Un nuevo agente de contraste basado en nanopartículas magnéticas para la detección del colesterol como biomarcador de la enfermedad de Alzheimer

Prueba de la hipótesis

Síntesis y caracterización de nanopartículas magnéticas

La síntesis de nanopartículas de óxido de hierro se llevará a cabo mediante un método de coprecipitación controlada, mezclando ión ferroso (Fe2 +) e ión férrico (Fe3 +) en solución alcalina siguiendo el trabajo de Predescu et al. [33]. Las MNP se recubrirán con un caparazón de PEG siguiendo el protocolo previamente establecido por Liu et al. [34].

La estructura, morfología y magnetismo de las nanopartículas de hierro recubiertas con PEG se investigarán mediante difracción de rayos X (XRD), microscopía electrónica de barrido (SEM), microscopía electrónica de transmisión (TEM), espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) y magnetometría con dispositivo de interferencia cuántica superconductora (SQUID).

Después de la caracterización del nanomaterial magnético sintetizado, se funcionalizará con (1) proteína estreptavidina mediante el método NHS / EDC. Después de esto, se acoplará a un anticuerpo anti-CHO biotinilado y (2) proteína transferrina. La conjugación de transferrina se llevará a cabo acoplando el grupo carboxílico presente en la superficie del ligando y el grupo hidroxilo presente en el recubrimiento de PEG [35].

Pruebas in vitro

En un primer paso, se probará la biocompatibilidad de la nanoplataforma in vitro (Fig. 2a). El nanoconjugado se agregará a los cocultivos de neuronas y astrocitos ya los cultivos de células endoteliales [36] para determinar la compatibilidad del nanoconjugado con las células cerebrales típicas. Si la citocompatibilidad de las MNP funcionalizadas es correcta, se probará la eficacia del sistema en un modelo ex vivo de la enfermedad (Fig. 2b). El modelo seleccionado es un ratón transgénico doble APP / (presenilina-1) PS1 que coexpresa cinco mutaciones familiares de AD (5XFAD) y exhibe una patología de placa amiloide similar a la encontrada en AD [37].

La acumulación de CHO alrededor de las placas seniles en el modelo transgénico 5XFAD se evaluará mediante inmunohistoquímica.

Si el modelo es válido, una vez demostrada la acumulación de CHO en las placas seniles, se propone probar la especificidad del nanoconjugado sintetizado. Para ello, primero se obtendrán cortes de cerebro fijos de los ratones transgénicos 5XFAD, y luego se probará en ellos la unión del nanoconjugado, incubando los anti-CHO-MNPs en los cortes de cerebro fijos de ratones 5XFAD. La especificidad del nanoconjugado se determinará, evaluando la colocalización de los anti-CHO-MNPs con los depósitos de CHO y las placas seniles presentes en las secciones cerebrales de 5XFAD, realizando los controles apropiados. En caso de que no se detectaran acumulaciones evidentes de colesterol en 5XFAD, una mutación sueca alternativa en el modelo de ratón de la proteína precursora amiloide (APP _sw ), modelo de ratón de EA, ya que en este modelo se ha descrito una acumulación de CHO claramente asociada con placas amiloides en el hipocampo [9].

Pruebas in vivo

Una vez demostrada la especificidad del conjugado, se realizarán los análisis de biocompatibilidad del nanocojugado in vivo. La nanoplataforma se inyectaría por vía intravenosa a diferentes dosis (que van de 25 a 100 mg / kg [38]) (Fig. 2c), y se analizará la toxicidad subaguda durante el transcurso del estudio observando mortalidad, evidencias de atrofia , congestión, inflamación o cualquier cambio de comportamiento grave en ratones. Se calculará el coeficiente de peso de cada órgano al cuerpo. La toxicidad renal estará determinada por los niveles de nitrógeno ureico y creatinina en la sangre. Los niveles de bilirrubina total y fosfatasa alcalina en sangre podrían analizarse como una medida de la funcionalidad hepática y biliar. Además, se determinarán los niveles de ácido úrico y estudios hematológicos para evaluar los cambios en los niveles de glóbulos rojos, glóbulos blancos y hemoglobina. Finalmente, para buscar con más detalle posibles efectos tóxicos, se realizará un examen histológico de varios tejidos (riñón, hígado, bazo, cerebro o pulmones) [39]. La ubicación de las MNP funcionalizadas en sangre, orina y diferentes órganos se analizaría a las 24 h, 72 h, 1 semana, 2 semanas y 1 mes después de la inyección de anti-CHO-MNP.

Una vez determinada la concentración adecuada de MNP, se inyectará la nanoplataforma en ratones control y 5XFAD, y se evaluará su eficacia mediante resonancia magnética (Fig. 2c). Si el anticuerpo de la nanoplataforma no reconoce el antígeno en el sistema in vivo, entonces las MNP podrían funcionalizarse con colesterol fenil-diino, un compuesto que en estudios previos se ha encontrado que puede unirse a acumulaciones de CHO in vivo [40]. . La biocompatibilidad de este nanoconjugado se evaluará como se describe anteriormente para el nanoconjugado MNP-CHO. Si la vía de administración intravenosa no es eficaz para cruzar la BBB, se proponen vías de administración alternativas como la administración intranasal o la aplicación de campos magnéticos externos (Fig. 2c).