TEM

Optimización de las condiciones de medición en el dispositivo

En la detección térmica, el tiempo de detección y la distancia desde el diodo láser a la línea de prueba son los principales factores que influyen en la respuesta de la señal [27, 28]. Los dos factores se estudiaron para optimizar las condiciones de medición. Para la optimización del tiempo de irradiación, irradiamos las tiras durante 10 min y registramos los cambios de temperatura por ambos sensores respectivamente. Como puede verse en la Fig. 3a, la temperatura continuó aumentando en 10 min, pero el aumento de temperatura comenzó a alcanzar una meseta después de 120 s. Este resultado coincide con investigaciones anteriores en las que se observó una tendencia similar en los cambios de la señal térmica con el tiempo [28]. Teniendo en cuenta los requisitos de POCT y el consumo de energía, el tiempo de detección del dispositivo se estableció en 120 s.

Optimización de la detección térmica. un Cambios de temperatura en 10 min de irradiación. b Señal térmica a diferentes distancias de irradiación

Luego se realizó la optimización de la distancia. La Figura 3b mostró que la señal térmica disminuyó con el aumento de la distancia entre el diodo láser y la línea de prueba. La razón puede ser que la potencia del láser que llega a la línea de prueba se atenúa a medida que la distancia aumenta el área irradiada efectiva. Para obtener la máxima respuesta de señal, la distancia se estableció en 7 mm.

El efecto de la temperatura ambiente en la detección térmica

Dado que la detección térmica está estrechamente relacionada con la temperatura, fue necesario investigar cómo la temperatura ambiente influye en la detección térmica. La temperatura ambiente se varió entre 27,5 y 40 ° C usando una incubadora. Se midieron un total de 4 muestras en cada punto de temperatura con un intervalo de 2,5 ° C. Se midieron las curvas de temperatura ambiente frente a la señal térmica para las tiras en blanco y 1 DO / mL respectivamente mediante ambos métodos de detección térmica. Los parámetros de la curva de ajuste de la temperatura ambiente se muestran en la Tabla 1. La Figura 4a muestra que en el modo de conducción, las pendientes de la curva fueron generalmente consistentes para diferentes concentraciones, lo que indica que los cambios en la temperatura ambiente tuvieron el mismo efecto en diferentes concentraciones. Como resultado, la curva de efecto ambiental se puede utilizar para calibrar resultados cuantitativos. En el modo de radiación, las pendientes de las curvas (Fig. 4b) correspondientes a las dos concentraciones fueron consistentes entre sí, pero ambas curvas mostraron una tendencia a la baja. Los resultados sugieren que el modo de conducción es más confiable cuando se miden muestras en condiciones con una alta variabilidad de temperatura.

Efecto de la temperatura ambiente. un La señal térmica cambia con la temperatura ambiente en modo de conducción. b La señal térmica cambia con la temperatura ambiente en modo de radiación

Cuantificación de las nanopartículas

Detección de detección térmica

Para obtener las curvas de cuantificación estándar, los dos métodos de detección térmica (archivo adicional 1:Figura S5) se utilizaron respectivamente para detectar tiras reactivas que contienen nanopartículas en el rango de 0 a 10 OD / mL. Esas tiras (Archivo adicional 1:Figura S6a) que contienen diferentes concentraciones de nanopartículas fueron detectadas por el dispositivo portátil mencionado (consulte la sección “Materiales y métodos”). La configuración de ambos sensores en el dispositivo se presenta en el archivo adicional 1:Figura S5a y S5b. Se analizaron cuatro muestras para cada concentración a una temperatura ambiente de 27,5 ° C. El dispositivo aplicó el método AUC para calcular la señal térmica en la línea de prueba. Por lo tanto, la cuantificación de la señal térmica fue proporcional a la cantidad de nanopartículas en la línea de prueba. Las curvas de cuantificación (Fig. 5a) se generaron por regresión lineal de los datos obtenidos de la señal térmica frente a la concentración de las nanopartículas y están representadas por las fórmulas de la Tabla 2.

Cuantificación de nanopartículas. un Curvas de cuantificación estándar en tres métodos. b Resultados cuantitativos en baja concentración con curvas lineales

La Tabla 2 muestra que la sensibilidad del modo de radiación fue 15 veces mayor que la del modo de conducción. El LOD de los modos de conducción y radiación fueron 0.053 OD / mL y 0.023 OD / mL respectivamente. En la detección térmica, el modo de radiación mejoró el límite de detección (LOD) en 2 veces en comparación con el modo de conducción. La estabilidad de las tiras de LFA también se probó como se muestra en el archivo adicional 1:Figura S7. El modo de detección térmica conductiva requiere la transferencia de calor entre dos sólidos. Cuando la temperatura de la línea de prueba aumentó rápidamente, el sensor necesita tiempo (tiempo de relajación) para alcanzar la misma temperatura que la línea de prueba. Como resultado, la temperatura del sensor fue más baja que la temperatura real en la línea de prueba al final de la detección. Por otro lado, el modo de radiación no requirió una transferencia de calor al sensor, ya que el sensor detectó directamente la onda IR irradiada por la línea de prueba para obtener su temperatura actual. En el modo de detección por conducción, parte del calor se disipaba por la presencia de buenos conductores térmicos que funcionaban como disipador de calor, mientras que en la detección de radiación, solo el aire y la propia tira intervenían en la disipación del calor. Estas razones pueden explicar que la sensibilidad del método de conducción sea menor que la del método de radiación.

Al probar tiras con una concentración de 10 DO / mL, encontramos que había una marca de ardor usando el modo de detección de radiación (sin contacto). One possible reason for this phenomenon is that in the non-contact measurement, the low thermal conductivity of the air allows the heat to be retained in the test line and dissipate less efficiently, increasing the effective local temperature and eventually causing the combustion of the membrane.

In the contact mode of detection, however, the sensor with a large thermal conductivity acted as medium and heatsink. In this way, heat was conducted to the sensor so that no combustion occurred in the test line.

Comparison Between Thermal Sensing and Visual Detection

Due to its popularity for portable devices and wide use, we compared the thermal sensing with visual detection for its detection ability. For visual detection, the pictures of the strip were taken by a conventional microscope digital camera. The test strips were mounted in the cartridge to ensure the positional consistency of the image analysis in a similar fashion than with the thermal sensing. Software Image J was used to analyze the grey value in the test line for different concentrations of nanoparticles. A standard curve (Fig. 5a) of the visual detection method was plotted based on the results of this analysis. The linear range between the grey value and the concentration of nanoparticles was 0.2–10 OD/mL (R ² was 0.770 for the range of 0–0.2 OD/mL, so they were thus discarded from further analysis). The detection limit was 0.268 OD/mL. The results indicated that thermal sensing could reduce LOD by 5- to 12-fold compared to visual detection. In Qin’s research, they found that the LOD for visual analysis was 100-fold higher than thermal contrast [21]. Since they employed a high laser power and an infrared camera, they gained greater difference in LOD. One reasonable explanation for the LOD improvement is that thermal sensing is able to measure the nanoparticles on top and beneath the membrane surface. Another advantage of thermal sensing is that it has a higher stability than visual detection. Thermal sensing generates heat by the nanoparticles on the entire test line. Visual detection relies only on the color reaction of the nanoparticles on the surface of the test line. Even if the analyte concentrations of two test strips are the same, the distribution of the nanoparticles on the T-line in the tangent plane is different; thus, the visual inspection will result in a difference in the detection results while the thermal sensing is more stable and reproducible. On the contrary, the sensitivity of the visual detection was 2-fold higher than thermal sensing. Visual detection is a direct method for quantifying nanoparticles, while thermal sensing is an indirect measurement of the concentration of the nanoparticles by measuring the temperature changes, which may partially explain the lack of sensitivity. Figure 5b demonstrates that the linear range of detection for thermal sensing can be as low as 0 OD/mL, with the R ² of 0.972 (conduction) and 0.987 (radiation), suggesting that thermal sensing has a better potential for its applications in early detection in POCT than color quantification, since the target analytes are in lower concentrations.

Quantitative Detection of HCG

Finally, the biomarker HCG was quantified using our system in order to validate the thermal sensing. Both conduction and radiation modes were applied to quantify the HCG. The optical power was turned down to 150 mW, preventing the strips from burning. Strips (Additional file 1:Figure S6b) with four different concentrations were tested. Figure 6a and b show that the thermal signals were linear to the concentration of HCG from 35 to 700 mUI/mL. When the concentration was extended to the range of 35–7000 mUI/mL, the linearity was between the logarithm of the concentration and the thermal signal as in Fig. 6c, d. In conduction mode, the LOD was 64.2 mIU/mL which is in a similar range than the visual detection. However, the ideal LOD of the radiation mode was 2.8 mIU/mL. The data matched with the quantification of nanoparticles. Compared with other devices that applied photothermal effect (LOD =5.5 mIU/mL) [27], our device in radiation mode reduced the LOD by nearly 2-fold. Those results proved that thermal sensing is an effective way in LFA detection and quantification.

The standard curves of HCG. un A linear curve between the logarithm of the HCG concentration and the thermal signal in radiation mode. b A linear curve between the logarithm of the HCG concentration and the thermal signal conduction mode. c The quantification results of HCG in radiation mode. d The quantification results of HCG in conduction mode

Conclusiones

A plasmonic thermal sensing method for LFA detection was established. A portable device based on this method was developed by applying different temperature sensors (conduction and radiation modes). The study of the influence of the ambient temperature demonstrated that it has a negative impact on the thermal sensing and conduction mode was less affected than radiation mode. In radiation mode, the impact was more significant at high concentrations. Both modes were also tested to compare the quantification ability. When compared with the traditional visual detection, the thermal sensing methods showed a 5- to 12-fold improvement in LOD for nanoparticle quantification. The radiation mode showed a better performance than conduction mode in both sensitivity and LOD. In the validation of thermal sensing, LFA strips for the detection of HCG were tested and the results demonstrated that the radiation mode was much more sensitive than the conduction mode. In this way, we proved that thermal sensing is a feasible and effective way for early detection in LFA platforms.

In conclusion, plasmonic thermal sensing can truly improve the analytical sensitivity and shows a promising future in LFA detection for early diagnostic applications. The portable device described herein provided two sensing approaches to satisfy different requirements.

Disponibilidad de datos y materiales

Los conjuntos de datos utilizados y / o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

Abreviaturas

AUC:: Area under the curve
AuNPrs:: Gold nanoprisms
BSA:: Albúmina de suero bovino
CCD:: Dispositivo de carga acoplada
CMOS:: Complementary metal oxide semiconductor
HCG:: Human chorionic gonadotropin
LFA:: Lateral flow assay
LOD:: Límite de detección
LSPR:: Resonancia de plasmón de superficie localizada
MCU:: Microcontroller unit
MES:: 4-Morpholineethanesulfonic acid
NIR:: Infrarrojo cercano
PBS:: Solución salina tamponada con fosfato
POCT:: Pruebas en el lugar de atención
PVC:: Polyvinyl chloride
PVP:: Poly-vinyl-pyrrolidone
S-NHS:: N -Hydroxysulfosuccinimide

Efecto del calentamiento Joule sobre la característica de conmutación resistiva en células AlOx producidas por la formación de oxidación térmica Matriz de nanopuntos de gran área y con patrones de electrólisis de película ITO para espectroscopia Raman mejorada en la superficie

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Materiales poliméricos

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