Biosensor amperométrico de metaloproteinasa de matriz-7 mejorado por nanocompuestos de carbono funcionalizados con Pd

Resultados y discusión

Principio del biosensor de escisión de péptidos

El proceso de construcción del biosensor basado en la escisión de péptidos se ilustra en el esquema 1. Primero, se depositó Au-rGO sobre el electrodo de carbono vítreo (GCE) mediante un método electroquímico, luego los péptidos se inmovilizaron en Au-rGO mediante enlace Au-S. Los Pd-CNC se compusieron como potenciadores catalíticos y se seleccionó glutaraldehído como enlazador químico entre el péptido y los potenciadores. 4-CN y H ₂ O ₂ se emplearon como sustratos de precipitación catalizada para mejorar la impedancia. En particular, se eligió MMP-7 como la enzima de escisión de péptidos entre alanina (A) y leucina (L) en péptidos [8], lo que provocó un cambio de señal de corriente indistintivo medido por SWV. La electrodeposición de Au-rGO en el GCE tiene dos ventajas:(1) Au-rGO puede mejorar efectivamente la conductividad de la interfaz de detección; y (2) permite que los sitios inmovilicen péptidos. Aprovechando la alta impedancia y el rendimiento catalítico de los Pd-CNC, ΔI se amplificó reemplazando los Pd-CNC con la escisión del péptido específico (NH2-KKKRPLALWRSCCC-SH). Este fenómeno se debe a la mala conductividad eléctrica de los Pd-CNC y a la alta impedancia de precipitación generada por la oxidación de 4-CN con H ₂ O ₂ catalizado por Pd-CNC.

Ilustración esquemática de la nanoesfera de carbono funcionalizada con Pd como potenciador de impedancia para el ensayo amperométrico de MMP-7

La reacción de precipitación catalítica en el GCE se caracterizó además por microscopía electrónica de barrido (SEM) incubando Pd-CNC en la superficie de los péptidos / Au-rGO / GCE (Fig. 1a). Los Pd-CNC se recubrieron con una capa insoluble después de la reacción de precipitación, lo que indica que se formó la capa insoluble de baja conductividad en el electrodo modificado (Fig. 1b). Por lo tanto, se estableció con éxito un biosensor para la detección ultrasensible de MMP-7 a partir de la amplificación de la sensibilidad atraída tanto por la escisión del péptido como por la precipitación catalítica.

Imágenes SEM de Pd-CNC / péptidos / Au-rGO / GCE ( a ) tratado con reacción de precipitación catalítica ( b )

Caracterización de los Pd-CNC

Mediante un método hidrotermal típico, se prepararon con éxito Pd-CNC homogéneos. Las morfologías de nanoesferas de carbono, nanoesferas de Pd-carbono y Pd-CNC se caracterizaron por microscopía electrónica de transmisión (TEM) y espectrometría de rayos X de dispersión de energía (EDS). Las nanopartículas de Pd se formaron y distribuyeron en las nanoesferas de carbono después de la reacción de microondas (Fig. 2b), lo que demuestra la preparación exitosa de nanoesferas de Pd-carbono con diámetros de 150 nm (Fig. 2a). Las morfologías de los Pd-CNC se muestran en la Fig. 2c. Los resultados de EDS confirman las composiciones químicas de nanopartículas de carbono, nanoesferas de Pd-carbono y Pd-CNC, que muestra que las nanopartículas de carbono contienen C y O (Fig. 2d). Después de la funcionalización de las nanopartículas de Pd, el Pd también existía en los espectros de nanoesferas de Pd-carbono (Fig.2e), mientras que S y N encontrados en los espectros de Pd-CNC se originan en BSA, que se utilizó para bloquear nanoesferas de Pd-carbono ( Figura 2f). Estos resultados revelan intuitivamente la síntesis exitosa de los potenciadores catalíticos Pd-CNC. Las imágenes HR-TEM de nanoesferas de Pd-carbono (Fig.3a) ilustran que las nanopartículas de Pd funcionalizadas (Fig.3b) están en fase cúbica del centro de la cara (FCC) con un plano de celosía observable (1,1,1) (Fig. 3c). Las imágenes correspondientes de transformación rápida de Fourier (FFT) (Fig. 3d) también respaldan la naturaleza cristalina de FCC de las nanopartículas de Pd.

Micrografías TEM de nanoesferas de carbono ( a ), Nanoesferas de Pd-carbono ( b ) y Pd-CNC ( c ) EDS de la nanoesfera de carbono ( d ), Nanoesferas de Pd-carbono ( e ) y Pd-CNC ( f )

Imágenes HR-TEM de nanoesferas de Pd-carbono ( a ), imágenes ampliadas de nanopartículas de Pd ( b, c ) e imágenes FFT de nanopartículas de Pd ( d )

Caracterización de los procedimientos de construcción del biosensor

Los procedimientos de construcción del biosensor se controlaron mediante mediciones de SWV (Fig. 4a) y espectroscopia de impedancia electroquímica (EIS) (Fig. 4b). En comparación con la señal de corriente de GCE desnudo (curva GCE desnuda), la corriente máxima en el rango de potencial aumentó a aproximadamente 420 μA (curva Au-rGO / GCE) después de la electrodeposición de Au-rGO, lo que puede atribuirse a la excelente conductividad de Au-rGO. Luego, el pico de corriente de señal disminuyó después de la inmovilización de péptidos en el electrodo (péptidos de curva) y se redujo aún más después del enlace entre péptidos y Pd-CNC debido a la alta impedancia de los péptidos y potenciadores (curva Pd-CNC). Después de incubar con MMP-7, el pico de corriente aumentó (escisión de la curva MMP-7), lo que puede ser causado por la escisión específica de péptidos por MMP-7 y la eliminación parcial de potenciadores de la superficie del electrodo. En las mismas condiciones, el cambio actual (ΔI ₁ ) entre las curvas "Pd-CNC" y "MMP-7 clivaje" se calculó en 48,7 μA. Luego, el pico de corriente se redujo después de la reacción de precipitación catalítica de 4-CN, con un pico de corriente de 136,1 μA (curva de precipitación de escisión de MMP-7). Por el contrario, el biosensor sin MMP-7 indujo un pico de corriente más bajo (54,9 μA, curva de precipitación), que se estableció como la señal en blanco, después de la reacción de precipitación catalizada. Dadas las circunstancias, ΔI ₂ fue la diferencia de señal actual entre las curvas de “precipitación” y la curva de “precipitación de escisión de MMP-7”, aumentando de 48,7 a 81,2 μA. También se utilizó EIS para monitorear la fabricación del biosensor. La resistencia a la transferencia de electrones correspondió al diámetro del semicírculo de los gráficos de Nyquist (Fig. 4b). A modo de comparación, el gráfico de los péptidos / Au-rGO / GCE (péptidos de curva) muestra un semicírculo más grande y, por lo tanto, una mayor resistencia que los de Au-rGO / GCE (curva Au-rGO / GCE) y GCE desnuda (curva desnuda GC) que tiene el círculo más pequeño, lo que indica que los péptidos se modificaron con éxito en el GCE. La resistencia aumentó cuando los péptidos se vincularon con el potenciador mediante glutaraldehído (curva Pd-CNC). El diámetro del semicírculo disminuyó ligeramente (escisión de la curva de MMP-7) después de la incubación con MMP-7, que puede atribuirse a la MMP-7 que escindió específicamente los péptidos. Por el contrario, la resistencia aumentó significativamente cuando el biosensor se sumergió en la solución de 4-CN y H ₂ O ₂ (curva de precipitación) _. Al someterse a una reacción de precipitación catalítica y de escisión de péptidos, la resistencia disminuyó obviamente (curva de precipitación de escisión de MMP-7).

SWV ( a ) y EIS ( b ) respuestas del proceso de modificación del electrodo en 5 mM [Fe (CN) ₆ ] ^{3− / 4-} tamponado con fosfato (0,1 M, pH =7,4)

Optimización de las condiciones de detección

La cantidad y el tiempo de incubación de los péptidos, como factores importantes para el rendimiento de detección del biosensor, se optimizaron aún más. Se encontró que la señal de corriente disminuyó en consecuencia cuando la concentración de péptido aumentó de 20 a 40 µM y se mantuvo constante entre 50 y 80 µM (Fig. 5a). Para evitar la adsorción inespecífica, elegimos 50 µM para las mediciones posteriores y luego optimizamos el tiempo de incubación del péptido 50 µM (Fig. 5b). La corriente SWV disminuyó gradualmente de 20 a 40 min, luego permaneció constante después de 40 min. Por tanto, se eligió 40 min como tiempo de incubación para los péptidos. El tiempo de reacción de escisión también es un factor significativo para el rendimiento analítico del biosensor (Fig. 5c). La señal del biosensor aumentó cuando el tiempo de escisión osciló entre 30 y 50 min, luego permaneció constante después de 50 min, lo que sugiere que el péptido se escindió por completo. Por tanto, se eligieron 50 min como tiempo de escisión para los siguientes experimentos. Se encontró que la reacción de precipitación, que también influye en la sensibilidad del biosensor (Fig. 5d), aumentaba en 50 min y la señal electroquímica disminuía continuamente. Dado que la señal actual se mantuvo constante con un aumento adicional en el tiempo de reacción, se seleccionaron 50 minutos como tiempo de reacción de precipitación para el siguiente ensayo.

Efectos de la concentración de péptidos ( a ), tiempo de incubación del péptido 50 μM ( b ), tiempo de escisión del péptido ( c ) y tiempo de reacción de precipitación ( d ) sobre las respuestas actuales del biosensor

Rendimiento del biosensor propuesto

Después de la incubación con diferentes concentraciones de MMP-7 en las condiciones óptimas, se determinó el rendimiento del biosensor propuesto. Como se muestra en la Fig. 6, al disminuir la concentración de MMP-7, la señal de SWV disminuyó. El gráfico de calibración revela una buena relación lineal entre los picos actuales y el logaritmo de las concentraciones de analito en el rango de 0,1 pg mL ⁻¹ a 100 ng mL ⁻¹ . Se determinó que la ecuación lineal es ( I =- 16.53lgCMMP-7-137.26) con un coeficiente de correlación de 0.9967. El límite de detección del biosensor fue de 17,38 fg mL ⁻¹ para MMP-7 con una relación señal / ruido de 3 (S / N =3; es la desviación estándar de la señal en una solución en blanco). En comparación con informes recientes sobre la detección de escisión de péptidos de MMP-7, el biosensor mostró un mejor rendimiento analítico (Tabla 1).

un Respuestas de SWV de detección electroquímica para MMP-7 en [Fe (CN) ₆ 5 mM ] ^{3− / 4−} tamponado con fosfato (0,1 M, pH =7,4) a concentraciones de 100 fg mL ⁻¹ a 100 ng mL ⁻¹ . b Curva de calibración lineal de la corriente y el logaritmo de la concentración de MMP-7. Las barras de error son desviaciones estándar para n =3

Evaluación del rendimiento del inmunosensor

Para evaluar la reproducibilidad del biosensor, se incubaron tres electrodos modificados con 0.01, 0.1, 1, 10 y 100 ng mL ⁻¹ MMP-7. Se calculó que las desviaciones estándar correspondientes eran 1,3%, 1,4%, 4,0%, 1,0% y 3,0%, respectivamente, lo que indica una buena reproducibilidad del biosensor. MMP-2, NSE, PSA, TBS y BSA se utilizaron como distracciones para analizar la especificidad de este biosensor. No se observaron respuestas obvias cuando el biosensor se incubó con mezclas individuales de 1 ng mL ⁻¹ MMP-7 con (100 ng mL ⁻¹ cada uno) MMP-2, NSE, PSA, TBS y BSA. Comparado con el biosensor incubado con solo 1 ng mL ⁻¹ MMP-7, las señales de corriente de cada mezcla eran casi iguales (Fig. 7a), lo que demuestra que el biosensor muestra una excelente especificidad para MMP-7. Para investigar la estabilidad, el biosensor construido se almacenó a 4 ° C durante 28 días y su rendimiento para la detección de MMP-7 se evaluó cada 7 días (Fig. 7b). Las desviaciones estándar relativas (RSD) entre experimentos paralelos fueron menores al 10%, lo que implica una estabilidad notable del biosensor.

Respuestas actuales de SWV ( a ) sobre la capacidad antiinterferente del biosensor (las barras de error son desviaciones estándar para n =3). Las concentraciones de distracciones:MMP-2 (100 ng mL ⁻¹ ), NSE (100 ng mL ⁻¹ ), PSA (100 ng mL ⁻¹ ), THR (100 ng mL ⁻¹ ) y BSA (100 ng mL ⁻¹ ), respectivamente. La mezcla contiene todas esas distracciones (100 ng mL ⁻¹ ) y MMP-7 (1 ng mL ⁻¹ ). Respuestas SWV ( b ) de los biosensores propuestos almacenados a 4 ° C durante un tiempo diferente para la detección de 1 ng mL ⁻¹ MMP-7

Para investigar la viabilidad del método propuesto, se llevaron a cabo experimentos de recuperación. Las recuperaciones variaron del 86,3 al 117,2% (Tabla 2), lo que indica además la prometedora viabilidad del biosensor en los análisis clínicos.