La regulación a la baja del microARN-342-5p o la regulación al alza de Wnt3a inhibe la angiogénesis y mantiene la estabilidad de la placa aterosclerótica en ratones con aterosclerosis

Materiales y métodos

Declaración de ética

Los animales se trataron de forma humanitaria utilizando procedimientos aprobados de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Uso y Cuidado Animal del Hospital Popular Provincial de Qinghai (número de ética:201870726).

Animales experimentales

Hombre ApoE ^{- / -} Los ratones y ratones C57BL / 6J (grado libre de patógenos específicos) de 8 semanas estaban disponibles en Beijing Vital Laboratory Animal Technology (Beijing, China). Los ratones (5-6 ratones en una jaula) se alojaron con un ciclo de 12 h / 12 h día / noche con acceso ad libitum a alimentos y agua.

Establecimiento de modelos de ratones de AS

ApoE ^{- / -} los ratones fueron alimentados con alimento rico en grasas durante 16 semanas para establecer el modelo de placa vulnerable AS. Se utilizaron ratones C57BL / 6 J como grupo normal con bebida y comida natural. ApoE ^{- / -} los ratones tenían pelo claro brillante y caída de pelo en la espalda después de 12 semanas. El arco aórtico y la arteria braquiocefálica de 3 ratones modelo se disecaron para realizar tinción con hematoxilina-eosina (HE) y no hubo depósitos de placa significativos en la íntima. Se identificaron de nuevo otros 3 ratones modelados después de 4 semanas, y la tinción con HE mostró que había depósitos de placa obvios en la íntima del arco aorta, lo que indica el éxito del establecimiento del modelo.

Agrupación y tratamiento de ratones

ApoE ^{- / -} Los ratones con placa vulnerable AS se dividieron en 6 grupos con 12 ratones en cada grupo:grupo AS, grupo de control negativo (NC) (inyectado con solución salina normal en ApoE ^{- / -} ratones), grupo agomir miR-342-5p (inyectado con agomir miR-342-5p para sobreexpresar la expresión de miR-342-5p en ApoE ^{- / -} ratones), grupo miR-342-5p antagomir (inyectado con miR-342-5p antagomir para reducir la expresión de miR-342-5p en ApoE ^{- / -} ratones), grupo de sobreexpresión (oe) -Wnt3a (inyectado con el vector oe-Wnt3a para regular al alza la expresión de Wnt3a en ApoE ^{- / -} ratones) y miR-342-5p agomir + grupo oe-Wnt3a (inyectado con miR-342-5p agomir y el vector oe-Wnt3a para regular al alza la expresión de miR-342-5p y Wnt3a en ApoE ^{- / -} ratones). Los ratones C57BL / 6 J como el grupo normal se alimentaron con una dieta normal. El alimento rico en grasas contenía un 20% de grasas y un 0,25% de colesterol. miR-342-5p agomir, miR-342-5p antagomir y el vector oe-Wnt3a se compraron en Sangon (Shanghai, China). El vector oe-Wnt3a, miR-342-5p agomir, miR-342-5p antagomir se disolvieron todos en 0,2 ml de solución salina normal y se inyectaron en ratones a una dosis de 40 mg / kg a través de la vena de la cola cada dos semanas. Después de 8 semanas, se tomaron muestras de sangre de los globos oculares y luego, se sacrificó a los ratones para recolectar tejidos arteriales [19].

En el experimento preliminar, ApoE ^{- / -} A los ratones con AS se les inyectaron 10 mg / kg, 20 mg / kg, 40 mg / kg de miR-342-5p agomir, miR-342-5p antagomir o vector oe-Wnt3a (una vez cada dos semanas; 4 veces en total). Luego, los niveles de expresión de β-catenina se detectaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR).

Recolección y tratamiento de muestras

Antes del muestreo, los ratones se mantuvieron en ayunas durante 12 horas y se anestesiaron mediante inhalación de éter y se tomaron muestras de sangre de los globos oculares. Se abrió el pecho de los ratones, se disoció la aorta torácica hasta el final de la aorta abdominal y se extrajo todo el vaso. Después de limpiar con solución salina tamponada con fosfato sin ARN (PBS), los tejidos se incrustaron para tinción HE, rojo aceite O, rojo Sirius y tinción inmunohistoquímica. Algunos de los tejidos vasculares se conservaron a -80 ° C para RT-qPCR y Western blot.

Detección del nivel de lípidos en sangre

Se adoptó el analizador bioquímico automático (Roche, Basilea, Suiza) para detectar colesterol total (CT), triglicéridos (TG), colesterol unido a lipoproteínas de baja densidad (LDL-C) y colesterol unido a lipoproteínas de alta densidad (HDL-C) en suero. La detección se implementó siguiendo la especificación de los kits (NanJing JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, China).

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)

Determinación del contenido de citocinas en suero:se utilizaron kits de ELISA comerciales de interleucina (IL) -5, IL-12p70, factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) e interferón (IFN) -γ. Finalmente, el valor de densidad óptica (DO) de cada pocillo fue probado por un lector de microplacas a 450 nm.

Determinación de la lesión por estrés oxidativo:el contenido de malondialdeyde (MDA) y la actividad de superóxido dismutasa (SOD) en suero se analizaron con el kit MDA (el valor de DO se probó con un espectrofotómetro a 532 nm) y el kit de SOD (el valor de DO se determinó con un lector de microplacas a 450 Nuevo Méjico). Los kits de ELISA IL-5, IL-12p70, TNF-α, IFN-γ, MDA y SOD se compraron en MultiSciences (Lianke) Biotechnology Corporate Limited (Hangzhou, Zhejiang, China).

Tinción HE, tinción Oil Red O y tinción Sirius Red

Después de la fijación e incrustación, las muestras se cortaron en secciones consecutivas de 4 micras de espesor. Las rodajas se desparafinaron e hidrataron, se tiñeron con hematoxilina y eosina, se diferenciaron, deshidrataron, aclararon con xileno, se secaron y sellaron con goma neutra. El núcleo era azul y otros tejidos como el citoplasma y los tejidos conectivos eran rojos en diferentes tonos. La formación de placa se observó mediante un microscopio de fluorescencia. Las paredes arteriales de las secciones teñidas con HE se seleccionaron al microscopio y los resultados experimentales se recogieron con una cámara digital. Se utilizó el módulo de software de análisis de imágenes Image Pro Plus6.0 (IPP6.0) para calcular el área de la placa de la sección transversal de cada rebanada y el área de la pared, así como su proporción.

Se eligieron rodajas de 4-5 µm para la tinción con rojo aceite O. Las rodajas se secaron con exceso de temperatura durante 20 min y se incubaron con isopropanol al 100% durante 5 min. Luego, las rodajas se incubaron con solución de tinción de rojo aceite al 0,5% en un horno a 60 ° C durante 8 min, se lavaron en isopropanol al 85% durante 3 min, se tiñeron con hematoxilina durante 1 min, se limpiaron y sellaron. Los resultados de la tinción con rojo aceite O sugirieron que el lípido era rojo o naranja y el núcleo era azul claro. Se utilizó el software IPP6.0 para calcular el área de grasa y el área de placa en la placa del corte de tejido. El contenido de lípidos =área de tinción positiva de rojo aceite O / área de placa × 100%.

Tinción con rojo Sirio:las rodajas se desparafinaron e hidrataron, se tiñeron durante 10 min con una solución de tinción de azul celestina, con una solución de tinción con rojo Sirius durante 20 min y se contratiñeron durante 10 min con hematoxilina. Finalmente, las rodajas se deshidrataron mediante gradiente de etanol, se aclararon con xileno y se sellaron con goma neutra. El área de colágeno en la placa del corte de tejido se calculó con el software IPP6.0. El área de colágeno =área de tinción positiva de rojo Sirio / área de placa × 100%. Se calculó el porcentaje de lípidos y colágeno en el área de la placa.

La hematoxilina, la eosina y el colorante Sirius estaban disponibles en China Pharmaceutical Group Shanghai Chemical Reagent Co. Ltd. (Shanghai, China). El polvo de aceite rojo O se compró a Sigma-Aldrich Chemical Company (St Louis, MO, EE. UU.).

Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR)

Los tejidos aórticos se agregaron al reactivo de extracción de ARN total Trizol (Invitrogen, Carlsbad, California, EE. UU.) Y luego se homogeneizaron para extraer el ARN total y el ADN complementario compuesto. Todos los cebadores estaban referenciados a la secuencia proporcionada por Genbank, diseñado por Primer 5.0 y sintetizado por Shanghai Sangon Biotechnology Co. Ltd. MiR-342-5p:forward:5′-CGGAGGGGTGCTATCTGTGATTGAG-3 ′, los cebadores inversos eran cebadores universales de kit (Qiagen empresa, Hilden, Alemania); Wnt3a:directo:5'-AGGTAAGCTACTCCCTCAACTA-3 ', inverso:5'-CTGAAGCACCCTCTCATGTATC-3'; β-actina:directo:5'-GCACCACACCTTCTACAATGAGC -3 ', inverso:5'-TCGTTGCCAATAGTGATGACC-3'; β-catenina:directa:5′-TCAAGAGAGCAAGCTCATCATTCT-3 ′, inversa:5′-CACCTTCAGCACTCTGCTTGTG-3 ′. Después de la reacción, el ciclo umbral (Ct) se analizó por computadora. La relación relativa de miR-342-5p a U6 se utilizó como expresión, la relación relativa de Wnt3a a β-actina se utilizó como expresión y la relación relativa se calculó mediante 2 ^−ΔΔCt método.

Análisis de Western Blot

La proteína total se extrajo de los tejidos aórticos. La concentración de proteína se midió mediante el método del ácido bicinconínico. Se realizó electroforesis en gel de poliacrilamida. Luego, la proteína se transfirió a la membrana de fluoruro de polivinilideno y se obtuvo la banda diana. La membrana se selló en leche desnatada al 5% durante 1 h, se le añadió anticuerpos primarios Wnt3a (1:500), β-catenina (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, EE. UU.), CD34 (1 :2500, Abcam, MA, EE. UU.) Y β-actina (1:2000, Beyotime Biotechnology Co., Shanghai, China) a 4 ° C durante la noche. La membrana se lavó con solución salina tamponada con Tris con Tween 20 (pH =7,5, Tris-HCl 10 mmol / L, NaCl 100 mmol / L y Tween-20 al 0,2%) durante 10 min x 3 veces, y luego se añadió el anticuerpo secundario (1:1000, ZSGB-Bio, Beijing, China) durante 2 h. Se adoptó el software ImageJ para evaluar el valor gris de las bandas y cuantificar la expresión de proteínas.

Tinción inmunohistoquímica

Se colocaron rodajas de 4-5 µm en los portaobjetos recubiertos con 100 mg / L de polilisina y se fijaron con acetona. La peroxidasa endógena fue bloqueada por albúmina de suero bovino. Los tejidos se gotearon con anticuerpo MOMA-2 (1:200), α-SMA (1:200) y CD34 (1:200, Abcam Inc., Cambridge, MA, EE. UU.) Y se agregaron con una solución de trabajo de anticuerpo secundario ( 1:1000). Los tejidos se desarrollaron con diaminobencidina, se contratiñeron con hematoxilina (1 min), se deshidrataron, aclararon, sellaron y observaron al microscopio. Se seleccionaron tres campos visuales diferentes para cada sección inmunohistoquímica. Se realizó el software IPP6.0 para análisis cuantitativo. La tinción inmunohistoquímica positiva de MOMA-2 y α-SMA, respectivamente, indica que los macrófagos y las células del músculo liso se encuentran principalmente en el citoplasma, que es de color amarillo a marrón. Los porcentajes de macrófagos y células de músculo liso se calcularon por separado, que se combinaron con el porcentaje de lípidos y colágeno en la placa para calcular el índice de vulnerabilidad de la placa. El índice de vulnerabilidad de la placa =(porcentaje positivo de macrófagos + porcentaje positivo de lípidos) / (porcentaje positivo de colágeno + porcentaje positivo de células de músculo liso) [20]. La densidad de microvasos (MVD) se evaluó midiendo la expresión de CD34 y se cuantificó como el número de microvasos / mm ² .

Ensayo génico indicador de luciferasa dual

El gen diana de miR-342-5p fue analizado por el sitio web de predicción biológica (http://www.microRNA.org). Se utilizó el ensayo del gen indicador de luciferasa dual para verificar si Wnt3a era el gen diana de miR-342-5p. La secuencia de tipo salvaje o mutante de la región 3 'sin traducir de Wnt3a (3'-UTR) se clonó en el vector GP-miRGLO (GenePharma, Shanghai, China). El indicador (0,5 μg) y 1, 10 o 100 pM de miR-342-5p de agomir se transfectaron en células endoteliales aórticas de ratón (No. 506, MingzhouBio, Ningbo, China) durante 48 h para probar la actividad luciferasa utilizando un sistema de ensayo de luciferasa dual (Promega, WI, EE. UU.).

Análisis estadístico

Todos los datos fueron interpretados por el software SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, EE. UU.). Los datos de medición se indicaron como media ± desviación estándar. t formuló las disparidades entre dos grupos -prueba, mientras que aquellos entre múltiples grupos por análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. La significación estadística fue establecida por P valor <0.05.

Resultados

MiR-342-5p aumenta y Wnt3a disminuye en los tejidos aórticos de ApoE ^{- / -} ratones y miR-342-5p se dirigen directamente a Wnt3a

Los genes diana de microARN (miARN) están asociados con funciones relacionadas con la aterosclerosis. Se probaron miR-342-5p, Wnt3a y β-catenina en tejidos aórticos de ratones modelo AS mediante RT-qPCR y ensayo de transferencia Western. Se reveló que en relación con el grupo normal, miR-342-5p aumentó mientras que Wnt3a y β-catenina disminuyeron en el grupo AS (ambos P <0,05). En comparación con el grupo NC, miR-342-5p mejoró y Wnt3a y β-catenina disminuyeron en el grupo miR-342-5p agomir (ambos P <0.05), mientras que miR-342-5p disminuyó, Wnt3a y β-catenina aumentaron en el grupo de miR-342-5p antagomir (ambos P <0,05). La expresión de Wnt3a y β-catenina aumentó en el grupo oe-Wnt3a en relación con el grupo NC (ambos P <0,05). En comparación con el grupo agomir miR-342-5p, la expresión de Wnt3a y β-catenina aumentó en el grupo miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a ( P <0.05) (Fig. 1A – D). Además, en el experimento preliminar, se probó la expresión de β-catenina bajo el tratamiento de diferentes concentraciones de miR-342-5p agomir, miR-342-5p antagomir y oe-Wnt3a y se mostraron los resultados (Archivo adicional 1:Fig. S1 ) cuanto mayor sea la concentración de agomir de miR-342-5p, menor será la expresión de β-catenina; cuanto mayor es la concentración de miR-342-5p antagomir, mayor es la expresión de β-catenina; y cuanto mayor sea la concentración de oe-Wnt3a, mayor será la expresión de β-catenina.

miR-342-5p aumenta y Wnt3a disminuye en los tejidos aórticos de ApoE ^{- / -} ratones y miR-342-5p se dirige directamente a Wnt3a. A Expresión de miR-342-5p en tejido aórtico de ratones detectada por RT-qPCR. B Expresión de ARNm de Wnt3a en tejido aórtico de ratones detectado por RT-qPCR ( n =12). C , D Expresión de la proteína Wnt3a y β-catenina en tejidos aórticos de ratones analizados mediante análisis de transferencia Western ( n =12). E Sitio de unión de miR-342-5p dentro de Wnt3a 3′-UTR. F miR-342-5p agomir disminuyó de manera dependiente de la dosis la actividad relativa en las células transfectadas con Wnt3a 3′-UTR ( N =3). G Actividad relativa de luciferasa en células con Wnt3a 3′-UTR de tipo salvaje y mutante después de la transfección con miR-342-5p agomir o scramble ( N =3). * P <0.05 en comparación con el grupo normal, ^# P <0,05 frente al grupo NC. & P <0,05 frente al grupo agomir miR-342-5p. Los datos de medición se indicaron como media ± desviación estándar. t formuló las comparaciones entre dos grupos -prueba, mientras que las comparaciones entre múltiples grupos se evaluaron mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. AS, aterosclerosis; NC, control negativo

Los miARN podrían inhibir la traducción de genes específicos al unirse a su ARN mensajero 3'UTR. El sitio web de bioinformática predijo que había una relación objetivo entre miR-342-5p y Wnt3a (Fig. 1E). El ensayo del gen indicador de luciferasa dual informó que en las células endoteliales aórticas de ratón transfectadas con el vector Wnt3a 3'UTR, el valor de luciferasa de luciferasa en renilla / luciérnaga disminuyó de manera dosis-dependiente por transfección con miR-342-5p agomir, con una disminución significativa de 10 a 100 pM miR-342-5p agomir y se produjo una disminución del 64% en el grupo de miR-342-5p agomir 100 pM en comparación con el grupo NC. Esto indicó la presencia de un sitio diana miR-342-5p en el Wnt3a 3'UTR. Sin embargo, el valor de renilla / luciérnaga de la actividad luciferasa no se vio afectado en el grupo de mutación Wnt3a (Fig. 1F, G). Por lo tanto, se pudo confirmar que Wnt3a era un gen diana directo de miR-342-5p, y miR-342-5p / Wnt3a podría regular la progresión de la EA.

Efectos de Wnt3a regulado al alza o miR-342-5p regulado a la baja en los niveles de lípidos en ApoE ^{- / -} Ratones

Además, para investigar si miR-342-5p dirigiendo y regulando la vía de señalización de Wnt3a afectaría los niveles de lípidos de los ratones AS, se utilizó un analizador bioquímico automático para observar el cambio de los niveles de lípidos. Los resultados revelaron que (Fig. 2A-D) en contraste con el grupo normal, los contenidos de CT, TG y LDL-C aumentaron y el contenido de HDL-C disminuyó en el grupo AS (todos P <0,05). En comparación con el grupo NC, los contenidos de TC, TG y LDL-C aumentaron y el contenido de HDL-C disminuyó en el grupo de agomir miR-342-5p (todos P <0,05), mientras que los contenidos de TC, TG y LDL-C disminuyeron y el contenido de HDL-C aumentó en el grupo de miR-342-5p antagomir y el grupo oe-Wnt3a (todos P <0,05). En relación con el grupo miR-342-5p agomir, los contenidos de TC, TG y LDL-C se redujeron y el contenido de HDL-C aumentó en el grupo miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a (todos P <0,05). Estos resultados sugirieron que miR-342-5p y Wnt3a regulaban el nivel de lípidos en sangre de ratones AS e ilustraron además la relación de regulación dirigida entre miR-342-5p y Wnt3a. La sobreexpresión de Wnt3a revertiría los efectos inducidos por miR-342-5p sobreexpresado en ratones AS.

Efectos de Wnt3a regulado al alza o miR-342-5p regulado a la baja sobre los niveles de lípidos en ApoE ^{- / -} ratones. A Comparación del contenido de HDL-C en suero de grupo de ratones. B Comparación del contenido de LDL-C en suero de grupo de ratones. C Comparación del contenido de TG en suero de grupo de ratones. D Comparación de los contenidos de TC en el suero de un grupo de ratones. n =12. * P <0.05 en comparación con el grupo normal, ^# P <0,05 frente al grupo NC. & P <0,05 frente al grupo agomir miR-342-5p. Los datos de medición se indicaron como media ± desviación estándar. Las comparaciones entre varios grupos se evaluaron mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. AS, aterosclerosis; NC, control negativo

Efectos de la sobreexpresión de Wnt3a o la baja expresión de miR-342-5p sobre citocinas inflamatorias y oxidativas relacionadas con el estrés en suero de ApoE ^{- / -} Ratones

Luego, el contenido de citocinas en el suero de ratones AS se evaluó mediante ELISA, y los resultados informaron que (Fig. 3A-D) versus el grupo normal, IL-5, IL-12p70, IFN-γ y TNF-α mejoraron en el grupo AS (todos P <0,05). Frente al grupo NC, los contenidos de IL-5, IL-12p70, IFN-γ y TNF-α se elevaron en el grupo agomir miR-342-5p (todos P <0.05), mientras que los contenidos de IL-5, IL-12p70, IFN-γ y TNF-α se degradaron en el grupo antagomir de miR-342-5p y en el grupo oe-Wnt3a (todos P <0,05). En contraste con el grupo agomir miR-342-5p, los contenidos de IL-5, IL-12p70, IFN-γ y TNF-α disminuyeron en el grupo miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a (todos P <0,05). Se insinuó que la regulación dirigida a miR-342-5p de la vía de señalización de Wnt3a regulaba aún más el nivel de citocinas relacionadas en el suero de ratones AS.

Efectos de la sobreexpresión de Wnt3a o la baja expresión de miR-342-5p sobre citocinas relacionadas con el estrés oxidativo e inflamatorio en suero de ApoE ^{- / -} ratones. A Comparación del contenido de IL-5 en suero de un grupo de ratones. B Comparación del contenido de IL-12p70 en suero de grupo de ratones. C Comparación de los contenidos de IFN-γ en suero de un grupo de ratones. D Comparación del contenido de TNF-α en suero de grupo de ratones. E, Comparación del contenido de MDA en el suero del grupo de ratones. F Comparación de la actividad de SOD en suero de grupo de ratones. n =12. * P <0.05 en comparación con el grupo normal, ^# P <0,05 frente al grupo NC. & P <0,05 frente al grupo agomir miR-342-5p. Los datos de medición se indicaron como media ± desviación estándar. Las comparaciones entre varios grupos se evaluaron mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. AS, aterosclerosis; NC, control negativo

Además, se evaluó el contenido de MDA y la actividad de SOD en suero de ratones, y se reveló que (Fig.3E, F) en comparación con el grupo normal, el contenido de MDA aumentó y la actividad de SOD se redujo en el grupo de AS (ambos P <0,05). En comparación con el grupo NC, el contenido de MDA mejoró y la actividad de SOD disminuyó en el grupo de agomir miR-342-5p (ambos P <0.05), mientras que el contenido de MDA disminuyó y la actividad de SOD aumentó en el grupo de miR-342-5p antagomir y el grupo de oe-Wnt3a (todos P <0,05). En comparación con el grupo miR-342-5p agomir, el contenido de MDA se redujo y la actividad de SOD mejoró en el grupo miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a (ambos P <0,05). Por lo tanto, se obtuvo un resumen de que el agotamiento de miR-342-5p y la restauración de Wnt3a inhibían el estrés oxidativo en ratones AS.

Efectos del agotamiento de miR-342-5p o la restauración de Wnt3a en el contenido de lípidos y colágeno en la placa aórtica de ApoE ^{- / -} Ratones

Para explorar el efecto de Wnt3a dirigido a miR-342-5p en el área de la placa en el tejido aórtico de ratones, se realizó tinción HE y los resultados revelaron que (Fig.4A, B) excepto en el grupo normal, se formaron placas AS en todos secciones de los otros grupos. En el grupo de EA, el área de la placa era grande, la capa fibrosa era más delgada, el núcleo de lípidos estaba agrandado, aparecieron más células espumosas y precipitación de cristales de colesterol en la placa, la pared interna de la arteria y la capa muscular se espesaron y la placa se inestable. La situación en el grupo NC fue similar a la del grupo AS. En el antagomir miR-342-5p y el grupo oe-Wnt3a, el área de la placa era pequeña, la íntima de la arteria era lisa y los casquetes fibrosos tenían un número reducido y se volvían más delgados. No hubo ruptura, sino células espumosas de diferentes tamaños en la placa. El cristal de colesterol se distribuyó asimétricamente y se calcificó parcialmente, aumentó el número de células de músculo liso y fibras de colágeno y la placa tendió a ser estable. En comparación con el grupo NC, el área de la placa aumentó y las lesiones de AS se agravaron en el grupo de agomir miR-342-5p ( P <0.05) mientras que el área de la placa disminuyó en el grupo de miR-342-5p antagomir y el grupo de oe-Wnt3a con lesiones reducidas de AS (ambas P <0,05). En comparación con el grupo miR-342-5p agomir, el área de la placa disminuyó en el grupo miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a ( P <0.05).

Efectos del agotamiento de miR-342-5p o la restauración de Wnt3a sobre el contenido de lípidos y colágeno en la placa aórtica de ApoE ^{- / -} ratones. A Resultados de la tinción HE aórtica en ratones (barra de escala:50 μm). B Comparación del área de placa aórtica en cada grupo de ratones. C Resultados de la tinción aórtica con aceite rojo O en todos los grupos de ratones (barra de escala:100 μm). D Comparación del contenido de lípidos en tejido aórtico de ratones. E Resultados de la tinción aórtica con rojo Sirius en cada grupo de ratones (barra de escala:50 μm). F Comparación del contenido de colágeno en tejidos aórticos de ratones. n =12. ^# P <0,05 frente al grupo NC. & P <0,05 frente al grupo agomir miR-342-5p. Los datos de medición se indicaron como media ± desviación estándar. Las comparaciones entre varios grupos se evaluaron mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. AS, aterosclerosis; NC, control negativo

Se adoptaron tinciones con rojo aceite O y rojo Sirius para detectar el efecto de Wnt3a dirigido a miR-342-5p sobre el contenido de lípidos y el contenido de colágeno en la placa de tejido aórtico de ratones, y los resultados demostraron que (Fig. 4C-F) Aceite rojo La tinción O mostró grasa roja y núcleo azul, mientras que la tinción roja Sirio mostró fibras de colágeno rojas y núcleo azul. En comparación con el grupo NC, el contenido de lípidos se elevó y el contenido de colágeno se redujo en el grupo de miR-342-5p agomir, así como el contenido de lípidos se redujo y el contenido de colágeno se acumuló en el grupo de miR-342-5p antagomir y el oe-Wnt3a. grupo (todos P <0,05). Con respecto al grupo miR-342-5p agomir, el contenido de lípidos disminuyó y el contenido de colágeno se elevó en el grupo miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a (ambos P <0,05). Los resultados experimentales ilustraron completamente que la regulación dirigida de miR-342-5p de la vía de señalización de Wnt3a tuvo un efecto regulador sobre el contenido de lípidos y colágeno en la placa aórtica de ratones AS.

Efectos de miR-342-5p regulado a la baja o Wnt3a regulado a la baja en macrófagos y células del músculo liso en la placa aórtica de ApoE ^{- / -} Ratones

El grado de EA es directamente proporcional al contenido de macrófagos mononucleares [21]. Las CMLV son las células principales de la capa media de las arterias y son esenciales para mantener la integridad de la pared arterial. Las CMLV participan en la reconstrucción de la pared arterial y desempeñan un papel importante en la EA en diversas etapas [22]. La α-SMA es un marcador específico de las células del músculo liso [23]. En este estudio, se utilizó un anticuerpo marcador de macrófagos (MOMA-2) para marcar los macrófagos, y se aplicó inmunohistoquímica para detectar la expresión de MOMA-2 y α-SMA, respectivamente.

Bajo el microscopio, la tinción inmunohistoquímica positiva de MOMA-2 y α-SMA, respectivamente, indica que los macrófagos y las células del músculo liso se encuentran principalmente en el citoplasma, que es de amarillo a marrón. El positivo inmunitario MOMA-2 indicó que los macrófagos se localizaban principalmente en el citoplasma con amarillo a marrón. Determinado por inmunohistoquímica, se manifestó que en comparación con el grupo NC, el porcentaje de tinción positiva de macrófagos en placa (MAMO-2) aumentó y el porcentaje de células de músculo liso positivas disminuyó en el agomir miR-342-5p (ambos P <0,05). El porcentaje de tinción positiva de macrófagos en placa (MAMO-2) se redujo y el porcentaje de células de músculo liso positivas aumentó en el grupo de antagomir de miR-342-5p y en el grupo de oe-Wnt3a (todos P <0,05). En comparación con el grupo miR-342-5p agomir, el porcentaje de tinción positiva de macrófagos en placa (MAMO-2) se redujo y el porcentaje de células musculares lisas positivas aumentó en el grupo miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a (ambos P <0.05) (Fig. 5A – D). Se dio a entender que la regulación dirigida por miR-342-5p de la vía de señalización de Wnt3a podría regular la agregación de macrófagos y células de músculo liso en placas de tejido arterial de ratones AS.

Efectos de la alta expresión de Wnt3a o la mala expresión de miR-342-5p sobre la vulnerabilidad de la placa aórtica de ApoE ^{- / -} ratones. A Tinción inmunohistoquímica de MOMA-2 en cada grupo de ratones (barra de escala:50 μm). B Análisis cuantitativo de la figura A. C Tinción inmunohistoquímica de α-SMA en cada grupo de ratones (barra de escala:50 μm). D Análisis cuantitativo de la figura C . E Comparación del índice de vulnerabilidad a la placa en tejidos aórticos de ratones AS. n =12. ^# P <0,05 frente al grupo NC. & P <0,05 frente al grupo agomir miR-342-5p. Los datos de medición se indicaron como media ± desviación estándar. Las comparaciones entre varios grupos se evaluaron mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. AS, aterosclerosis; NC, control negativo

Efectos de la alta expresión de Wnt3a o la mala expresión de miR-342-5p en la vulnerabilidad de la placa aórtica de ApoE ^{- / -} Ratones

Se calculó el índice de vulnerabilidad de la placa:(porcentaje positivo de macrófagos + porcentaje positivo de lípidos) / (porcentaje positivo de células de músculo liso + porcentaje positivo de colágeno). En relación con el grupo NC, el índice de vulnerabilidad de la placa se elevó en el grupo agomir miR-342-5p ( P <0,05) y disminuyó en el grupo de miR-342-5p antagomir y en el grupo de oe-Wnt3a (ambos P <0,05). En comparación con el grupo miR-342-5p agomir, el índice de vulnerabilidad de la placa disminuyó en el grupo miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a ( P <0,05) (figura 5E). Brevemente, miR-342-5p se dirigió a la regulación de la vulnerabilidad de las placas mediada por la vía de señalización Wnt3a en los tejidos arteriales de los ratones AS.

Efectos de la baja expresión de miR-342-5p o la sobreexpresión de Wnt3a en la angiogénesis en la placa aórtica de ApoE ^{- / -} Ratones

Los anticuerpos contra el marcador de células endoteliales CD34 pueden detectar la densidad de los vasos sanguíneos [24]. Por inmunohistoquímica y Western blot. En comparación con el grupo NC, MVD aumentó en el grupo agomir miR-342-5p y se atenuó en el grupo antagomir miR-342-5p y el grupo oe-Wnt3a (todos P <0,05). En comparación con el grupo miR-342-5p agomir, MVD disminuyó en el grupo miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a ( P <0.05) (Fig. 6A-C). Colectivamente, miR-342-5p dirigiendo y regulando la vía de señalización de Wnt3a participó directamente en la regulación de la densidad de neovascularización en placas de ratones AS.

Efectos de la baja expresión de miR-342-5p o la sobreexpresión de Wnt3a en MVD en la placa aórtica de ApoE ^{- / -} ratones. A Tinción inmunohistoquímica de CD34 en cada grupo de ApoE ^{- / -} ratones (barra de escala:50 μm). B Comparación de MVD en placa aórtica en ApoE ^{- / -} ratones. C Comparación de la expresión de la proteína CD34 en ApoE ^{- / -} ratones. n =12. ^# P <0,05 frente al grupo NC. & P <0,05 frente al grupo agomir miR-342-5p. Los datos de medición se indicaron como media ± desviación estándar. Las comparaciones entre varios grupos se evaluaron mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. AS, aterosclerosis; NC, control negativo

Discusión

La EA es una enfermedad impredecible que implica formas de inflamación crónica y remodelación vascular, y es la principal causa de mortalidad y morbilidad a nivel mundial [25]. Un estudio anterior ha discutido que miR-342-5p está implicado en la regulación de la progresión de la EA [26]. Además, se reflejó que la vía Wnt participa en la facilitación de la aparición y el desarrollo de EA diabético [27]. Como los mecanismos relacionados de miR-342-5p y Wnt3a en AS aún no se han excavado, nuestro estudio fue investigar el efecto de Wnt3a dirigido a miR-342-5p sobre la formación de placa vulnerable y la angiogénesis de AS.

Nuestro estudio reveló que miR-342-5p altamente expresado y Wnt3a poco expresado se encontraron en tejidos aórticos de ratones AS. Un estudio ha presentado que el miR-342-5p derivado de macrófagos aumenta drásticamente en las lesiones ateroscleróticas tempranas en ApoE ^{- / -} ratones [13]. Otro estudio ha presentado que miR-342-5p está notablemente elevado en pacientes con fibrilación auricular [28]. Se ha informado que la deficiencia de Wnt3a daña irreversiblemente la autorrenovación de las células madre hematopoyéticas y da como resultado defectos en la diferenciación de las células progenitoras [29]. Un estudio ha demostrado que el agotamiento de Wnt3a conduce a una función cardíaca defectuosa [30]. Se ha revelado que la expresión de Wnt3a en el hipocampo de ratones con enfermedad de Alzheimer está notablemente disminuida [31]. Otro resultado de nuestro estudio es que Wnt3a fue dirigido directamente por miR-342-5p en ratones AS. Se ha informado que miR-342-5p puede apuntar al 3'-UTR de Wnt3a y regular negativamente su expresión [14].

Además, nuestro estudio ha sugerido que los contenidos de TC, TG, LDL-C, IL-5, IL-12p70, IFN-γ, TNF-α y MDA aumentaron en suero, y que el contenido de HDL-C y la actividad de SOD disminuyeron. Además, se mejoraron el área de la placa, el contenido de lípidos, el contenido de colágeno y la MVD, así como la expresión de MOMA-2 y la expresión de α-SMA disminuyó en ratones AS. El IFN-γ es una citoquina soluble con muchas funciones, que incluyen actividades antifibrosis, antiproliferación, inmunomodulación, apoptosis y antivirales [32]. Se ha revelado que el tratamiento con glutamina aumenta notablemente la actividad de SOD y reduce el contenido de MDA, así como aumenta los niveles de proteína Wnt3a en la enfermedad de Alzheimer [31]. Un estudio ha revelado que los niveles plasmáticos de TC, TG y LDL-C están notablemente elevados y el HDL-C está notablemente reducido en la EA [33]. Un estudio ha informado que la suplementación con TEMPOL, que tiene un valor para suprimir los trastornos metabólicos y aumentar la estabilidad de la placa aterosclerótica, mejora el contenido de colágeno de la placa y reduce el contenido de lípidos [34]. Zhou y col. señaló que los tratamientos con OPCRR reducen drásticamente los perfiles de lípidos séricos, incluidos TC, TG y LDL-C, y aumentan el HDL-C, también disminuyen el contenido de MDA como producto de la peroxidación de lípidos y, además, disminuyen los niveles séricos de TNF-α en AS [35]. Se ha presentado que las muestras ateroscleróticas obviamente han reducido la expresión de α-SMA [36]. Un estudio ha presentado que la MVD elevada se encuentra en las aortas enfermas y especialmente en la rotura de la placa aterosclerótica [37]. Además, nuestro estudio reveló que la mala expresión de miR-342-5p y la sobreexpresión de Wnt3a disminuyeron los niveles de lípidos, el contenido de citocinas, la respuesta al estrés oxidativo, el área de placa y el contenido de lípidos, así como un mayor contenido de colágeno, la expresión de MOMA-2 agotada y la restauración de α. -Expresión de AMS en tejidos aórticos en ratones AS. Se ha sugerido previamente que miR-342-5p se relaciona positivamente con los niveles séricos de LDL-C y TNF-α y tiene una correlación inversa con el HDL-C en pacientes con enfermedad de las arterias coronarias (EAC) [12]. Otro estudio ha verificado que el agotamiento de miR-342-5p inhibe AS [13]. Además, un experimento ha demostrado que el nivel sérico bajo de Wnt1 está relacionado con TG y LDL-C elevados en pacientes prematuros con CAD [38]. Además, un estudio ha demostrado que Wnt3a regulado al alza, contenido mejorado de SOD y contenido reducido de MDA se encuentran en los grupos de curcumina en ratas con enfermedad de Parkinson [39].

Conclusión

En resumen, nuestro estudio descubrió por primera vez el mecanismo del eje miR-342-5p / Wnt3 en AS y reveló que el agotamiento de miR-342-5p podría reducir la formación de placa vulnerable y la angiogénesis en ratones AS mediante la restauración de Wnt3a, que puede ser un candidato potencial para el tratamiento de AS (archivo adicional 2:Fig. S2). El miR-342-5p puede tener un efecto sinérgico con otros miARN en la enfermedad vascular aterosclerótica, pero debido a limitaciones de tiempo y financiación, no llevamos a cabo más discusiones relevantes, lo que también es una limitación de este estudio.

Disponibilidad de datos y materiales

Las contribuciones originales presentadas en el estudio se incluyen en el artículo / Material complementario, y las consultas adicionales pueden dirigirse al autor correspondiente.

Abreviaturas

miR-342-5p:

MicroARN-342-5p

A:

Aterosclerosis

α-SMA:

α-actina del músculo liso

MVD:

Densidad de microvasos

miARN:

MicroARN

oe:

Sobreexpresión

NC:

Control negativo

PBS:

Solución salina tamponada con fosfato

TC:

Colesterol total

TG:

Triglicéridos

LDL-C:

Colesterol de lipoproteínas de baja densidad

HDL-C:

Colesterol de lipoproteínas de alta densidad

ELISA:

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

IL:

Interleucina

TNF-α:

Factor de necrosis tumoral alfa

IFN:

Interferón

MDA:

Malondialdeyde

SOD:

Superóxido dismutasa

RT-qPCR:

Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa

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