Deposición de nanopartículas de conversión ascendente modificadas con anticuerpos sobre vidrio mediante un método asistido por láser para mejorar el rendimiento del cultivo celular

Métodos / Experimental

Materiales

Nitrato de gadolinio (III) hexahidrato (Gd (NO ₃ ) ₃ · 6H ₂ O, cristales y grumos, 99,9% a base de trazas de metales), nitrato de iterbio (III) pentahidratado (Yb (NO ₃ ) ₃ · 5H ₂ O, 99,9% en base a metales traza), nitrato de erbio (III) pentahidratado (Er (NO ₃ ) ₃ · 5H ₂ O, 99,9% base de metales traza), fluoruro de sodio (NaF, BioReagent, adecuado para cultivo de células de insectos, ≥ 99%), polietilenimina ramificada (PEI, promedio Mw ~ 800 por LS, promedio Mn ~ 600 por GPC), antihumano Se adquirieron IgG (específico de Fab):anticuerpo FITC producido en cabra (anticuerpo aislado por afinidad, solución acuosa tamponada), dihidrocloruro de 4 ′, 6-diamidina-2′-fenilindol (DAPI) e isotiocianato de faloidina-tetrametilrodamina B (faloidina-TRITC) de Sigma-Aldrich. Se adquirió etilenglicol (EG) de Fisher Chemical. El isopropanol (2-propanol) se adquirió de los productos químicos de laboratorio de Caledon.

Síntesis de UCNP con y sin IgG mediante el uso de un proceso de un solo recipiente

Los UCNP (NaGdF ₄ :Yb ³⁺ , Er ³⁺ ) se sintetizaron mediante un método de un solo recipiente modificado [36]. Brevemente, 720 mg de Gd (NO ₃ ) ₃ · 6H ₂ O, 170 mg de Er (NO ₃ ) ₃ · 5H ₂ O, 160 mg de Yb (NO ₃ ) ₃ · 5H ₂ Se añadieron O y 20 ml de etilenglicol a un matraz de tres bocas. Luego, se añadieron suavemente al matraz 0,7 g de PEI. Luego, se añadieron gota a gota al matraz 336 mg de NaF disueltos en 10 ml de etilenglicol. La mezcla se calentó a 200 ° C y se mantuvo a reflujo durante 6 h en protección de nitrógeno. Los productos de reacción se recogieron por centrifugación y se lavaron varias veces con etanol / agua destilada. El producto se secó a 60 ° C.

Los anticuerpos IgG se modificaron en la superficie de UCNP mediante enlaces amida. Como se muestra en la Fig. 1, se disolvieron 15 mg de UCNP en polvo en 15 ml de agua destilada. Luego, se agregaron a la solución 5 ml de solución salina tamponada con borato (BBS, pH =8) y 20 μg de IgG. La solución se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. El producto se lavó y se recogió mediante centrifugación.

Esquema del método de un solo recipiente para producir UCNP y UCNP-IgG

Deposición de UCNP con / sin IgG por MAPLE

El proceso de deposición láser se realizó con un equipo MAPLE 2000 (proyecto 206, PVD Products, Inc., EE. UU.) Afiliado a un láser Nd:YAG de 532 nm. El proceso de deposición se muestra en la Fig. 2. Las nanopartículas diana se disolvieron en isopropanol con una concentración del 1% en peso. La mezcla se congeló en el soporte de diana enfriado con nitrógeno líquido. En este proceso no se utilizaron otros aditivos ni tensioactivos adicionales.

Esquema de la deposición de UCNP y UCNP-IgG mediante el uso de la técnica MAPLE

Además, se aplicó un láser Nd:YAG de 532 nm con una frecuencia de láser a 10 Hz y el τ _fwhm ≅ 200 μs. El tamaño del área del punto láser era de 0,63 cm ² y la fluencia del láser fue de 150 mJ / cm ² . Los sustratos de vidrio se trataron con una solución de gelatina al 2% en peso que se fijó en el soporte del sustrato y la temperatura de los sustratos fue de 25 ° C durante todo el proceso del experimento. El proceso de deposición láser se realizó bajo 1 × 10 ⁻⁶ Torr. Según nuestros estudios anteriores [42, 43], el tiempo de deposición se fijó en 2 h. La distancia entre el sustrato y el objetivo fue de 4,5 cm (configuración vertical). El soporte del objetivo y el soporte del sustrato estaban girando (objetivo:10 rpm, sustrato:25 rpm) durante el período de irradiación láser.

Caracterizaciones de materiales

Las UCNP y UCNP-IgG antes de la deposición de MAPLE se caracterizaron mediante microscopio electrónico de transmisión (TEM, Philips CM-10, operando a 80 kV). Los espectros infrarrojos de transformada de Fourier (FTIR) de UCNP y UCNP-IgG se obtuvieron mediante un espectrómetro Bruker Vector 22 FTIR (rango de escaneo 600 cm ⁻¹ ~ 4500 cm ⁻¹ , resolución 4 cm ⁻¹ , 64 exploraciones). Las propiedades de fotoluminiscencia de los UCNP se estudiaron usando el espectrofluorómetro QuantaMaster ™ 40 (Horiba Canada — Photon Technology International Inc.). El crecimiento de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) en la superficie del vidrio con / sin las deposiciones de nanopartículas se investigó mediante un microscopio confocal (Microscopio Zeiss LSM 5 Duo Vario). Se aplicó el microscopio electrónico de barrido Hitachi S-3400 N conectado con el sistema INCA PentaFET-x3 EDX (Oxford Instruments) para realizar la espectroscopia de rayos X de dispersión de energía (EDX).

Estudio sobre comportamientos celulares

Se aplicaron células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC, American Type Culture Collection) para estudiar la biocompatibilidad de UCNP con / sin modificación de IgG después del tratamiento de deposición con láser. Se sembraron HUVEC en la superficie del vidrio depositada con UCNP y UCNP-IgG. El sustrato de vidrio tratado con una solución de gelatina al 2% en peso (sin UCNP) se usa como control después del tratamiento de deposición de MAPLE. Las muestras depositadas se empaparon en medio MCDB (suero bovino fetal al 10%, penicilina al 1% y anfotericina B) para la siembra de HUVEC. Las HUVEC se cultivaron a 37 ° C durante 24 h. Las HUVEC se fijaron en la superficie de los sustratos con formalina al 4% durante 2 h para obtener la imagen confocal (Zeiss LSM 510 Duo). Las células se tiñeron con Phalloidin-TRITC y DAPI. Las muestras se lavaron con PBS (pH 7,4) y se trataron con el agente anti-decoloración.

Estudio sobre citotoxicidad

Las HUVEC se cultivaron en medio MCDB (suero bovino fetal al 10%, penicilina al 1% y anfotericina B) sobre la superficie de las muestras depositadas. Después de transferirlas a placas de cultivo, las células se cultivaron durante 24 h (37 ° C, 5% CO ₂ ) en la superficie de las muestras. Aproximadamente 100.000 células se sembraron en la superficie de cada muestra (con / sin deposición de UNCP). Todas las muestras, incluido el control, los sustratos de vidrio con la deposición de UCNP y UCNP-IgG, se midieron por triplicado. Luego se añadió el agente MTT (bromuro de 3- (4, 5-dimetil tiazolil-2) -2, 5-difenil tetrazolio) al medio celular y las células se incubaron durante 3 h. Se eliminó el medio celular y se enjuagaron los pocillos dos veces con PBS. Luego se añadió DMSO a cada pocillo para disolver el formazán. El líquido se transfirió a las placas de 96 pocillos y se analizó con el lector biocinético a 490 nm (lector de microplacas Bio-Tek Instruments EL340I).

Resultados y discusión

Caracterización de UCNP / UCNP-IgG antes de la deposición de MAPLE

Los anticuerpos IgG se conjugaron en UCNP modificadas con amina a través de enlaces amida. Las UCNP con / sin IgG se caracterizaron por TEM. La Figura 3a es la micrografía TEM de UCNP cúbicos. El tamaño medio de los UCNP se estima en 50 ± 8 nm. El pequeño recuadro de la Fig. 3a es la micrografía de TEM de alta resolución (HRTEM). Los UCNP tienen estructuras muy cristalinas. La distancia interplanar medida entre dos planos de celosía adyacentes fue de 0.312 nm, correspondiente a un plano (1 1 1) de fase cúbica NaGdF ₄ (JCPDS 27-0697). La Figura 3b es la micrografía TEM de UCNP conjugadas con IgG (UCNPs-IgG). Las UCNP modificadas con anticuerpos mantuvieron la forma cúbica y el tamaño medio de partícula es de alrededor de 54 ± 8 nm. Los anticuerpos IgG bioconjugados en UCNP se pueden observar directamente mediante TEM como se muestra en la Fig. 3b, marcado con un círculo rojo. El tamaño de los anticuerpos IgG es de alrededor de 10 ± 5 nm, que es similar al cálculo teórico y las medidas experimentales [44, 45].

Micrografías TEM de a UCNP y b UCNPs-IgG antes de la deposición de MAPLE

La estructura cristalina de UCNP (NaGdF ₄ :Yb ³⁺ , Er ³⁺ ) fue revelado por el patrón de difracción de rayos X en polvo (XRD) como se muestra en la Fig. 4. Cuatro picos a 32 °, 37 °, 54 ° y 65 ° en el perfil de XRD se atribuyen a (111), (200), ( 220) y (311) planos de cristal, que es lo mismo que el patrón XRD estándar de fase cúbica NaGdF ₄ (JCPDS 27-0697) y referencias [36, 37]. Tanto las medidas HRTEM como XRD confirman la estructura cristalina de los UCNP.

Perfil XRD de NaGdF ₄ :Er ³⁺ , Yb ³⁺ nanopartículas de conversión ascendente

Para investigar más a fondo la bioconjugación de IgG en UCNP, se empleó espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR). Como se muestra en la Fig. 5, las bandas de vibración de flexión de los grupos amina se observan a 1515 cm ⁻¹ y 1511 cm ⁻¹ en los espectros de UCNPs y UCNPs-IgG ya que tanto los anticuerpos PEI como los IgG poseen grupos amino. Los picos a 2987 cm ⁻¹ , 2900 cm ⁻¹ y 1400 cm ⁻¹ puede atribuirse a las vibraciones de estiramiento de -CH ₂ - y enlaces C-C, respectivamente. El estiramiento de la banda de vibración del grupo hidroxilo (-OH) se observa a 3673 cm ⁻¹ en el espectro de UCNPs-IgG debido al grupo carboxilo de IgG. El pico a 1249 cm ⁻¹ y 1650 cm ⁻¹ se atribuyen al estiramiento de las bandas de vibración del enlace carbono-oxígeno y del enlace amida, respectivamente, en el espectro de las UCNP modificadas con IgG. Estos picos revelan la presencia de anticuerpos IgG en la superficie de UCNPs-IgG.

Espectros FTIR de UCNPs-IgG y UCNPs, respectivamente, elaborados mediante un proceso de un solo recipiente

Caracterización de UCNP con / sin IgG después de la deposición de MAPLE

Las UCNP y las UCNP-IgG se depositaron mediante el proceso MAPLE en placas de cultivo celular con fondo de vidrio. La superficie del vidrio antes y después de la deposición de UCNP y UCNP-IgG, respectivamente, se caracterizó por espectroscopía de rayos X de dispersión de energía (EDX). La Figura 6 muestra la presencia de elementos de gadolinio (Gd), erbio (Er), iterbio (Yb) y flúor (F) en muestras de vidrio recubiertas con UCNPs (Fig. 6a) y UCNPs-IgG (Fig. 6b), respectivamente. Además, se midió la fotoluminiscencia de UCNP y UCNP-IgG después de la deposición de MAPLE con un tiempo de irradiación más prolongado. Se pueden observar emisiones tanto verdes (540 nm) como rojas (650 nm) bajo la excitación de 980 nm, como se muestra en el archivo adicional 1:Figura S1 en el archivo de respaldo. Se observa que la intensidad de la emisión es ligeramente diferente entre muestras de UCNP con y sin IgG, lo que podría deberse a los defectos de la superficie o al error de medición. Se realizarán más estudios. En consecuencia, la deposición de MAPLE puede mantener la estructura y las propiedades de los UCNP con / sin IgG.

Espectros EDX de a muestras después del tratamiento con MAPLE y b muestras sin tratamiento MAPLE (vidrio desnudo)

Se utilizó FTIR para investigar los recubrimientos UCNPS y UCNPs-IgG fabricados mediante la técnica MAPLE en comparación con la muestra de vidrio desnudo. Los espectros FTIR de las muestras depositadas con UCNPs, UCNPs-IgG por la deposición de MAPLE y la muestra en blanco (sustrato de vidrio desnudo) se muestran en la Fig. 7. Las bandas de vibración de estiramiento de los grupos –OH a 3648 cm ^-1 se atribuye al grupo carboxilo de IgG, que solo se observa en el espectro-1, es decir, el recubrimiento UCNPs-IgG. Este resultado indica la existencia de UCNP-IgG en la superficie de los sustratos. En el espectro 2 (recubrimiento UCNP), la banda de vibración de flexión a 1575 cm ⁻¹ se atribuye al grupo amina modificado en los UCNP, mientras que la banda de vibración de flexión del grupo amina apenas se observa en el espectro-1 (UCNPs-IgG) debido a la bioconjugación exitosa. En consecuencia, la técnica MAPLE es capaz de mantener las propiedades y microestructuras de las UCNP modificadas con anticuerpos.

Espectros FTIR de vidrio desnudo y vidrio recubierto con UCNPs-IgG y UCNPs, respectivamente

En comparación con el espectro del vidrio desnudo (espectro-3), las bandas de vibración de estiramiento de los grupos de metileno son alrededor de 2985 cm ⁻¹ y 2900 cm ⁻¹ tanto en el espectro-1 como en el espectro-2 debido a los grupos funcionales basados ​​en carbono en la superficie de los UCNP. Se observa que los picos de los recubrimientos en la Fig.7 son significativamente más débiles que los picos en la Fig.5 que son causados ​​por las bajas cantidades de nanopartículas depositadas en la superficie del sustrato y los cambios de espectros a 1250 cm ^-1 en la Fig. 7 en comparación con la Fig. 5 proviene del efecto del sustrato de vidrio.

Comportamientos de las células en los diferentes recubrimientos

Los métodos tradicionales para las células HUVEC requieren recubrir una capa de proteína que se utiliza como nuestro control en el estudio del rendimiento del cultivo celular. Por lo tanto, tres recubrimientos diferentes en este estudio son (1) control (vidrio recubierto con gelatina), (2) vidrio recubierto con UCNP y (3) vidrio recubierto con UCNP-IgG. La Figura 8 presenta las micrografías de microscopio confocal de células cultivadas en diferentes superficies durante 24 h. Las cantidades de HUVEC que crecen en la superficie recubierta con UCNP y UCNP-IgG, respectivamente, son similares a las del control. Sin embargo, los comportamientos de las células HUVEC que crecen en las superficies modificadas con UCNPs-IgG mejoran drásticamente en el primer período de cultivo de 24 h. Los comportamientos de crecimiento de las células dentro del período de cultivo incluyeron el área de las células, la longitud de las conexiones, la longitud de las células y el número total de células en la superficie de las muestras se investigaron y analizaron.

Micrografías confocales de HUVEC en la superficie de a control, b UCNP y c UCNP modificadas por IgG

La Figura 9 muestra el análisis estadístico de los comportamientos celulares después de 24 h de cultivo en las tres superficies diferentes. El área de las celdas (Fig. 9a), la longitud de las conexiones (Fig. 9b), la longitud de las celdas (Fig. 9c) y el número de celdas (Fig. 9d) fueron investigados por el software ImageJ. Las longitudes de las celdas se definen como el valor de longitud más grande de esta celda. La longitud de la conexión se define como la distancia entre el borde de las puntas de la célula y los núcleos de la célula. En comparación con el de las células que crecen en la muestra de control, el área celular de las células HUVEC en la superficie modificada con UCNP y UCNP-IgG aumenta un 11,2% y un 22,2%, respectivamente; la longitud de las conexiones de las células HUVEC en la superficie modificadas con UCNPs y UCNPs-IgG aumenta en un 12,5% y un 17,5%; y la longitud de las células HUVEC en la superficie modificada con UCNP y UCNP-IgG aumenta en un 8,2% y un 17,3%. Además, los resultados analizados del número de células muestran que la cantidad de células en la superficie de la muestra basada en UCNPs es aproximadamente un 8% mayor que la del control. Estos resultados indican que tanto las muestras de UCNPs como las de UCNPs-IgG son biocompatibles con las células HUVECs que son consistentes con los trabajos anteriores [38]. El crecimiento de células HUVEC cultivadas en la superficie depositada con UCNP y UCNP-IgG se ha promovido en términos de área celular, longitud celular y longitud de conexión. Estudios anteriores indican que las nanoestructuras podrían desencadenar la activación endotelial de las células HUVEC [2, 3, 4, 39]. Se ha informado que se observaría la liberación de mediadores inflamatorios y la regulación positiva de las moléculas de adhesión de las HUVEC cuando se exponen a una variedad de nanopartículas [40]. Los mediadores inflamatorios podrían promover los efectos de la angiogénesis y proangiogénesis según los estudios anteriores [2, 41]. Además, un trabajo reciente indica que la IgG podría promover la transformación similar a la angiogénesis de las HUVEC [3].

HUVEC cultivadas en diferentes recubrimientos, incluido el control, UCNP, UCNP-IgG: a área de celda, b longitud de la conexión celular, c longitud de celda y d número de celdas

Efecto del recubrimiento de UCNP con / sin IgG sobre la viabilidad celular

La viabilidad celular se estudió utilizando células HUVEC cultivadas en las diferentes superficies. La Figura 10 muestra la viabilidad celular relativa en diferentes superficies:control (vidrio recubierto con gelatina), vidrio desnudo, UCNPs depositados sobre sustratos de vidrio y UCNPs-IgG depositados sobre sustratos de vidrio. La viabilidad celular relativa del vidrio desnudo, el vidrio recubierto con UCNP y el vidrio recubierto con UCNP-IgG fueron del 99,6%, 105,44% y 103,96%, respectivamente. Algunos estudios muestran que la PEI con alta concentración puede tener un efecto tóxico, particularmente cuando se aplica a alta concentración, pero el uso de PEI como ligando es aceptable y muestra una citotoxicidad insignificante [44,45,46,47]. Debido al mecanismo de MAPLE, la cantidad de UCNPs / UCNPs-IgG en la superficie del sustrato es mucho menor que el umbral (1 mg / ml). Claramente, la deposición de UCNPs y UCNPs-IgG en el vidrio por MAPLE no impone efectos tóxicos sobre las células HUVEC. Se observa que los materiales biocompatibles normalmente pueden tener una viabilidad celular relativa (> 85%) de las células. [8]

Viabilidad celular de las células HUVEC que crecen en vidrio desnudo, recubrimientos con UCNP y UCNP-IgG, respectivamente, y vidrio recubierto con gelatina utilizado como control

Conclusiones

En resumen, las UCNP y las UCNP-IgG se sintetizaron con éxito mediante el método de un solo recipiente y se han depositado en placas de cultivo con fondo de vidrio mediante la técnica MAPLE. Los resultados de TEM y FTIR revelan la bioconjugación exitosa de IgG en la superficie de UCNP. El tamaño medio de partícula de los UCNP es de 50 ± 8 nm. Las UCNP modificadas con anticuerpos mantuvieron la forma cúbica y el tamaño medio de partícula es de alrededor de 54 ± 8 nm. La bioconjugación de IgG en UCNP se puede observar directamente mediante TEM, que tiene un tamaño medio de 10 ± 5 nm. Los espectros FTIR también confirmaron la presencia del enlace péptido / grupo carboxilo del anticuerpo modificado en la superficie de las UCNP. El proceso de deposición de MAPLE se utilizó para depositar UCNP y UCNP-IgG sobre sustrato de vidrio. Los resultados de las medidas de EDX, FTIR y PL indican la retención de estructuras y propiedades de UCNP y UCNPS después de la deposición de MAPLE. Nuestro estudio demuestra que el proceso MAPLE puede lograr la retención de las propiedades y estructuras de UCNP con / sin la modificación del anticuerpo. Además, se ha estudiado estadísticamente el rendimiento del cultivo celular mediante el cultivo de la línea celular HUVEC en las diferentes superficies tratadas con UCNPs y UCNPs-IgG, respectivamente, elaboradas mediante el proceso MAPLE. El área de la celda, la longitud de la celda y la longitud de la conexión son muy importantes para apoyar una confluencia ideal y la formación de estructuras de microvasos. Las superficies de vidrio tratadas con UCNP y muestras de UCNP-IgG mediante la técnica MAPLE no muestran ningún efecto tóxico en la línea celular HUVEC. Se espera que la deposición de MAPLE de UCNP y UCNP-IgG se pueda aplicar en la fabricación de los nuevos dispositivos biológicos para la ingeniería de tejidos y la regeneración de tejidos.

Abreviaturas

DAPI:

Dihidrocloruro de 4 ′, 6-diamidina-2′-fenilindol

EG:

Etilenglicol

HUVEC:

Células endoteliales de la vena umbilical humana

IgG:

Inmunoglobulina G

ARCE:

Evaporación láser pulsada asistida por matriz

PEI:

Polietilenimina

Phalloidin-TRITC:

Isotiocianato de faloidina-tetrametilrodamina B

UCNP:

Nanopartículas de conversión ascendente

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