Nec-1 atenúa la neurotoxicidad inducida por nanomateriales de dióxido de titanio en células Sh-Sy5y a través de RIP1

Discusión

En este estudio, encontramos que la exposición a los TNP inducía la citotoxicidad en las células SH-SY5Y de una manera dependiente de la dosis y que la necroptosis estaba implicada en la neurotoxicidad de los TNP. Para explorar el papel de la necroptosis, expusimos las células a TNP con o sin Nec-1 (un potente inhibidor de la necroptosis) [17, 18], y medimos la viabilidad celular, la pérdida de LDH y los niveles de citocinas inflamatorias. Nuestros datos sugieren que el co-tratamiento con Nec-1 puede mitigar la lesión inflamatoria inducida por los TNP. Dado que los estudios han demostrado que Nec-1 ejerce sus efectos suprimiendo la actividad de RIP1, transfectamos células con si-RIP1 para determinar si RIP1 estaba involucrado en los efectos protectores de Nec-1. Se trataron células mutantes y de tipo salvaje con TNP y se evaluó la lesión inflamatoria. Esto indicó que la viabilidad celular en el grupo si-RIP1 fue mayor que en el grupo si-NC, y los niveles de fuga de LDH y citocinas inflamatorias fueron más bajos en el grupo si-RIP1 que en el grupo si-NC después de la exposición a TNP. . En conclusión, el presente estudio reveló por primera vez que la necroptosis está involucrada en la lesión inflamatoria inducida por TNP en las células.

Reconfirmamos la neurotoxicidad de los TNP en nuestro estudio in vitro. Después de que las células SH-SY5Y se expusieran a diversas concentraciones de TNP durante varios tiempos de incubación, se evaluó la viabilidad celular usando el ensayo CCK8. Como se muestra en la Fig. 1a, la exposición a los TNP redujo la viabilidad celular de una manera dependiente de la dosis; después de 48 hy 72 h de exposición, la viabilidad celular en los grupos de 80 y 160 TNP disminuyó drásticamente en comparación con el grupo de control ( p <0,001). Para confirmar aún más la citotoxicidad, también medimos la fuga de LDH. Los datos de la Figura 1b revelaron que la producción de LDH aumentó de manera dependiente de la dosis después de 72 h de exposición, y los niveles de LDH en los grupos 40, 80 y 160 fueron notablemente más altos que en el grupo de control ( p <0,0001). Debido a que estudios previos han demostrado que la exposición a los TNPs puede promover la neuroinflamación [19], también se midieron los niveles de TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-8. La Figura 2 ilustra que los niveles de esas cuatro citocinas inflamatorias se regularon significativamente al alza en comparación con el grupo de control y fueron dramáticamente más altos en los grupos tratados con 20 a 160 μg / mL ( p <0,0001). Tomados en conjunto, nuestros resultados indicaron que los TNP podrían inducir neurotoxicidad de una manera dependiente de la dosis, lo que es consistente con estudios previos. Los TNP pueden ser absorbidos por células neuronales e inhibir la proliferación [20, 21, 22]. Además, la exposición a los TNP puede disminuir la viabilidad celular y promover la fuga de LDH de una manera dependiente de la dosis [23,24,25,26,27].

Co-tratamos células con Nec-1 para aclarar si la necroptosis estaba involucrada en la neurotoxicidad causada por los TNP. Después de que las células se trataron con las concentraciones indicadas de TNP con o sin Nec-1, se evaluaron la viabilidad celular, la pérdida de LDH y la inflamación. La Figura 3a muestra que la reducción de la viabilidad celular después de la exposición a los TNP se inhibió significativamente mediante el tratamiento conjunto con Nec-1 10 µM. Mientras tanto, la Fig. 3b reveló que el tratamiento con 10 µM de Nec-1 no aumentó los niveles de LDH, y los niveles de LDH en las células tratadas con TNPs + Nec-1 fueron dramáticamente más bajos que en el grupo de TNPs solos. A continuación, medimos los efectos del co-tratamiento con Nec-1 sobre la inflamación inducida por los TNP. La Figura 4 ilustra que los niveles de TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-8 fueron notablemente más bajos en las células tratadas con TNP + Nec-1. Estos resultados volvieron a verificar que Nec-1 podría proteger a las células de la muerte y los procesos inflamatorios [28, 29].

Finalmente, dado que RIP1 es el objetivo de Nec-1, evaluamos si RIP1 podría regular la neurotoxicidad de los TNP. Construimos células mutantes silenciando la expresión de RIP1 (Fig. 5). Los datos de la Fig.6 y la Fig.7 revelaron que después de la exposición a los TNP, la viabilidad celular fue mayor y los niveles de LDH, TNF-α, IL-1β, IL-6 e IL-8 fueron más bajos en el grupo si-RIP1 que que en el si-NC, lo que sugiere que los TNP promueven la citotoxicidad a través de RIP1. Asimismo, varios estudios han descubierto que RIP1 puede regular tanto la muerte celular como los procesos inflamatorios [30, 31].

Aunque informamos por primera vez que Nec-1 puede mitigar la neurotoxicidad de los TNP suprimiendo la vía de señalización de necroptosis, nuestro estudio tiene algunas limitaciones. En primer lugar, la citotoxicidad de los materiales de tamaño nanométrico difiere de sus materiales a granel y podría estar muy influenciada por las propiedades de la superficie [32], lo que puede explicar el resultado contrario del aumento de la viabilidad celular encontrado por Sebastián et al. [33]. Por tanto, es fundamental evaluar de forma exhaustiva la nanotoxicidad en sujetos desde múltiples aspectos, como la proliferación celular, la integridad de las membranas, el estrés oxidativo, la inflamación, la función mitocondrial, el ciclo celular, el citoesqueleto y la epigenética. En segundo lugar, RIP1 puede reclutar RIP3 para formar un necrosoma funcional, un activador vital de MLKL, para iniciar la necroptosis [34]. Presumimos que RIP3 / MLKL podría estar involucrado en la neurotoxicidad de los TNP, lo que debería explorarse en trabajos futuros. Además, también deben evaluarse las asociaciones de RIP3 / MLKL con la neurotoxicidad de los TNP. En tercer lugar, se informó que las especies reactivas de oxígeno (ROS), como los principales mecanismos subyacentes a la neurotoxicidad de los TNP [35, 36], eran la señal aguas arriba de RIP1 [37]. Por lo tanto, debería discutirse más a fondo si las ROS son la cadena arriba de RIP1 en la neurotoxicidad de los TNP. En cuarto lugar, las células deben exponerse a concentraciones no tóxicas (TNP <5 μg / ml) durante un período prolongado (más de 72 h) para evaluar la citotoxicidad crónica. En quinto lugar, debemos evaluar el papel de la necroptosis en la neurotoxicidad de los TNP en más líneas celulares neuronales y células neuronales primarias humanas y animales.