Efectos tóxicos inducidos por nanopartículas de zirconia en células 3T3-E1 similares a osteoblastos

Materiales y métodos

Preparación y caracterización de materiales

TiO ₂ NP (número CAS 637262) y ZrO ₂ Se adquirieron NP (número CAS 544760) de Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) Y se caracterizaron mediante microscopio electrónico de transmisión (TEM, MFP-3D-S, Asylum Research, Santa Barbara, CA, EE. UU.) , Potencial Zeta y mediciones de análisis de tamaño de partículas de dispersión dinámica de luz (DLS) (Zetasizer Nano ZS, Malvern, Reino Unido). Las NP se dispersaron en alcohol para la detección de TEM, lo que podría mostrar la morfología y el tamaño de las partículas de las NP con mayor claridad. Además, el tamaño agregado de las partículas se detectó mediante DLS, donde se utilizó medio de cultivo completo para hacer corresponder con los caracteres de las partículas aplicados en el cultivo celular. Antes del tratamiento celular, la solución madre se dispersó mediante Ultrasonic Cell Disruption System (Ningbo Xinzhi Biotechnology, China) durante 30 minutos acompañado de enfriamiento con hielo y se diluyó a diferentes concentraciones con medio de cultivo completo antes de los experimentos celulares.

Cultivo celular 3T3-E1

La línea celular 3T3-E1 (el banco celular de la infraestructura de Shanghai para la investigación pública y el desarrollo de la Academia China de Ciencias Médicas, Shanghai, China) se cultivó en un medio alfa esencial mínimo (α-MEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA , EE. UU.) Que contiene 10% de suero fetal bovino (FBS, Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) Y 1% de antibiótico / antimicótico (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.). Las células se incubaron a 37 ° C con 5% de CO ₂ en una atmósfera humidificada al 95%, y el medio de cultivo se reemplazó cada dos días.

Ensayo de proliferación celular

La viabilidad celular se detectó utilizando el ensayo CCK-8 (Dojindo Molecular Technologies, ciudad de Kumamoto, Japón). Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a 5000 células por pocillo. TiO ₂ NP y ZrO ₂ Luego se agregaron NP a las placas de 96 pocillos en concentraciones seriadas de 0, 10, 20, 40, 60, 80, 100 y 150 μg / mL seguido de incubación durante 24 y 48 ha 37 ° C con 5% de CO ₂ , acompañado de N -acetil-l-cisteína (NAC) o no, que se utilizaron para inhibir la producción de ROS. El grupo de control no se trató. Luego, se realizó la prueba CCK-8 agregando 110 μL de reactivos de detección a cada pocillo, y luego se incubaron las placas de 96 pocillos durante 2 h más a 37 ° C. Para evitar que las NP interfieran en este ensayo analítico, los reactivos a analizar en las placas de 96 pocillos se transfirieron a una nueva placa de 96 pocillos después de 2 h de tiempo de reacción; las NP y las células depositadas se dejaron en la placa primaria. La densidad óptica (DO) de cada pocillo se midió a una única longitud de onda de 450 nm con el lector de microplacas (SpectraMax M5, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE. UU.). Cada tratamiento se realizó en seis repeticiones.

Análisis de apoptosis de anexina V por citometría de flujo

Las células se cultivaron en una placa de 12 pocillos a una densidad de 30.000 células / pocillo para la confluencia. Después de TiO ₂ NP y ZrO ₂ En el tratamiento con NP durante 48 h, las células se lavaron con PBS y se recogieron usando tampón de tripsina libre de EDTA. Las células se resuspendieron con tampón PBS a una concentración de 25.000 células / ml y se centrifugaron a 1000 × g . Luego, las células se tiñeron con FITC Annexin V y PI (Invitrogen ™, EE. UU.) A temperatura ambiente sin exposición a la luz. Finalmente, las células se mezclaron con 400 μL de tampón de unión y se analizaron inmediatamente mediante citometría de flujo (BD FACSAria III, BD, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.).

Análisis de generación ROS

La formación de ROS intracelulares se determinó utilizando el kit de ensayo de especies reactivas de oxígeno (Beyotime, Shanghai, China). Brevemente, después de lavar con PBS, las células se sembraron en una placa de 6 pocillos a 20.000 células / pocillo en 2 ml de medio de cultivo y se trataron con TiO ₂ NP y ZrO ₂ NP a concentración de 0, 10, 50 y 100 μg / mL durante 48 h, acompañadas o no de NAC. Después del tratamiento con TiO ₂ NP y ZrO ₂ NP, las células se recolectaron e incubaron con DCFH-DA 10 μM durante 30 min a 37 ° C y 5% de CO ₂ . Las intensidades fluorescentes se analizaron en un BD FACSAria III (BD, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE. UU.).

Microscopía confocal

Debido a que una gran proporción de células se han convertido en estado de apoptosis, elegimos 24 h como el momento para observar los cambios en la estructura del citoesqueleto de las células en nuestro estudio. Se sembraron células 3T3-E1 en cubreobjetos de vidrio y se cultivaron en presencia de TiO ₂ NP y ZrO ₂ NP durante 24 h. Las células se lavaron inmediatamente después del tratamiento con tampón PBS tres veces y se fijaron con paraformaldehído al 4%, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1% y se bloquearon con PBS que contenía BSA al 5%. Luego, las células se incubaron para α-tubulina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU., 1:4000) a 4 ° C durante la noche y se cargaron con el anticuerpo secundario unido a FITC a 37 ° C durante 1 h al día siguiente. lavar con PBS tres veces. En consecuencia, el citoesqueleto se tiñó con rodamina-faloidina (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU., 1:1000) durante 1 h en oscuridad, y los núcleos se tiñeron con Hoechst 33342 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) Durante 20 min. Los cubreobjetos se examinaron utilizando un microscopio confocal FV10i (Olympus, Tokio, Japón).

Detección de inducción de mineralización

Se sembraron células 3T3-E1 en una placa de 6 pocillos a una densidad de 15.000 células / pocillo. Las células se trataron con TiO ₂ NP y ZrO ₂ NP a concentraciones de 10 y 100 μg / mL, y el medio de cultivo que contiene los nanomateriales se reemplazó día por medio; las células se lavaron suavemente con PBS para eliminar los nanomateriales residuales antes de cada cambio de medio de cultivo. Después de cultivar durante 7, 14 y 21 días en presencia de TiO ₂ NP y ZrO ₂ NP, las células se tiñeron con rojo de alizarina S. Brevemente, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% a 4 ° C durante 30 min y se tiñeron con solución de rojo de alizarina S (40 mM, pH 4,1) a temperatura ambiente durante otros 20 min. Después de lavar con agua destilada tres veces, se observaron nódulos mineralizados con un microscopio óptico (Olympus, Japón).

Extracción de ARN y RT-PCR

El ARN total se extrajo mediante el reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.). Luego, se evaluó la concentración de ARN usando un espectrofotómetro ultravioleta. El ARN aislado se transcribió de forma inversa a ADNc usando un kit de reactivos RT (TaKaRa Bio, Dalian, China). La PCR en tiempo real se llevó a cabo utilizando reactivo verde SYBR (TaKaRa Bio, Dalian, China). Se detectaron genes relacionados con la osteogénesis, incluido el factor de transcripción 2 relacionado con el runt (RUNX2), el colágeno 1α1 (Col1α1), la fosfatasa alcalina (ALP), la osteopontina (OPN), la osteocalcina (OC) y la sialoproteína ósea (BSP). Los datos se analizaron utilizando 2 ^−ΔΔ Método CT. Los cebadores utilizados se enumeraron en la Tabla 1.

Análisis estadístico

Los resultados se representaron como la media ± SEM. Todos los datos se analizaron estadísticamente mediante la prueba ANOVA. Se realizó la prueba de homogeneidad de varianza y se utilizaron las pruebas T3 de Bonferroni y Dunnett cuando se asumió la varianza igual y cuando no había homogeneidad, respectivamente. p un valor inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados

Caracterización del TiO ₂ y ZrO ₂ NP

Primero caracterizamos el TiO ₂ NP y ZrO ₂ Polvos NP a través de microscopía electrónica de transmisión (TEM) y dispersión dinámica de luz (DLS) (Fig. 1a, b, Tabla 2). Las imágenes TEM y SEM revelaron las formas y tamaños de las partículas. El TiO ₂ Las NP eran pequeñas esferas en forma de varilla con un tamaño medio de 25,4 ± 2,8 nm. El ZrO ₂ Las NP eran pequeñas esferas en forma de varilla con un tamaño medio de 31,9 ± 1,9 nm. Para medir el tamaño de TiO ₂ NP y ZrO ₂ Se utilizó NP en solución, DLS y las partículas de TiO ₂ NP y ZrO ₂ Los NP se expandieron a 81,2 nm y 93,1 nm, respectivamente, lo que indicó un efecto de aglomeración. Los potenciales zeta de TiO ₂ NP y ZrO ₂ Los NP fueron 32,9 ± 5,4 mV y 42,4 ± 7,4 mV, respectivamente.

Caracterizaciones del TiO ₂ y ZrO ₂ NP. TiO ₂ ( a ) y ZrO ₂ ( b ) La morfología y el tamaño de las NP se detectaron mediante TEM. ( c ) La situación de cocultivo de células 3T3 y nanomateriales se observó después de TiO ₂ y ZrO ₂ Concentraciones de tratamiento NP de 10, 50 y 100 μg / mL. ( d ) Los resultados de TEM se obtuvieron después de TiO ₂ y ZrO ₂ Tratamiento NP durante 1 h

Luego, observamos la fotografía de células 3T3 después de TiO ₂ NP y ZrO ₂ Exposición a NP a diversas concentraciones. Descubrimos que los NP se distribuían uniformemente en las células o se extendían por todas partes. Las NP mostraron una potente capacidad de agregación a altas concentraciones debido a una pequeña fracción de NP con microescala observada, mientras que una gran masa de NP era pequeña con nanoescala y probablemente se trasloca a células que eran difíciles de ver (Fig. 1c). Además, los resultados de TEM de las células después de TiO ₂ y ZrO ₂ Se ha obtenido tratamiento NP durante 1 h; Nuestros datos mostraron que las NP podrían translocarse en vesículas celulares. Mientras tanto, también se observan algunos daños en los orgánulos, por ejemplo, se produjo una inflamación mitocondrial y una vacuola.

TiO ₂ y ZrO ₂ Efectos tóxicos inducidos por NP en células 3T3-E1

Evaluamos la viabilidad celular después de TiO ₂ NP y ZrO ₂ Tratamiento NP en concentraciones en serie (10, 20, 40, 60, 80, 100, 150 μg / mL). Para TiO ₂ NP (Fig. 2a), después de 24 h de incubación, encontramos que TiO ₂ Los NP no fueron tóxicos a dosis más bajas (≤ 20 μg / mL), mientras que se observó una disminución obvia en la viabilidad celular a concentraciones más altas (> 20 μg / mL) ( p <0,001). Se observó una disminución más dramática de la viabilidad celular en el grupo de tratamiento de 20 μg / ml después de 48 h de incubación; TiO ₂ Las NP a la concentración de 20 μg / ml indujeron una disminución de la viabilidad celular ( p <0,01). Además, dosis más altas de TiO ₂ Las NP (> 20 μg / mL) mostraron una disminución significativa de la viabilidad celular a las 48 h ( p <0,001). Sin embargo, la viabilidad celular se mantuvo estable cuando se trató con 10 μg / mL de TiO ₂ NP durante 48 h. Además, para ZrO ₂ NP (Fig. 2b), se observaron resultados similares en comparación con TiO ₂ NP; Se observaron efectos tóxicos más altos a la concentración de 150 μg / mL durante 48 h, donde la viabilidad celular disminuyó por debajo del 50%. Estos resultados indicaron que TiO ₂ y ZrO ₂ Los NP fueron biocompatibles a dosis más bajas. Sin embargo, estos dos nanomateriales mostraron una ligera citotoxicidad a altas concentraciones tóxicas.

TiO ₂ y ZrO ₂ Disminución de la viabilidad celular inducida por NP en células 3T3-E1. Las células 3T3-E1 se trataron con TiO ₂ ( a ) y ZrO ₂ ( b ) NP a concentraciones de 0, 10, 20, 40, 60, 80, 100 y 150 μg / mL durante 24 y 48 h, y luego se detectó la viabilidad celular mediante el ensayo CCK-8. Mientras tanto, los cambios en la viabilidad celular se detectaron después del tratamiento con NAC, lo que podría eliminar las ROS intracelulares. Los resultados representan las medias ± SEM. * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001, en comparación con el control

Efectos de inhibición de NAC en el TiO ₂ y ZrO ₂ Citotoxicidad inducida por NP

Luego detectamos los efectos de inhibición de NAC, que es un agente eliminador de ROS. Los resultados mostraron que NAC potencialmente inhibe el TiO ₂ (Fig. 2a) y ZrO ₂ Las NP (Fig. 2b) indujeron la viabilidad celular después de 24 hy 48 h de tratamiento. Después de la inhibición de NAC, la viabilidad celular se mantuvo durante 24 horas a todas las concentraciones de TiO ₂ y ZrO ₂ Tratamiento NP excepto la concentración más alta (150 μg / mL). Aunque el efecto de inhibición disminuyó ligeramente en las células tratadas con altas concentraciones de TiO ₂ (100 y 150 μg / mL) y ZrO ₂ NP (80, 100 y 150 μg / mL) a las 48 h, no se observaron cambios potentes en la viabilidad celular para concentraciones por debajo de 80 μg / mL, donde la viabilidad celular fue significativamente mayor que aquellas sin NAC.

TiO ₂ y ZrO ₂ Generación de ROS inducida por NP en la celda 3T3-E1

Además, detectamos la generación de ROS después de TiO ₂ y ZrO ₂ Exposición de NP en células 3T3-E1 (Fig. 3). Nuestros resultados mostraron que TiO ₂ y ZrO ₂ Las NP indujeron la generación de ROS después de 24 h, que fue la más significativa a la concentración de 100 μg / mL. No hubo una generación de ROS significativa para TiO ₂ NP a una concentración de 10 μg / mL, mientras que ZrO ₂ Las NP indujeron una potente generación de ROS a la misma concentración. Mientras tanto, NAC podría inhibir significativamente el TiO ₂ y ZrO ₂ Generación de ROS inducida por NP en células 3T3-E1 en todas las concentraciones.

TiO ₂ y ZrO ₂ Generación de ROS inducida por NP en células 3T3-E1. Las células 3T3-E1 se trataron con TiO ₂ y ZrO ₂ Se incubaron simultáneamente NP a diversas concentraciones durante 48 h, y NAC (10 mM), y luego se detectaron los niveles de ROS en las células 3T3-E1. Los resultados representan las medias ± SEM. * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001, en comparación con el control

TiO ₂ y ZrO ₂ Apoptosis y necrosis inducidas por NP en células 3T3-E1

Se detectaron apoptosis y necrosis celular después de varias concentraciones de TiO ₂ y ZrO ₂ Exposición NP a las 48 h (fig. 4). Los puntos rojos ubicados en el tercer cuadrante representaron células normales, mientras que los puntos rojos ubicados en el primer cuadrante y el cuarto cuadrante representaron las células apoptóticas tempranas y las células apoptóticas tardías o necróticas, respectivamente. Curiosamente, nuestros resultados indicaron que TiO ₂ y ZrO ₂ Las NP podrían inducir la apoptosis de maneras dependientes de la concentración y el tiempo. Siguiendo el TiO ₂ NP exposición durante 48 h, no se detectó apoptosis celular significativa a concentraciones de 10 μg / mL; sin embargo, a concentraciones de 50 y 100 μg / mL, el porcentaje de células necróticas o apoptóticas tardías alcanzó niveles elevados. Siguiendo el ZrO ₂ NP exposición durante 48 h, no encontramos apoptosis celular a la concentración de 10 μg / mL también, pero el porcentaje de células necróticas o apoptóticas tardías fue del 43,7% en el grupo de 50 μg / mL. Lo más interesante es que se observó una apoptosis temprana significativa (34,1%) a la concentración de 100 μg / ml después de 48 h de tratamiento. Descubrimos que los niveles tempranos de apoptosis de TiO ₂ Los NP fueron significativamente más altos que ZrO ₂ NP; sin embargo, los niveles apoptóticos o necróticos tardíos estaban en verso.

TiO ₂ y ZrO ₂ Apoptosis inducida por NP en células 3T3-E1. un Después de que las células 3T3-E1 se trataron con el TiO ₂ y ZrO ₂ NP a diversas concentraciones durante 48 h, se detectaron los niveles de apoptosis celular. b Se calcularon los niveles de apoptosis, incluidos los niveles de apoptosis temprana y tardía, y luego los datos llevaron a cabo las estadísticas. Los resultados representan las medias ± SEM. * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001, en comparación con el control

TiO ₂ y ZrO ₂ Cambios morfológicos inducidos por NP en células 3T3-E1

Estudiar los cambios morfológicos de las células 3T3-E1 después de la exposición a TiO ₂ y ZrO ₂ NPs, realizamos tinción de fluorescencia seguida de microscopía confocal (Figs. 5 y 6). En comparación con las células de control no tratadas, no hubo cambios morfológicos después de 10 μg / ml de TiO ₂ y ZrO ₂ Tratamiento NP a las 24 h, mientras que las células se volvieron redondas y más pequeñas después de 100 μg / mL de TiO ₂ y ZrO ₂ Tratamiento NP. Lo más interesante es que se observó una ligera disminución del área celular después de 50 μg / ml de TiO ₂ y ZrO ₂ Tratamiento NP, donde TiO ₂ mostró una disminución más potente del área celular. De manera consistente, los resultados cuantitativos confirmaron una disminución significativa en el área celular después de 100 μg / mL de TiO ₂ y ZrO ₂ Tratamiento NP (Fig. 5).

TiO ₂ y ZrO ₂ Cambios en el área celular inducidos por NP en células 3T3-E1. Después de que las células 3T3-E1 se trataron con el TiO ₂ ( a ) y ZrO ₂ ( b ) NP a concentraciones de 10 y 100 μg / mL durante 24 h, las células se cargaron con tubulina (verde), actina (rojo) y Hoechst 33342 (azul). Se observó la morfología celular a partir de las alteraciones de los sistemas actina (rojo) y tubulina (verde), y se calcularon los cambios en la distribución del área celular

TiO ₂ y ZrO ₂ Cambios en el citoesqueleto inducidos por NP en células 3T3. Después de que las células 3T3-E1 se trataron con el TiO ₂ ( a ) y ZrO ₂ ( b ) NP a concentraciones de 10 y 100 μg / mL durante 24 h, los cambios en el citoesqueleto se evaluaron en función de las alteraciones de los sistemas de actina (rojo) y tubulina (verde)

Además, estudiamos los cambios en el citoesqueleto tanto en los filamentos de actina como en los niveles de microtúbulos (Fig. 6). De manera similar, no se mostró ninguna diferencia significativa entre el grupo de control y 10 μg / mL de TiO ₂ y ZrO ₂ El tratamiento con NP y las células de ambos grupos revelaron estructuras explícitas de filamentos de actina y sistema de microtúbulos. En contraste, 100 μg / mL de ZrO ₂ El tratamiento con NP indujo una contracción de las células 3T3-E1, junto con núcleos similares a picnosis y filamentos de actina no claros condensados ​​y estructuras de microtúbulos. Para TiO ₂ Se observaron NP, tantos puntos de actina, y los filamentos de actina ubicados en la membrana celular estaban brumosos y rugosos. Para ZrO ₂ NP, se detectó una alteración del citoesqueleto más potente y la estructura de actina y microtúbulos era rugosa y defectuosa.

TiO ₂ y ZrO ₂ Mineralización inducida por NP en células 3T3

A continuación, detectamos el estado de mineralización de las células 3T3 mediante tinción con rojo de alizarina y observamos la formación de nódulos mineralizados bajo microscopía óptica (Fig. 7). Las células se tiñeron después de la inducción osteogénica durante 7, 14 y 21 días en presencia de diversas concentraciones de TiO ₂ y ZrO ₂ NP. Encontramos que los nódulos mineralizados se hicieron visibles después de 14 y 21 días de inducción. No hubo diferencias significativas en la mineralización después de 14 y 21 días de inducción entre el grupo de control y TiO ₂ y ZrO ₂ Tratamiento NP a 10 μg / mL. Sin embargo, probablemente se observó una disminución de la mineralización después de TiO ₂ y ZrO ₂ Tratamiento NP a 100 μg / mL, debido al nódulo mineralizado que se hizo más pequeño y borroso.

TiO ₂ y ZrO ₂ Efectos de mineralización inducidos por NP en células 3T3. Después de la diferenciación de las células 3T3-E1 utilizando solución mineralizada durante 7 d, 14 d y 21 d, acompañada de TiO ₂ ( a ) y ZrO ₂ NP ( b ) a diversas concentraciones. La tinción roja de alizarina se utilizó para detectar el nódulo mineralizado (flecha negra)

TiO ₂ y ZrO ₂ Expresión inducida por NP de genes relacionados con la osteogénesis en células 3T3

Para investigar el mecanismo de TiO ₂ y ZrO ₂ Osteogénesis inducida por NP en células 3T3, detectamos los niveles de genes relacionados con la osteogénesis en células 3T3 después de TiO ₂ y ZrO ₂ Tratamiento con NP, incluidos genes que preferentemente se regularon positivamente durante la fase inicial ( Runx2 , Col1α1 y Alp ) y tarde ( Opn , Ocn y Bsp ) fases de la osteogénesis (Fig.8). Descubrimos que 10 μg / mL de TiO ₂ y ZrO ₂ Los NP indujeron el nivel de expresión más alto de Runx2 después de 3 días de tratamiento, mientras que en el día 7, Runx disminuyó al nivel más bajo después de ZrO ₂ Tratamiento NP a 100 μg / mL. Col1α1 aumentado después de 10 μg / mL de TiO ₂ y ZrO ₂ Tratamiento NP tanto en los días 3 como 7, mientras que para las células tratadas con 100 μg / mL de TiO ₂ y ZrO ₂ NP, Col1α1 primero aumentó significativamente el día 3, pero disminuyó drásticamente después de 7 días. También detectamos una disminución significativa de Alp expresión después de TiO ₂ y ZrO ₂ Tratamiento NP a 100 μg / mL durante 3 días.

TiO ₂ y ZrO ₂ Cambios en los genes relacionados con la osteogénesis inducida por NP en las células 3T3. Después de la diferenciación de las células 3T3-E1 utilizando solución mineralizada durante 3, 7, 14 y 21 d, acompañada de TiO ₂ y ZrO ₂ NP a diversas concentraciones. Los cambios genéticos relacionados con la osteogénesis se detectaron mediante RT-PCR. Los resultados representan las medias ± SEM de tres experimentos independientes. * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001, en comparación con el control

Para los genes regulados positivamente en la fase tardía de la inducción osteogénica, los niveles de expresión de Opn , Ocn y Bsp aumentó significativamente después de 10 μg / mL de TiO ₂ y ZrO ₂ Tratamiento NP durante 14 días y Opn continuamente regulado al alza a un nivel más alto el día 21. Estos resultados sugirieron que en comparación con Ocn y Bsp , Opn fue un marcador de etapa posterior de TiO ₂ y ZrO ₂ Osteogénesis inducida por NP. Curiosamente, 100 μg / mL de TiO ₂ y ZrO ₂ Los NP no pudieron mejorar la expresión de Opn , Ocn o Bsp el día 14; además, estos genes mostraron una regulación negativa significativa el día 21.

Discusión

ZrO ₂ Los NP eran componentes importantes en refractarios, cerámicas y aparatos biomédicos, incluidos implantes, endoprótesis articulares y materiales dentales. Hasta ahora, TiO ₂ NP como uno de los otros NP con propiedades fisicoquímicas similares, muchos estudios se han centrado en sus datos toxicológicos. Descubrieron que TiO ₂ Las NP podrían translocarse en las células y mostraron un daño celular potencial debido a diferentes características fisicoquímicas [20, 21]. Mientras tanto, faltaban los datos toxicológicos para ZrO2 NP. En nuestro estudio, consideramos TiO ₂ NP como grupo de control y exploraron los efectos toxicológicos del TiO ₂ y ZrO ₂ NP en células 3T3-E1. Se sabe que las propiedades fisicoquímicas de las NP, especialmente el tamaño y la morfología, tienen un impacto eficaz en la bioseguridad. Algunos estudios han demostrado que las partículas a nanoescala eran significativamente más tóxicas que las partículas a microescala [22, 23]. En la mayoría de los casos, también se informó que la morfología de las partículas afecta la toxicidad [24, 25, 26]. En nuestro estudio, mostramos que TiO ₂ y ZrO ₂ Los NP eran esferas en forma de varilla. En comparación con informes anteriores [5, 27, 28], nuestro TiO ₂ y ZrO ₂ Las NP tuvieron un efecto de aglomeración relativamente más débil en agua donde las partículas aumentaron de tamaño a 81,2 y 93,1 nm, mientras que también pudimos observar algunos materiales a microescala en el medio de cultivo después de la exposición a NP de manera dependiente de la concentración, lo que confirma el efecto de aglomeración en este estudio incluso después de usar tecnología de dispersión ultrasónica. Sin embargo, el efecto de aglomeración no pudo inhibir la translocación de NP en el citoplasma, debido a que se detectaron NP potentes en vesículas intracelulares. Los orgánulos, como las mitocondrias, probablemente fueron un objetivo principal.

Hemos detectado la viabilidad de las células 3T3-E1 a diversas concentraciones de TiO ₂ y ZrO ₂ Tratamiento NP. Nuestros resultados mostraron que 10 μg / mL de TiO ₂ y ZrO ₂ NPs es una concentración de bioseguridad para células 3T3-E1. La viabilidad celular disminuyó de manera dependiente del tiempo y la concentración, lo que implicaba que TiO ₂ y ZrO ₂ NPs were potentially cytotoxic after longer exposure of higher doses compared with other oxide metal nanoparticles, such as silicon dioxide and ZnO [4, 28, 29]. Moreover, ZrO₂ NPs showed more potent toxic effects than TiO₂ NPs in our study at high toxic concentrations.

Oxidative stress, a byproduct of outpaced ROS generation and decreased antioxidant factors, is known as one crucial factor in nanomaterial-induced cytotoxicity, and it is reported to trigger cell apoptosis through distinct mechanism [30, 31]. Furthermore, Kozelskaya et al. [12] observed that ZrO₂ NPs induced the increase of membrane microviscosity, cell morphology changes, and surface cracks on the red blood cells due to the oxidative stress. In agreement with these studies, we detected the ROS levels in 3T3-E1 cells after TiO₂ and ZrO₂ NP treatment and found that TiO₂ and ZrO₂ NPs could induce significant ROS generation in concentration-dependent manners, and ZrO₂ NPs induced more potent oxidative stress effects. Moreover, the elevated ROS levels could be eliminated by NAC which is a ROS scavenger. These results suggested the important role of ROS in TiO₂ and ZrO₂ NP-induced cell cytotoxicity.

Apoptosis is a type of cell death which clears the senescent and abnormal cells, so as to sustain the cell biological functions [32]. Some studies have reported that apoptosis was one of the main toxic responses after treating with oxide metal nanomaterials, such as TiO₂ , ZnO, Si, and Ag [33,34,35,36]. In our study, we found that TiO₂ and ZrO₂ NPs could induce apoptotic/necrotic body formation in 3T3-E1 cells in time/concentration-dependent manners, which was correlated with the decreased cell viability shown previously. Moreover, we found that when large parts of late apoptotic or necrotic cells were observed after ZrO₂ NP treatment, the cell status for TiO₂ NPs largely was early apoptosis. These phenomena applied that ZrO₂ NPs induced more rapid and potent apoptosis effects. Similarly, other studies also showed that ZrO₂ NPs induced significant apoptotic and necrotic processes in MSTO cells [4, 11].

The cytoskeleton metabolism is a dynamic biological process involving polymerization and depolymerization, which could sustain cell morphology and promote cell function. Some studies have shown that nanomaterials could affect the cell morphology and cytoskeleton system [37,38,39]. We found 3T3-E1 cells became smaller and rounded in the high-dose group of TiO₂ and ZrO₂ NPs (100 μg/mL), along with decreased cell area due to cytoskeleton disruptions. These findings were also supported by previous reports that ZrO₂ NP treatment could induce cell morphology changes in MSTO cells at higher concentration [4]. Another study showed the disrupted blood cell morphology after ZrO₂ NP treatment [12].

Alizarin red staining is a key indicator of osteogenic responses. In our study, no impact on osteogenic induction has been shown by TiO₂ and ZrO₂ NP treatment (10 μg/mL), except that cells treated with a cytotoxic dose of TiO₂ and ZrO₂ NPs (100 μg/mL) had a significant decrease of mineralized nodules due to the potential inhibition of osteoinductive properties. In addition, the expression level of osteogenesis-related genes was important biomarkers. Our results showed that lower concentration (10 μg/mL) of TiO₂ and ZrO₂ NPs promoted the expression of osteogenesis-related genes; however, TiO₂ and ZrO₂ NPs at high concentrations (100 μg/mL) could significantly inhibit gene expression for both early- and late phases of mineralization, indicating that TiO₂ and ZrO₂ NPs at high concentrations indeed inhibited osteoinductive properties. Other studies also obtained similar results; they claimed that TiO₂ NPs inhibited the osteogenesis of osteoblasts in a size-dependent manner while potentially promoted osteoclastogenic process [33]. Sengstock et al. [40] found that sub-toxic concentrations of Ag NPs and Ag ions could significantly impair the osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. More ongoing or newly initiated researches are focused on developing nanoparticles with acceptable biosafety and osteogenic potential to promote osseointegration for in vivo application [18, 41].

Conclusion

In conclusion, our data indicated that ZrO₂ NPs were nanoparticles with good biocompatibility, just like TiO₂ NPs, while they could induce toxic effects at high toxic concentrations on 3T3-E1 cells. ROS played a key role on TiO₂ and ZrO₂ NP-induced cytotoxicity, including cell viability, apoptosis and necrosis, and changes in cell morphology. Moreover, TiO₂ and ZrO2 NPs at high concentrations showed inhibitory effects on osteogenic differentiation of 3T3-E1 cells. Our findings could provide deep insights into the biocompatibility and potential application of ZrO2 NPs.

Abreviaturas

Ag:

Silver

ALP:

Fosfatasa alcalina

Col1α1:

Collagen 1α1

DLS:

Dispersión de luz dinámica

FBS:

Fetal bovine serum

NAC:

N -acetyl-l-cysteine

NP:

Nanopartículas

OC:

Osteocalcin

OD:

Densidad óptica

OPN:

Osteopontin

PBS:

Phosphate-buffered saline solution

ROS:

Especies reactivas de oxígeno

RUNX2:

Runt-related transcription factor 2

Si:

Silica

TEM:

Microscopio electrónico de transmisión

TiO₂ :

Titanium dioxide

ZrO₂ :

Zirconia

α-MEM:

Minimum essential medium-alpha

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