Nec-1 mitiga la neurotoxicidad inducida por nanopartículas de dióxido de titanio en células SH-SY5Y mediante modulación de RIP1

Resumen

Los nanomateriales de dióxido de titanio se aplican en numerosos campos debido a sus espléndidas características fisicoquímicas, lo que a su vez plantea una amenaza potencial para la salud humana. Recientemente, numerosos estudios in vivo han revelado que las nanopartículas de dióxido de titanio (TNPs) pueden transportarse al cerebro animal tras exposición por diversas rutas. Las TNPs absorbidas pueden acumularse en el cerebro y perturbar células neuronales, llevando a disfunción cerebral. Estudios in vitro verificaron la neurotoxicidad de TNPs. Los mecanismos subyacentes a la neurotoxicidad de TNPs permanecen sin clarificar. Si la necroptosis está involucrada en la neurotoxicidad de TNPs es desconocido. Por tanto, realizamos un estudio in vitro y encontramos que TNPs indujeron lesión inflamatoria en células SH-SY5Y de manera dependiente de dosis, lo que fue mitigado por pretratamiento con necrostatin-1 (Nec-1). Dado que la quinasa 1 de proteína interactiva con receptor (RIP1) se reporta como diana de Nec-1, la silenciamos mediante siRNA. Expusimos células mutantes y silvestres a TNPs y evaluamos lesión inflamatoria. Silenciar expresión de RIP1 inhibió lesión inflamatoria inducida por exposición a TNPs. En conjunto, Nec-1 ameliora la neurotoxicidad de TNPs a través de RIP1. Sin embargo, más estudios deben realizarse para evaluar comprehensivamente la correlación entre neurotoxicidad de TNPs y RIP1.

Introducción

Debido a sus espléndidas propiedades fisicoquímicas, los nanomateriales de dióxido de titanio se sintetizan y usan ampliamente para diversos propósitos, como cosméticos, campos industriales y áreas médicas. Sin embargo, este uso generalizado puede plantear una gran amenaza para la salud humana. Una vez expuestos, la mayoría de TNPs entra al cuerpo humano por inhalación e ingestión. El sistema respiratorio, digestivo y cardiovascular todos pueden ser interrumpidos por TNPs absorbidas. Similarmente, el cerebro, como parte más importante del sistema nervioso central, también puede ser perturbado, ya que TNPs en circulación pueden penetrar la barrera hematoencefálica, y NPs inhalados podrían transportarse al cerebro vía vía olfativa. Una vez que TNPs entran al cerebro, pueden acumularse allí y causar daño cerebral, llevando a disfunciones. El daño cerebral es usualmente irreversible y severo, por lo que cualquier causa potencial de daño debe investigarse.

Aunque ningún estudio epidemiológico ha explorado asociación entre exposición a TNPs y enfermedades cerebrales, abundantes estudios in vivo e in vitro han confirmado neurotoxicidad de TNPs. Además, el foco principal ha sido investigar mecanismos subyacentes. Para este propósito, revisamos previamente mecanismos moleculares conocidos de neurotoxicidad de TNPs y encontramos que procesos de muerte celular programada (PCD), como apoptosis y autofagia, estaban implicados en neurotoxicidad de TNPs.

La necroptosis, también llamada necrosis regulada, es otro tipo de PCD. A diferencia de apoptosis que es dependiente de caspasas, la necroptosis es dependiente de quinasa 1/3 de proteína interactiva con receptor (RIP1/RIP3). RIP1 activado recluta RIP3 para formar un necrosoma, que activa proteína de dominio quinasa de linaje mixto (MLKL) para iniciar necroptosis. La necroptosis puede regular muerte celular y neuroinflamación, ambas involucradas en neurotoxicidad de TNPs. Por tanto, hipotetizamos que la necroptosis está implicada en neurotoxicidad causada por TNPs.

Para probar nuestra hipótesis, realizamos estudio in vitro para explorar papel de necroptosis en neurotoxicidad de TNPs. En este estudio, viabilidad celular, fuga de LDH y citocinas inflamatorias (TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8) se midieron tras exposición a TNPs. Primero, células SH-SY5Y se cultivaron con varias concentraciones de TNPs. Segundo, células se expusieron a TNPs con o sin Nec-1, potente inhibidor de necroptosis. Tercero, expresión génica de RIP1, que puede ser suprimida por Nec-1, se silenció usando siRNA, tras lo cual células mutantes y silvestres se trataron con TNPs. Este estudio arroja luz sobre comprensión comprehensiva de mecanismos moleculares subyacentes a neurotoxicidad de TNPs.

Resultados

TNPs inhiben viabilidad celular

Para verificar citotoxicidad de TNPs en células SH-SY5Y, primero evaluamos viabilidad celular usando ensayo CCK8. Células se cultivaron con concentraciones de TNPs de 5 a 160 μg/mL durante 24, 48 y 72 h. Como se muestra en Fig. 1, viabilidad celular permaneció sin cambios en células tratadas con 5, 10, 20 y 40 μg/mL tras 24 h de exposición. Cuando células se trataron por 48 y 72 h, viabilidad permaneció sin cambios solo en grupo 5 μg/mL (p = 0,4507 a 48 h y p = 0,1002 a 72 h). Además, viabilidad celular fue dramáticamente menor en células tratadas con 80 μg/mL TNPs tras 48 (p = 0,0007) y 72 h (p = 0,0008). Basado en esos resultados, concluimos que TNPs disminuyeron viabilidad celular de manera dependiente de dosis y tiempo (datos no mostrados), indicando que exposición a largo plazo fue más tóxica.

TNPs dañan integridad de membrana

Luego, analizamos efectos tóxicos de TNPs en integridad de membrana tras 72 h de exposición. Integridad de membrana se evaluó midiendo fuga de LDH. Como se muestra en Fig. 1b, niveles de LDH aumentaron significativamente en células tratadas con TNPs a dosis superiores a 5 μg/mL. Aumento de producción de LDH se observó en células tratadas con 40, 80 y 160 μg/mL (p < 0,0001). Estos resultados sugirieron que TNPs aumentaron niveles de LDH de manera dependiente de dosis, similar a ensayo CCK8.

Exposición a TNPs promueve inflamación

La respuesta inflamatoria tras exposición a TNPs se analizó usando ELISA. Tras tratar células con varias concentraciones de TNPs por 72 h, se midieron niveles de TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-8. Como se muestra en Fig. 2, secreción de IL-8 se reguló al alza en todas las células tratadas con TNPs; niveles de TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-8 se elevaron uniformemente en células tratadas con dosis superiores a 5 μg/mL (p < 0,01). Además, inflamación fue significativamente mayor en grupo tratado con dosis superiores a 10 μg/mL (p < 0,0001). En conjunto, TNPs aumentaron inflamación de manera dependiente de dosis.

Nuestros resultados indicaron que TNPs indujeron lesión inflamatoria de manera dependiente de dosis. Adoptamos concentración de TNPs de 80 μg/mL y período de exposición de 72 h en siguientes experimentos para explorar papel de necroptosis en neurotoxicidad de TNPs.

Co-tratamiento con Nec-1 inhibe neurotoxicidad de TNPs

Para analizar papel de necroptosis en lesión inflamatoria, co-tratamos células con Nec-1 (inhibidor de necroptosis) y TNPs. Como se muestra en Fig. 3a, células SH-SY5Y se expusieron a TNPs o TNPs+Nec-1 (1, 5, 10, 15 o 20 μM), y encontramos que Nec-1 amelioró dramáticamente reducción de viabilidad celular inducida por TNPs (10, 15, 20 μM) (p < 0,0001). Como viabilidad celular en grupos tratados con 15 μM y 20 μM no fue mayor que en grupos tratados con 10 μM (p = 0,6643 y p = 0,6292), co-tratamos células con 10 μM Nec-1 para analizar efecto en integridad de membrana.

Tras cultivar células con TNPs o TNPs + Nec-1, encontramos que niveles de LDH en grupo TNPs + Nec-1 fueron mucho menores que en grupo TNPs solo (p = 0,0005). Además, tratamiento con Nec-1 solo no aumentó fuga de LDH (p = 0,9878).

Conclusivamente, 10 μM Nec-1 pudo inhibir eficazmente citotoxicidad de TNPs y no fue tóxico para células.

Para analizar capacidad antiinflamatoria de Nec-1, células se cultivaron con TNPs o TNPs + Nec-1. Como se muestra en Fig. 4, producción de TNF-α (p = 0,003), IL-1β (p = 0,0013), IL-6 (p < 0,0001) e IL-8 (p = 0,0004) fue significativamente menor en grupo TNPs + Nec-1 que en grupo TNPs.

Esos resultados implican que Nec-1 puede mitigar respuestas inflamatorias inducidas por exposición a TNPs.

Silenciamiento de RIP1 mitiga lesión inflamatoria inducida por TNPs

Para determinar si Nec-1 abrogó lesión inflamatoria inducida por TNPs a través de RIP1, silenciámos eficazmente expresión de RIP1 de células usando siRNA (Fig. 5, p < 0,0001). Luego, lesión inflamatoria tras exposición a TNPs en células mutantes y silvestres se midió. Figura 6a demuestra que viabilidad celular en grupo TNPs + si-RIP1 fue notablemente mayor que en grupo TNPs + si-NC (p = 0,0002). Producción de LDH (Fig. 6b, p < 0,0001) y niveles de TNF-α (p < 0,0001), IL-1β (p = 0,0001), IL-6 (p < 0,0001) e IL-8 (p = 0,0001) (Fig. 7) en grupo TNPs + si-RIP1 fueron dramáticamente menores que en grupo TNPs + si-NC. Estos resultados indicaron que TNPs promovieron lesión inflamatoria a través de RIP1.

Discusión

En este estudio, encontramos que exposición a TNPs indujo citotoxicidad en células SH-SY5Y de manera dependiente de dosis y que la necroptosis estuvo involucrada en neurotoxicidad de TNPs. Para explorar papel de necroptosis, expusimos células a TNPs con o sin Nec-1 (potente inhibidor de necroptosis), y medimos viabilidad celular, fuga de LDH y niveles de citocinas inflamatorias. Nuestros datos sugieren que co-tratamiento con Nec-1 puede mitigar lesión inflamatoria inducida por TNPs. Dado que estudios han mostrado que Nec-1 ejerce sus efectos suprimiendo actividad de RIP1, transfectamos células con si-RIP1 para determinar si RIP1 estaba involucrado en efectos protectores de Nec-1. Células mutantes y silvestres se trataron con TNPs, y se evaluó lesión inflamatoria. Esto indicó que viabilidad celular en grupo si-RIP1 fue mayor que en grupo si-NC, y niveles de fuga LDH y citocinas inflamatorias fueron menores en grupo si-RIP1 que en grupo si-NC tras exposición a TNPs. En conclusión, el presente estudio reveló por primera vez que la necroptosis está involucrada en lesión inflamatoria inducida por TNPs en células.

Reconfirmamos neurotoxicidad de TNPs en nuestro estudio in vitro. Tras exponer células SH-SY5Y a varias concentraciones de TNPs por varios tiempos de incubación, viabilidad celular se evaluó usando ensayo CCK8. Como se muestra en Fig. 1a, exposición a TNPs redujo viabilidad celular de manera dependiente de dosis; tras 48 h y 72 h exposición, viabilidad en grupos 80 y 160 TNPs disminuyó dramáticamente comparado con grupo control (p < 0,001). Para confirmar más citotoxicidad, también medimos fuga LDH. Datos en Fig. 1b revelaron que producción LDH aumentó de manera dependiente de dosis tras 72 h exposición, y niveles LDH en grupos 40, 80 y 160 fueron notablemente mayores que grupo control (p < 0,0001). Dado que estudios previos mostraron que neuroinflamación puede ser promovida por exposición a TNPs, también se midieron niveles de TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-8. Figura 2 ilustra que niveles de esas cuatro citocinas inflamatorias fueron significativamente regulados al alza comparado con grupo control y dramáticamente mayores en grupos tratados con 20 a 160 μg/mL (p < 0,0001). En conjunto, nuestros resultados indicaron que TNPs pudieron inducir neurotoxicidad de manera dependiente de dosis, consistente con estudios previos. TNPs pueden ser absorbidas por células neuronales e inhibir proliferación. Además, exposición a TNPs puede disminuir viabilidad celular y promover fuga LDH de manera dependiente de dosis.

Co-tratamos células con Nec-1 para clarificar si necroptosis estaba involucrada en neurotoxicidad causada por TNPs. Tras tratar células con concentraciones indicadas de TNPs con o sin Nec-1, se evaluaron viabilidad celular, fuga LDH e inflamación. Figura 3a muestra que reducción en viabilidad tras exposición a TNPs fue significativamente inhibida por co-tratamiento con 10 μM Nec-1. Mientras tanto, Fig. 3b reveló que tratamiento con 10 μM Nec-1 no aumentó niveles LDH, y niveles LDH en células tratadas con grupo TNPs + Nec-1 fueron dramáticamente menores que en grupo TNPs solo. Luego, medimos efectos de co-tratamiento con Nec-1 en inflamación inducida por TNPs. Figura 4 ilustra que niveles de TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-8 fueron notablemente menores en células tratadas con TNPs + Nec-1. Estos resultados reverificaron que Nec-1 pudo proteger células de muerte y procesos inflamatorios.

Finalmente, dado que RIP1 es diana de Nec-1, evaluamos si RIP1 pudo regular neurotoxicidad de TNPs. Construimos células mutantes silenciando expresión de RIP1 (Fig. 5). Datos de Fig. 6 y Fig. 7 revelaron que tras exposición a TNPs, viabilidad celular fue mayor, y niveles de LDH, TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-8 fueron menores en grupo si-RIP1 que en si-NC, sugiriendo que TNPs promueven citotoxicidad a través de RIP1. Asimismo, varios estudios han descubierto que RIP1 puede regular tanto muerte celular como procesos inflamatorios.

Aunque reportamos por primera vez que Nec-1 puede mitigar neurotoxicidad de TNPs suprimiendo vía de señalización de necroptosis, nuestro estudio tiene algunas limitaciones. Primero, citotoxicidad de materiales nano-difiere de sus contrapartes a granel y podría ser largamente influenciada por propiedades superficiales, lo que puede explicar resultado contrario de aumento de viabilidad celular encontrado por Sebastián et al. Por tanto, es esencial evaluar comprehensivamente nanotoxicidad en sujetos desde múltiples aspectos, como proliferación celular, integridad de membrana, estrés oxidativo, inflamación, función mitocondrial, ciclo celular, citoesqueleto y epigenética. Segundo, RIP1 puede reclutar RIP3 para formar necrosoma funcional, activador vital de MLKL, para iniciar necroptosis. Hipotetizamos que RIP3/MLKL podrían estar involucrados en neurotoxicidad de TNPs, lo que debe explorarse en trabajos futuros. Además, asociaciones de RIP3/MLKL con neurotoxicidad de TNPs también deben evaluarse. Tercero, especies reactivas del oxígeno (ROS), como mecanismos principales subyacentes a neurotoxicidad de TNPs, se reportaron como señal upstream de RIP1. Por tanto, si ROS son upstream de RIP1 en neurotoxicidad de TNPs debe discutirse más. Cuarto, células deben exponerse a concentraciones no tóxicas (TNPs < 5 μg/mL) por período largo (más de 72 h) para evaluar citotoxicidad crónica. Quinto, debemos evaluar papel de necroptosis en neurotoxicidad de TNPs en más líneas celulares neuronales y células neuronales primarias humanas y animales.

Conclusiones

Nuestro estudio reveló necroptosis como otro mecanismo de muerte celular programada involucrado en neurotoxicidad causada por TNPs. En este estudio, encontramos que TNPs pudieron inducir lesión inflamatoria en células SH-SY5Y de manera dependiente de dosis y que co-tratamiento con Nec-1 (potente inhibidor de necroptosis) pudo ameliorar esos efectos dañinos. RIP1, diana de Nec-1, fue silenciado por si-RNA, lo que mitigó eficazmente lesión inflamatoria inducida por exposición a TNPs. En conclusión, Nec-1 inhibió lesión inflamatoria de células SH-SY5Y inducida por exposición a TNPs al dirigirse a vía RIP1. Las vías de señalización upstream y downstream de RIP1 involucradas en neurotoxicidad de TNPs deben evaluarse más.

Materiales y Métodos

Preparación de TNPs y cultivo celular

Previamente caracterizamos TNPs y las preparamos según nuestro procedimiento publicado previamente. Brevemente, TNPs se disolvieron en RPMI 1640 a varias concentraciones de 5, 10, 20, 40, 80 y 160 μg/mL. La solución TNP se esterilizó y sonificó (300 W, 10 min) a temperatura ambiente para mantener partículas de agregarse antes del tratamiento. Células en medio de cultivo no expuestas a TNPs sirvieron como grupo control. Células SH-SY5Y, compradas del Banco de Células del Instituto de Ciencias de la Vida de Shanghái, Academia China de Ciencias, se cultivaron en medio RPMI 1640 (HyClone, Logan, UT, EE. UU.) suplementado con 10 % suero fetal bovino (Gibco, línea de producto de Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.), 100 U/mL penicilina y 100 μg/mL estreptomicina a 37 °C en incubadora humificada con 5 % CO₂.

Ensayo de viabilidad celular y fuga LDH

Viabilidad celular se midió usando kit de conteo celular-8 (CCK8. Dojindo, cat no.CK04). Brevemente, 1 × 10⁴ células SH-SY5Y se colocaron en placa de 96 pozos y cultivaron en incubadora a 37 °C (5 % CO₂) por 24 h antes de exposición a TNPs. Luego, células se incubaron con TNPs a varias concentraciones (0, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40 y 80 μg/mL) por otras 24 h. Tras tratamiento, células se incubaron con CCK-8 por otras 2 h. Luego, densidad óptica (OD) se midió a 450 nm colocando placa de 96 pozos en lector de microplacas (BioTek, Winooski, VT, EE. UU.). Viabilidad celular de cada grupo, expresada como porcentaje, se calculó como (ODtratado−ODblanco)/(ODcontrol − ODblanco) × 100 %.

Integridad de membrana se midió por kit comercial (Instituto de Bioingeniería de Nanjing, China). Tras exponer células SH-SY5Y a varias concentraciones de TNPs por 72 h, secreción LDH se analizó según instrucciones del fabricante.

Respuesta inflamatoria

ELISA se aplicó para medir niveles de TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-8 producidos por células SH-SY5Y. Brevemente, células SH-SY5Y se expusieron a TNPs por 72 h, y sobrenadante se recogió para análisis según instrucciones del fabricante (Elabscience Biotechnology Co., Ltd.).

Transfección siRNA

Siguiendo protocolo del fabricante, concentración de 100 nM de si-RIP1 o siRNA de control negativo (si-NC) se transfirió a células usando Lipofectamine 2000. Eficiencia de silenciamiento génico por siRNA se estimó con PCR en tiempo real.

PCR en tiempo real

ARN de células expuestas a varias concentraciones de TNPs se aisló usando kit RNAqueous (Ambion Inc., Austin, TX, EE. UU.) basado en instrucciones del fabricante. Expresión relativa de RIP1 se midió por PCR en tiempo real. Niveles relativos de mRNA de RIP1 se normalizaron a expresiones de β-actina.

Análisis estadístico

Software SPSS 11.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE. UU.) se usó para analizar datos. Análisis de varianza de un sentido se usó para comparar medias de grupos. p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Disponibilidad de Datos y Materiales

Disponible desde el manuscrito.

Abreviaturas

TNPs:

Nanopartículas de dióxido de titanio

Nec-1:

Necrostatin-1

RIP:

Quinasa de proteína interactiva con receptor

MLKL:

Proteína de dominio quinasa de linaje mixto

ROS:

Especies reactivas del oxígeno