Dispositivo microfluídico fabricado directamente sobre electrodos serigrafiados para detección electroquímica ultrasensible de PSA

Materiales y métodos

Materiales y reactivos químicos

El antígeno prostático específico (PSA) y el anticuerpo multiclonal anti-PSA peroxidasa de rábano picante (HRP) se adquirieron de Petsec Energy Ltd. Anticuerpo anti-PSA biotinilado, perlas magnéticas de estreptavidina, albúmina de suero bovino e hidroquinona fueron de Fisher Scientific. Tween-20, peróxido de hidrógeno (H ₂ O ₂ ; 30%) y el ácido ferrocenocarboxílico eran de Sigma-Aldrich. SU-8 2075 era de MicroChem Corp. El prepolímero de polidimetilsiloxano (PDMS) y el agente de curado se adquirieron de Dow Corning. Todos los inmunorreactivos se disolvieron en soluciones tampón de PBS 1 x pH 7,4 de KD Medical Solutions. Todos los reactivos químicos se prepararon con agua ultrapura de un sistema de purificación de agua Millipore Milli-Q.

Instrumentación

El microscopio de fluorescencia se realizó en una Olympus U-CMAD3 (Olympus, Japón). Los dispositivos μCSPE se fabricaron con un limpiador de plasma PDC-32G (Harrick Plasma, EE. UU.). Todas las mediciones electroquímicas fueron realizadas por CHI 760B (CHI, China) con un sistema convencional de tres electrodos, que consta de dos electrodos de oro impresos como electrodo de trabajo y contraelectrodo, respectivamente, y un electrodo de plata impreso como electrodo de pseudo-referencia (Fig.1 ).

Fabricación de chips microfluídicos

Los canales de microfluidos de PDMS se modelaron usando fotolitografía estándar. Brevemente, una oblea de silicio, enjuagada con una solución mixta (H ₂ SO ₄ / H ₂ O ₂ =7/3) seguido de limpieza con agua ultrapura, se revistió con fotorresistente SU-8 2075. A continuación, se horneó la oblea a 65 ° C durante 7 min, seguido de 95 ° C durante 40 min para eliminar los disolventes y se fotoexpuso a la luz ultravioleta durante 15 sa través de una fotomáscara. Todo el sistema se horneó a 65 ° C durante 5 min seguido de 95 ° C durante 15 min para estabilizar la polimerización. El fotorresistente no polimerizado se eliminó sumergiendo la oblea de silicio en revelador SU-8 y lavando con isopropanol y agua desionizada. Las mezclas de solución de prepolímero PDMS y agente de curado (10,1) se vertieron sobre la oblea de silicio descrita anteriormente, se curaron a 65 ° C durante 2 horas y se despegaron [17].

El electrodo impreso disponible comercialmente se revistió con una capa de vidrio usando el enfoque de sol-gel. Brevemente, se mezclaron completamente tetraetoxisilano (TEOS), MTES, etanol y agua en una proporción de 1:1:1:1 y se sonicaron durante 5 min. Las mezclas se colocaron en un horno a 65 ° C durante la noche. El electrodo se colocó en una placa caliente durante 5 min a 80 ° C antes del recubrimiento de vidrio y luego se untó con las mezclas precursoras usando un cepillo para evitar que las mezclas invadan la superficie del electrodo. El electrodo se secó a temperatura ambiente después del frotamiento. El chip PDMS y el electrodo recubierto de vidrio se procesaron luego con O ₂ plasma durante 30 sy se adhirieron entre sí.

Experimentos cronoamperozmétricos

Se llevaron a cabo experimentos cronoamperométricos en 1 × pH 7,4 PBS que contenía soluciones de hidroquinona 4,5 mM y peróxido de hidrógeno 0,1 mM a un potencial de paso de - 2,0 mV (frente a un electrodo de pseudo-referencia de plata) y se generó la curva de calibración para la concentración de PSA a partir de 0 a 10 ng mL ⁻¹ . Brevemente, inyectamos 50 μL de 0,2 mg mL ⁻¹ Anticuerpo anti-PSA conjugado con perlas magnéticas para dispositivos μCSPE a una velocidad de 50 μL min ⁻¹ y se lavó a fondo con 100 μL de pH 7,4 PBS a una velocidad de 50 μL min ⁻¹ . Además, 50 μL de un búfer de bloqueo (0,05% ( v / v ) Tween-20 y 2% ( w / v ) se inyectó albúmina de suero bovino (BSA) en PBS) a una velocidad de 10 μL min ⁻¹ y se incubó durante 30 min a 37 ° C, se lavó minuciosamente con 100 μL de PBS pH 7,4 a una velocidad de 50 μL min ⁻¹ . Luego, se inyectaron 50 μL de diferentes concentraciones de PSA a una velocidad de 10 μL min ⁻¹ con incubación durante 30 min a 37 ° C y se lavó minuciosamente con 100 μL de PBS pH 7,4 a una velocidad de 50 μL min ⁻¹ . Además, se inyectaron 50 μL de anticuerpo anti-PSA conjugado con HRP (dilución 1:1000) a una velocidad de 10 μL min ⁻¹ , se incubó durante 30 min a 37 ° C y se lavó minuciosamente con 100 μL de PBS pH 7,4 a una velocidad de 50 μL min ⁻¹ . Finalmente, inyectamos 50 μL de 1 × pH 7,4 PBS que contenían soluciones de hidroquinona 4,5 mM y peróxido de hidrógeno 0,1 mM a una velocidad de 50 μL min ⁻¹ . Una vez que la corriente máxima es estable, promediamos las tres mediciones de corriente y calculamos la desviación estándar correspondiente. Finalmente, se implementó una cronoamperometría al potencial constante de 4 mV, en ocho repeticiones para cada grupo. Para asegurar que el CASPE-MFD esté en las mejores condiciones siempre durante el experimento electroquímico, el electrodo de CASPE-MFD se activó primero escaneando dentro del rango de potencial de 0.5 a 1.5 V durante 10 ciclos en 0.5 MH _{2 SO 4 soluciones que utilizan voltamperometría cíclica. Se presentó el voltamograma típico característico del oro policristalino limpio. Luego, el CASPE-MFD se lavó con agua ultrapura y soluciones de PBS.}

Resultados y discusión

Preparación de CASPE-MFD

Se utilizó una distribución homogénea para investigar la utilidad del CASPE-MFD. Se inyectó una solución de microperlas fluorescentes en los canales de un CASPE-MFD a una velocidad de flujo de 5 μL / min, y es obvio que cada esquina del CASPE-MFD se llenó con la solución de microperlas fluorescentes y no se formó ninguna burbuja. en el dispositivo (Fig. 2). El caudal se aumentó a 100 μL / min para demostrar la solidez del CASPE-MFD, que demostró que el dispositivo es adecuado para la detección de analitos.

un Fotoelectrodo serigrafiado utilizado para tomar imágenes de fluorescencia. b Imagen de fluorescencia de CASPE-MFD. Usamos un fotoelectrodo como imagen de fluorescencia modelo para demostrar que el área de trabajo está llena de tintes y no tiene burbujas en el CASPE-MFD. c Dibujo parcial ampliado de la imagen de fluorescencia

El proceso de fabricación también se investigó mediante voltamogramas cíclicos como se muestra en la Fig. 3. Se usó ácido ferrocenocarboxílico como el compuesto activo redox modelo, y la Fig. 3a muestra la relación de las corrientes pico redox con diferentes velocidades de exploración potenciales. El pico redox de las curvas CV exhibe una reacción electroquímica reversible típica en la que la velocidad de reacción está gobernada por la difusión de las especies electroactivas a la superficie del electrodo. La separación potencial entre el potencial catódico máximo ( E _pc ) y potencial anódico máximo ( E _pa ) es 62 mV, que está cerca del valor teórico de 59 mV para el par redox de ferroceno. Además, la posición de los potenciales máximos no se altera en función de las velocidades de exploración potenciales y la corriente máxima anódica ( i _pa ) es aproximadamente igual a la corriente pico catódica ( i _pc ) en el rango de 10 a 350 mV / s. El comportamiento reversible se corresponde con la señal en solución a granel (archivo adicional 1:Fig. S1A), lo que indica que no se producen reacciones secundarias y que, como se esperaba, la cinética de la transferencia de electrones es lo suficientemente rápida para mantener las concentraciones superficiales de redox. -especies activas a los valores requeridos por la ecuación de Nernst. La Figura 3b muestra que tanto la corriente máxima anódica ( i _pa ) y pico de corriente catódica ( i _pc ) eran proporcionales a la raíz cuadrada de las velocidades de exploración, lo que implica un proceso típico de difusión controlada [18]. Además, la corriente medida en CASPE-MFD está bastante cerca del valor de la corriente en solución a granel (archivo adicional 1:Fig. S1B), lo que indica que un análisis en el dispositivo no sacrifica su sensibilidad.

un Voltamogramas cíclicos de ácido ferroceno carboxílico 0,5 mM en solución acuosa de KCl 0,1 M (pH 7,0) en CASPE-MFD a diferentes velocidades de exploración (ascendente a lo largo de la y -eje):10, 25, 50, 80, 100, 150, 200, 250, 300 y 350 mV / s. b Gráficos de calibración del anódico ( i _pa ) y pico de corriente catódica ( i _pc ) frente a la tasa de exploración cuadrada. Las dos líneas representan una curva lineal con ecuación de regresión, respectivamente: Y ( yo _pa ) =0,9932 X - 0,2563 ( R ² =0,9996, n =8); Y ( yo _pc ) =- 0,9384 X - 0.1774 ( R ² =0,9996, n =8)

Rendimiento de CASPE-MFD en la detección de PSA

Informes recientes han indicado que la concentración de antígeno prostático específico (PSA) en el rango de 4 a 10 ng / ml generalmente indica una alta probabilidad de la presencia de carcinoma de próstata [19]. Por lo tanto, se eligió el PSA como objetivo para evaluar el desempeño del CASPE-MFD preparado (Fig. 4). La Figura 4a muestra que el CASPE-MFD preparado se puede conectar directamente a una estación de trabajo electroquímica portátil. Como se muestra en la Fig. 4c, el anticuerpo anti-PSA conjugado con perlas magnéticas se inmovilizó sobre la superficie del electrodo de oro (electrodo de trabajo) usando un imán. A continuación, se inyectó antígeno de PSA en los canales de microfluidos del CASPE-MFD preparado y se conjugó con el anticuerpo anti-PSA que se inmovilizó en el electrodo de trabajo. A continuación, el anticuerpo anti-PSA modificado con HRP se conjugó con el antígeno de PSA. Se utilizó cronoamperometría para detectar las señales electroquímicas que producían la hidroquinona y el peróxido de hidrógeno.

un Todo el dispositivo de detección. La bomba de jeringa se utilizó para inyectar la solución en el CASPE-MFD y la estación de trabajo electroquímica se utilizó para detectar las señales electroquímicas. b El CASPE-MFD utilizado para detectar PSA. Se inyectó un anticuerpo anti-PSA conjugado con perlas inmunomagnéticas con soluciones a través de la entrada y se usó un imán para capturar las perlas magnéticas. c Esquema del CASPE-MFD en la detección del antígeno PSA. El anticuerpo anti-PSA conjugado con perlas inmunomagnéticas se inmovilizó en el electrodo de trabajo usando un imán. Se inyectó antígeno de PSA en el CASPE-MFD y se conjugó con el anticuerpo anti-PSA. A continuación, se conjugó el anticuerpo anti-PSA modificado con HRP con el antígeno de PSA. Se utilizó cronoamperometría para detectar las señales electroquímicas que producían la hidroquinona y el peróxido de hidrógeno

La cronoamperometría proporciona una mejor relación señal-ruido en comparación con otras técnicas amperométricas [20,21,22,23,24], y el uso de una placa delgada de fluidos sujeta mecánicamente a los electrodos es más resistente a la vibración que el análisis en un mayor volumen de solución. Para corrientes limitadas por difusión faradaica, la respuesta en tiempo de corriente se describe mediante la ecuación de Cottrell.

$$ i =\ frac {nFA {D} ^ {\ frac {1} {2}} C} {{\ left (\ pi t \ right)} ^ {\ frac {1} {2}}} $$

donde n es el número de electrones, F es la constante de Faraday (96 485 C / mol), A es el área del electrodo (cm ² ), D es el coeficiente de difusión (cm ² / s) y C es la concentración (mol / cm ³ ).

El CASPE-MFD preparado se utilizó para detectar PSA en una serie de soluciones de analito, concentración de 0 a 10 ng mL ⁻¹ . Las respuestas cronoamperométricas de la detección de PSA en CASPE-MFD se muestran en la Fig. 5a. Las corrientes máximas aumentaron al aumentar la concentración de PSA en PBS de pH 7,4 que contenía hidroquinona 4,5 mM y peróxido de hidrógeno 0,1 mM. Como se muestra en la Fig. 5b (línea azul), las corrientes pico fueron proporcionales al valor logarítmico de las concentraciones de PSA en el rango de 0.001 a 10 ng / mL y la ecuación de regresión lineal es I (μA) =14,87 + 3,927 × log C _PSA (ng / ml) ( R ² =0,9985, n =8). El límite bajo de detección (0,84 pg / mL) y la buena relación lineal sugirieron que el CASPE-MFD preparado podría usarse para detectar PSA en uso práctico. Además, también detectamos diferentes concentraciones de PSA en CASPE-MFD usando voltamperometría de onda cuadrada (SWV) en la Fig. 5c. Las respuestas de SWV también fueron consistentes con los resultados cronoamperométricos.

un Curvas cronoamperométricas para diversas concentraciones de antígeno PSA (ascendente a lo largo de la y -eje):0, 0,001, 0,01, 0,1, 1 y 10 ng / ml en tampón PBS de pH 7,4 que contiene hidroquinona 4,5 mM y H ₂ 0,1 mM O ₂ solución en CASPE-MFD a - 2,0 mV frente a electrodo de pseudo-referencia de plata. b La relación lineal entre la corriente máxima y la concentración de antígeno de PSA en los CASPE-MFD en tampón PBS de pH 7,4 (línea azul) y en suero humano (línea roja). La ecuación de regresión lineal de la línea azul es Y =14,87 + 3,927 × X ( R ² =0,9985, n =8), y la ecuación de regresión lineal de la línea roja es Y =14,15 + 3,622 × X ( R ² =0,9986, n =8). c Voltamogramas de onda cuadrada para diversas concentraciones de antígeno PSA en tampón PBS de pH 7,4 que contiene hidroquinona 4,5 mM y H ₂ 0,1 mM O ₂ solución en CASPE-MFD (ascendente a lo largo de la y -eje):0, 0.001, 0.01, 0.1, 1 y 10 ng / mL, respectivamente. d La correspondiente relación lineal de diferentes concentraciones de antígeno PSA. La ecuación de regresión lineal es Y =34,53 + 9,246 × X ( R ² =0,9884, n =8)

Detección selectiva de PSA con CASPE-MFD

Para verificar la posible aplicación en nuestro dispositivo para muestras reales, analizamos diversas concentraciones de PSA en muestras de suero humano mediante cronoamperometría. Los resultados obtenidos en el archivo adicional 1:Fig. S2 demostraron que las corrientes máximas del PSA también aumentaron con el aumento de la concentración de PSA en el suero humano que contiene 4,5 mM de hidroquinona y 0,1 mM de peróxido de hidrógeno. Además, la curva de calibración correspondiente se mostró en la Fig. 5b (línea roja), y la ecuación de regresión lineal es I (μA) =14,15 + 3,622 × log C _PSA (ng / ml) ( R ² =0,9986, n =8). Es obvio que casi no hubo diferencias estadísticas entre los dos grupos, lo que indica que el CASPE-MFD preparado pudo funcionar en muestras reales. Además, se demostró que el CASPE-MFD tiene una gran selectividad para dirigirse al PSA y podría usarse en aplicaciones clínicas para diagnosticar el carcinoma de próstata.

Conclusiones

Hemos desarrollado una detección electroquímica de microfluidos basada en electrodos serigrafiados comercial simple, de bajo costo y portátil. Además, hemos demostrado la aplicación de nuestros CASPE-MFD para el análisis cuantitativo de PSA en tampón PBS y en muestras de suero humano. La medición mostró una buena sensibilidad y reproducibilidad debido a que el dispositivo se fabricó directamente sobre los electrodos impresos con serigrafía comerciales. Los CASPE-MFD tienen cinco ventajas:(i) es liviano, portátil y multiusos; (ii) está estandarizado; (iii) tiene una excelente reproducibilidad con alta sensibilidad y precisión; (iv) es fácil de usar y no requiere personal médico profesional ni instrumentos complicados; y (v) permite la integración de sistemas de detección de alta densidad en un pequeño dispositivo. Además, el uso de un potenciostato miniaturizado podría hacer que los CASPE-MFD sean capaces de realizar diagnósticos en el campo o en el hogar. Además, los electrodos comerciales y la fácil fabricación podrían lograr la estandarización e industrialización de los CASPE-MFD. Por lo tanto, creemos que esta plataforma será ampliamente utilizada para el diagnóstico en el punto de atención como moléculas pequeñas (sodio, potasio, cloruro, glucosa), marcadores de cáncer (péptido natriurético tipo B o BNP, troponina I), células (CD ₄ ) y ácidos nucleicos (ADN, ARN).

Abreviaturas

MFD:

Dispositivos de microfluidos

CASPE-MFD:

Dispositivos de microfluidos basados ​​en electrodos serigrafiados

PDMS:

Polidimetilsiloxano

Anuncio de servicio público:

Antígeno prostático específico

CA:

Cronoamperometría

SWV:

Voltamperometría de onda cuadrada

LOD:

Límite de detección

HRP:

Peroxidasa de rábano picante

TEOS:

Tetraetoxisilano

MTES:

Espectroscopía de emisión de transferencia metaestable

BNP:

Péptido natriurético de tipo B

Autopolarización de película de PVDF activada por tratamiento hidrófilo para sensor piroeléctrico con ruido piezoeléctrico ultrabajo Diseño fotónico y evaluación eléctrica de células solares de doble función para aplicaciones de visualización y conversión de energía