Liposomas pegilados cargados con bufalina:eficacia antitumoral, toxicidad aguda y distribución tisular

Materiales y métodos

Productos químicos y reactivos

Se adquirieron BF y cinobufagin (CBG) de BaoJi Chenguang Technology Development Co., Ltd. (BaoJi, China; 98% de pureza, identificado por HPLC) y se disolvieron en DMSO para su almacenamiento a -20 ° C como soluciones madre. Se utilizó CBG como estándar interno (IS). La doxorrubicina (DOX) se adquirió de Beijing Solarbio Science &Technology Co., Ltd. (Beijing, China; 98% de pureza, identificada por HPLC) y se disolvió en DMSO para su almacenamiento a -20 ° C como soluciones madre. BF / PEG-LP se prepararon en nuestro laboratorio (tamaño de partícula, 155,0 ± 8,46 nm; potencial zeta, - 18,5 ± 4,49 mV; eficiencia de atrapamiento, 76,31% ± 4,23%, detectada por HPLC) [6]. El ácido fórmico de grado HPLC se adquirió de Tedia Company Inc. (Fairfield, OH, EE. UU.). El kit de recuento de células 8 (CCK-8) se adquirió en Dojindo Laboratories (Kumamoto, Japón). El acetato de etilo de grado HPLC se adquirió del Centro de Desarrollo de Reactivos Químicos de Tianjin Kermel (Tianjin, China). El acetonitrilo de grado HPLC se adquirió de Merck (Darmstadt, Alemania). Todos los demás reactivos eran de calidad analítica.

Animales

Ratas macho Sprague-Dawley, con un peso aproximado de 230 a 250 g; Ratones Kunming, que pesan entre 18 y 22 g; y ratones Balb / c desnudos de 6 semanas de edad fueron suministrados por el Centro de Investigación Animal Experimental de la Cuarta Universidad Médica Militar (Xi’an, China). Los animales se mantuvieron por separado en un sistema de jaula ventilada individualmente (IVC) y se alimentaron ad libitum con alimentos de laboratorio estándar y agua durante 5 días. Todos los animales se mantuvieron en ayunas (excepto agua) durante la noche antes de los experimentos. Los procedimientos experimentales que involucran animales fueron revisados ​​y aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de la Cuarta Universidad Médica Militar (Aprobación 2017-0603-R).

Preparación de muestras estándar

Las curvas de calibración se prepararon añadiendo 100 μL de homogeneizado de tejido con 20 μL de cada una de las soluciones de trabajo para producir muestras que contenían 20, 50, 200, 500 y 2000 ng / mL de BF. Las muestras de homogeneizado estándar enriquecidas se prepararon de antemano y se evaluaron con cada lote analítico de muestras desconocidas.

Seguridad de los liposomas

Prueba de hemólisis de glóbulos rojos

Se recogieron ocho mililitros de sangre de ratas y posteriormente se heparinizaron y diluyeron con 10 ml de solución salina normal al 0,9%. A continuación, las muestras de sangre total se mezclaron con 100 μL de solución BF o 1 mL de suspensión BF / PEG-LP. Después de 40 min de inmersión en un baño de agua mantenido a 37 ° C, las muestras se centrifugaron a 750 g durante 5 min para eliminar los glóbulos rojos y fragmentos de los mismos. El sobrenadante se precipitó en 2 ml de solución de etanol / ácido clorhídrico (39:1; etanol al 99% ( v / v ):Ácido clorhídrico al 37% ( p / v )). El sobrenadante se centrifugó a 750 g durante 5 min, después de lo cual se midió la absorbancia a 398 nm mediante un espectrofotómetro UV. Se preparó y midió de la misma manera un control positivo que constaba de agua destilada y un control negativo que constaba de solución salina al 0,9%.

La tasa de hemólisis (HR%) de la suspensión de nanopartículas se calculó de la siguiente manera:

donde A _muestra es la absorbancia de la muestra, A _negativo es la absorbancia del control negativo y A _positivo es la absorbancia del control positivo.

Citotoxicidad de los liposomas en blanco

Se usó CCK-8 para detectar la citotoxicidad de liposomas en blanco en células HepG2 de carcinoma hepatocelular humano y células HCT116 de cáncer de colon humano. Células HepG2 suspendidas y células HCT116 (1 × 10 ⁴ células / pocillo) se inocularon en una placa de 96 pocillos y se cultivaron en medio de cultivo RPMI-1640 hasta la fase logarítmica. Se añadieron al medio de cultivo diferentes concentraciones de liposomas en blanco. Se prepararon seis pocillos replicados para cada concentración. Después de 24 h de incubación, se descartó el medio y se agregaron 100 μL de solución de trabajo CCK-8 (CCK-8:medio de cultivo RPMI-1640, 10:100). Después de 2 h de incubación, la absorbancia se detectó y cuantificó a 450 nm mediante un lector de microplacas (Bio-Rad 680, Hercules, CA, EE. UU.).

Efecto del pH ambiental sobre la estabilidad de los liposomas

Se prepararon BF / PEG-LP mediante hidratación con solución salina tamponada con fosfato (PBS) a pH 7,4 y pH 5,0, respectivamente. Los liposomas se almacenaron a 4 ° C en condiciones de oscuridad. La absorbancia de las muestras a 296 nm se midió a los 0, 5, 15, 30, 60 y 120 min.

Experimento in vitro

La proliferación celular se evaluó mediante el ensayo de proliferación CCK-8. Las células HepG2, HCT116, A549 y U251 se sembraron individualmente a una densidad de 1 × 10 ⁴ células / pocillo en placas de 96 pocillos a 37 ° C con un 5% ( v / v ) CO ₂ . Después de 24 h, se agregaron a los pocillos diferentes concentraciones de BF / PEG-LP. Después de otras 24 h de incubación, se descartó el medio celular y se agregaron 100 μL de solución de trabajo CCK-8. Después de 2 h de incubación, se detectó y cuantificó la absorbancia a 450 nm mediante un lector de microplacas (Bio-Rad 680). El porcentaje de células viables e IC ₅₀ Los valores se estimaron a partir de una curva de respuesta a la dosis. Los valores de cada muestra y control se determinaron mediante el promedio de seis pocillos replicados.

Experimento de xenoinjerto de tumor

Celdas U251 (1 × 10 ⁷ ) en 0,15 ml de PBS se inocularon por vía subcutánea en ratones desnudos y se dejaron crecer durante 7 días para alcanzar un tamaño de tumor de más de 50 mm ³ . Luego, los ratones se dividieron aleatoriamente en dos grupos con seis ratones cada uno. En el grupo de tratamiento, 0,5, 1,0 o 2,0 mg / kg / día de BF o BF / PEG-LP fue i.p. inyectado durante 21 días consecutivos. Se inyectó PBS que contenía DMSO al 0,1% en el grupo de control del vehículo, mientras que en el grupo de control positivo se inyectaron 2 mg / kg de cisplatino (DPP).

El peso corporal de los ratones se midió cada 2 días. Todos los ratones tratados con BF y BF / PEG-LP se observaron cuidadosamente para determinar las condiciones de su piel y cabello, el volumen de ingesta de comida y agua, las características fecales y los cambios de comportamiento. Al final de los experimentos, se sacrificaron los ratones y se extrajeron y pesaron los xenoinjertos tumorales. A continuación, los tumores trasplantados se fijaron en una solución de paraformaldehído al 4% y se incluyeron en parafina. Se prepararon secciones de cinco micras de espesor y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E). El crecimiento y la necrosis de las células tumorales y la infiltración de los tejidos circundantes se observaron bajo microscopía óptica.

Evaluación farmacológica

Comportamiento general y actividades independientes

Cincuenta ratones Kunming se dividieron al azar en cinco grupos ( n =10 por grupo) que fueron i.p. administrado lo siguiente en una sola dosis:solución salina en el volumen administrado al grupo de control, 20 mg / kg de pentobarbital sódico como el grupo de control positivo, y 1.0, 1.5 y 2.0 mg / kg como el bajo, medio y alto -dosis grupos BF / PEG-LP. Luego se observó el comportamiento general, la postura, la marcha, la salivación, la miofibrilación, el nistagmo y las secreciones de los ratones. Después de 1 h de administración, los ratones se colocaron en una caja al aire libre. Se contó el número de ratones que se movían en la caja durante 10 minutos después de que se permitió que los ratones se adaptaran durante 1 minuto.

Pruebas de ejercicio coordinadas

Los ratones se dividieron al azar en cinco grupos ( n =10 por grupo, mitad hombres y mitad mujeres) que fueron i.p. administró lo siguiente:solución salina al volumen administrado al grupo de control en blanco, clorhidrato de clorpromazina 2,5 mg / kg como grupo de control positivo; y 1,0, 1,5 y 2,0 mg / kg BF / PEG-LP como los grupos BF / PEG-LP de dosis baja, media y alta, respectivamente.

Una varilla de metal lisa (diámetro 1,27 cm, longitud 80 cm) se colocó perpendicularmente al suelo y se fijó en la parte inferior para mantenerla erguida. Después de 1 semana de tratamiento, la prueba de escalada se realizó durante 30, 60 y 120 min, respectivamente. Los ratones se colocaron en la parte superior de la varilla de metal y se les permitió arrastrarse hacia abajo de forma natural. Se observó y puntuó la coordinación de los ratones mientras bajaban por la barra de metal. Los criterios de puntuación fueron los siguientes:0 puntos, descenso paso a paso; 1 punto, descenso deslizante; 2 puntos, incapacidad para descender; y 3 puntos, no se observan reflejos.

Toxicidad aguda

La concentración letal mediana (LD ₅₀ ) de BF y BF / PEG-LP se calculó para evaluar la toxicidad aguda. Un total de 110 ratones Kunming (mitad machos y mitad hembras) se dividieron al azar en 11 grupos ( n =10). Cinco grupos recibieron una sola dosis i.v. dosis de BF a 1.0, 0.37, 0.14, 0.05 o 0.02 mg / kg, y cinco grupos recibieron una sola dosis i.v . dosis de BF / PEG-LP a 4.0, 2.83, 2.0, 1.41 o 1.0 mg / kg. El volumen de inyección fue de 0,2 ml. Primero se disolvió BF en solución salina normal con DMSO al 1%; A continuación, se diluyeron BF y BF / PEG-LP con solución salina normal para obtener la concentración deseada. Al grupo de control se le administró solución salina normal que contenía DMSO al 1%. Después del tratamiento, se observó el comportamiento general de los ratones durante 14 días y se registró la tasa de muerte. Los cambios patológicos en los ratones después de i.v . La administración se observó mediante microscopía óptica (NIKON Eclipse ci, Tokio, Japón).

Estudio de distribución de tejidos mediante HPLC

Se asignaron al azar ratas Sprague-Dawley a dos secciones (cuatro grupos en cada sección, n =6 por grupo). Estas dos secciones fueron i.p . administraron 0,5 mg / kg BF y BF / PEG-LP, respectivamente. Se recogieron muestras de los tejidos principales, incluidos el corazón, el hígado, el bazo, los pulmones, los riñones y el cerebro, a los 5, 15, 45 y 90 minutos después de la administración. Las muestras de tejido se enjuagaron rápidamente con solución salina (0,9%), extrayendo la sangre y el contenido según correspondiera. Después de la limpieza, se utilizó papel de filtro para secar las muestras. Las muestras se pesaron y luego se homogeneizaron en solución salina al 0,9% (muestra de tejido a solución salina, 1:2, p / p ). Los homogeneizados obtenidos se almacenaron a -80 ° C hasta su análisis.

Se extrajeron los compuestos objetivo y se eliminó la interferencia de la proteína endógena mediante un método de preparación líquido-líquido [18]. Descubrimos que el acetato de etilo mejoró la recuperación de la extracción y minimizó la interferencia endógena, lo que resultó en una mayor sensibilidad y selectividad de la detección de BF. En consecuencia, se utilizó acetato de etilo como el disolvente óptimo para la preparación de muestras. Se añadieron veinte microlitros de la solución de trabajo de IS a una alícuota de 100 µl de homogeneizado de tejido. Luego, las muestras se mezclaron con vórtex durante 30 sy se extrajeron con 2,5 ml de acetato de etilo durante 2 min. Después de centrifugar a 3500 g durante 10 min, la capa orgánica superior se transfirió a otro tubo y se evaporó a 45 ° C bajo una suave corriente de nitrógeno. El residuo se reconstituyó en 100 μL de fase móvil (acetonitrilo:solución de ácido fórmico al 0,1% / agua, 65:35, v / v ) aunque se agita en vórtex durante 5 min y se centrifuga a 12000 g durante 10 min. Luego, se inyectó una alícuota de 10 μl del sobrenadante en el sistema de HPLC (Waters 2995/2996, Waters Corporation, Milford, MA, EE. UU.). Las condiciones optimizadas del cromatógrafo para la detección de BF e IS se presentaron anteriormente [6].

Análisis estadístico

Todos los resultados se expresaron como media ± DE ( n =3), y las diferencias entre formulaciones se compararon mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA), utilizando el software GraphPad Prism 5. P <0.05 denota importancia en todos los casos.

Resultados y discusión

Propiedades físicas y químicas de BF / PEG-LP

La microscopía electrónica de transmisión (TEM) reveló que BF / PEG-LP tenía una forma esférica uniforme, como se muestra en el archivo adicional 1:Figura S1A. La estructura de BF / PEG-LP fue identificada por FT-IR. Como se muestra en el archivo adicional 1:Figura S1B, los picos característicos a 3495 cm ⁻¹ y 3436 cm ⁻¹ representó la vibración de estiramiento N – H del enlace amida, mientras que el pico a 1079 cm ⁻¹ representó la vibración de estiramiento C – O – C del enlace éter en BF / PEG-LP. Para evaluar la seguridad de las formulaciones in vitro, se determinó la tasa de hemólisis de los liposomas en blanco, BF y BF / PEG-LP mediante una prueba de hemólisis de glóbulos rojos, y se midió la viabilidad celular de las células HepG2 y HCT116 tratadas con liposomas en blanco mediante CCK. -8 ensayo. El grupo BF mostró una hemólisis evidente; sin embargo, la tasa de hemólisis del grupo BF / PEG-LP fue significativamente menor a la misma concentración ( P <0,01). Cuando la concentración de BF / PEG-LP se incrementó a 200 μg / mL, la tasa de hemólisis fue obviamente más alta que la de los liposomas en blanco ( P <0,01, figura 1a). Los resultados del ensayo CCK-8 mostraron que los liposomas en blanco no eran tóxicos en las células HepG2 y HCT116 (Fig. 1b).

Propiedades físicas y químicas de BF / PEG-LP. un Tasa de hemólisis de glóbulos rojos de liposomas en blanco, BF y BF / PEG-LP. Los datos se presentan como \ (\ overline {x} \) ± s ( n =3). ** P <0,01 frente a . Grupo BF / PEG-LP a la misma concentración. b Citotoxicidad de liposomas en blanco en células HepG2 y HCT116. Los datos se presentan como \ (\ overline {x} \) ± s ( n =6). c Estabilidad de BF / PEG-LP en diferentes condiciones de pH. Los datos se presentan como \ (\ overline {x} \) ± s ( n =6). ** P <0,01 frente a . grupo de pH 7,4 en el mismo punto de tiempo. Abreviaturas:BF, bufalin; BF / PEG-LP, liposomas PEGilados cargados con bufalina

El efecto del pH ambiental sobre la estabilidad de BF / PEG-LP se evaluó mediante espectrofotometría UV. La figura 1c muestra que la absorbancia de la muestra del grupo de pH 5,0 aumentó con el tiempo de almacenamiento, lo que indica que BF / PEG-LP era más estable en PBS a pH 7,4 ( P <0.01).

Apoptosis de células tumorales in vitro

La apoptosis en células HepG2, HCT116, A549 y U251 inducida por BF / PEG-LP se determinó mediante el ensayo CCK-8. El IC ₅₀ Los valores de BF / PEG-LP para todas las células ensayadas se presentan en la Tabla 1. BF / PEG-LP disminuyó significativamente la viabilidad de todos los tipos de células de una manera dependiente de la dosis (Fig. 2). El efecto inhibidor de BF / PEG-LP fue similar al de DOX (control positivo, 50 μg / mL) a concentraciones superiores a 40 ng / mL. Además, basado en el IC ₅₀ valores, la sensibilidad de las células a BF / PEG-LP se clasificó de la siguiente manera:HCT116> HepG2> U251> A549.

Citotoxicidad de BF / PEG-LP en HepG2 ( a ), HCT116 ( b ), A549 ( c ) y U251 ( d ) células. Los datos se presentan como \ (\ overline {x} \) ± s ( n =6). * P <0.05, ** P <0,01 frente a . grupo de control para cada línea celular. Abreviaturas:BF / PEG-LP, liposomas PEGilados cargados con bufalina; DOX, doxorrubicina

Evaluación farmacológica general

Después de la administración de BF / PEG-LP, el comportamiento general de los ratones fue diferente al del grupo en blanco. En particular, los ratones del grupo de dosis alta de BF / PEG-LP mostraron temblores y salivación. Después de la administración, los ratones permanecieron en la caja de campo abierto durante 10 minutos y se registró el número de rejillas activas. En el grupo de control positivo (pentobarbital), el número de rejillas activas fue solo 342 ± 35, que fue significativamente menor que en el grupo de control (725 ± 127, P <0,05). Como se muestra en la Fig. 3a, el número de rejillas activas en el grupo de dosis media y alta de BF / PEG-LP fue significativamente diferente del grupo de control. La prueba de escalada de caña mostró que BF / PEG-LP tenía un cierto efecto promotor sobre el movimiento coordinado de los ratones después de una semana de administración en comparación con el del grupo de control ( P <0.01), mientras que la clorpromazina tuvo un efecto promotor significativo en el grupo de control positivo ( P <0.05), como se muestra en la Fig. 3b.

Efecto farmacológico de BF / PEG-LP sobre la actividad locomotora ( a ) y ejercicio coordinado ( b ) en ratones. Los datos se presentan como \ (\ overline {x} \) ± s ( n =10). * P <0.05, * ^* P <0,01 frente a . grupo de control en cada momento; ^# P <0,05 frente al grupo de dosis baja de BF / PEG-LP. Abreviaturas:BF / PEG-LP, liposomas PEGilados cargados con bufalina

Experimento de xenoinjerto de tumor

Con la administración prolongada, los ratones de los grupos de control positivo, BF y BF / PEG-LP mostraron retraso mental, reducción de la ingesta de alimentos, reacción lenta y piel opaca. La muerte del ratón se produjo en los grupos BF y BF / PEG-LP. La tasa de antitumorales del grupo de control positivo fue del 36,5%; el del grupo de dosis altas de BF fue del 27,6%; y la de los grupos de dosis baja, media y alta de BF / PEG-LP fue del 11,4%, 28,9% y 38,7%, respectivamente. Excepto por el grupo de BF de dosis baja, hubo una diferencia significativa entre las tasas de antitumorales de los grupos tratados con el fármaco y el grupo de control negativo ( P <0.05), como se muestra en la Fig. 4a. En comparación con el grupo de dosis baja de BF, la tasa de inhibición tumoral del grupo de dosis alta de BF / PEG-LP fue significativamente mayor ( P <0.01), como se muestra en la Fig. 4b.

Efecto inhibidor de BF y BF / PEG-LP sobre el crecimiento de xenoinjertos de glioma en ratones desnudos. Comparación del peso del tumor ( a ) y tasa de inhibición tumoral ( b ) en cada grupo. Los datos se presentan como \ (\ overline {x} \) ± s ( n =10). * P <0.05, ** P <0,01 frente a grupo de control; ^# P <0.05, ^## P <0,01 frente a . grupo de dosis alta de BF / PEG-LP. c Tinción con H&E de tejidos tumorales de ratones portadores de tumores. Abreviaturas:BF, bufalin; BF / PEG-LP, liposomas PEGilados cargados con bufalina; DPP, cisplatino; H&E, hematoxilina y eosina

Los xenoinjertos en los ratones portadores de tumores tenían forma nodular. La tinción con H&E mostró que en el grupo de control, los núcleos de las células tumorales eran grandes, el citoplasma era pequeño y el crecimiento de las células era vigoroso; en el grupo de dosis alta de BF / PEG-LP, se observó una gran área de tejido tumoral necrótico y el grado de necrosis dependía de la dosis, como se muestra en la Fig. 4c.

Toxicidad aguda

La toxicidad aguda de una sola i.v . Se determinó la dosis de las formulaciones en ratones Kunming. El LD ₅₀ los valores de BF y BF / PEG-LP fueron 0,156 y 3,03 mg / kg, respectivamente. En comparación con la de BF, la toxicidad aguda de BF / PEG-LP fue significativamente menor ( P <0,01); este efecto se atribuyó a la formulación liposomal, que controló la liberación de BF a la sangre.

Los cambios patológicos en los ratones después de i.v . La administración se observó mediante microscopía óptica (Fig. 5). Se observaron cambios patológicos en varios órganos, como el corazón, el hígado y el riñón. La disolución de la fibra del miocardio del corazón y la fractura con sangrado fueron obvias. Se observó necrosis en hepatocitos y endoteliocitos pulmonares.

Cambios patológicos observados en ratones muertos después de la administración intravenosa de 1.0 mg / kg BF y 4.0 mg / kg BF / PEG-LP. Las secciones de tejido se tiñeron con H&E y se observaron mediante microscopía óptica. Notas:Microscopio óptico:NIKON Eclipse ci; Sistema de imágenes:NIKON Digital Sight DS-FI2 (Tokio, Japón); Ampliación:× 200. Abreviaturas:BF, bufalin; BF / PEG-LP, liposomas PEGilados cargados con bufalina; H&E, hematoxilina y eosina

Estudio de distribución de tejidos

La comparación de los cromatogramas del homogeneizado de tejido en blanco y el homogeneizado enriquecido, que indicó que no hubo interferencia significativa en los tiempos de retención de BF y CBG (IS), se utilizó para analizar la selectividad del método, como se muestra en el archivo adicional 1:Figura S2. Las curvas de calibración se construyeron a partir de las relaciones de área de pico de BF a IS (Y) versus concentraciones de homogeneizado de tejido que van desde 20 a 2000 ng / mL, con un coeficiente de correlación R ² > 0,9977 (Tabla 2). Los experimentos de precisión, exactitud y recuperación de BF en muestras biológicas se muestran en el archivo adicional 1:Tabla S1, mientras que los resultados del experimento de estabilidad se muestran en el archivo adicional 1:Tabla S2.

Los datos sin procesar de los experimentos de distribución de tejido se muestran en el archivo adicional 1:Tabla S3. Después de i.v . inyección de BF / PEG-LP, la distribución tisular del mismo está influenciada por varias variables, como la composición, el tamaño de partícula y el potencial zeta [19]. La concentración de BF en varios tejidos, incluidos el corazón, hígado, bazo, pulmón, riñón y cerebro, se cuantificó a los 5, 15, 45 y 90 min, como se muestra en la Fig. 6. A los 45 min después de iv . En la administración, la concentración de BF en ambos grupos fue muy baja en algunos tejidos, como corazón, hígado, bazo, pulmón y riñón, lo que indica que la distribución y eliminación de BF se produjo rápidamente. La concentración de BF en el cerebro, aunque no en otros tejidos, aún podría detectarse a los 90 minutos después de i.v . administración en ambos grupos, lo que indica que la distribución y eliminación de BF fueron relativamente más lentas en el cerebro que en otros tejidos.

Distribución tisular de BF en órganos de rata. A Fórmulas moleculares de bufalina ( a ) y cinobufagin ( b , ES). B Perfiles de distribución tisular de BF en ratas después de una única dosis intravenosa de BF / PEG-LP o BF a 0,5 mg / kg. Los datos se presentan como \ (\ overline {x} \) ± s ( n =6). Abreviaturas:BF, bufalin; BF / PEG-LP, liposomas PEGilados cargados con bufalina; IS, estándar interno

Mientras tanto, se detectó BF 1,20 veces mayor (333 ± 92,5 ng / ga 5 min) en los tejidos cerebrales del grupo BF / PEG-LP en comparación con el del grupo BF. Además, se encontró una mayor concentración de BF en los tejidos del hígado, el bazo y el cerebro en el grupo BF / PEG-LP. Se detectó una acumulación significativa de BF en el hígado, con concentraciones de 187 ± 31,0 ng / g en el grupo BF / PEG-LP y 163 ± 35,0 ng / g en el grupo BF ( P <0,01). En estudios anteriores se observó un fenómeno similar, causado principalmente por un aumento espectacular de la BF en la sangre antes del metabolismo y la excreción [20, 21].

Según los resultados de los experimentos de distribución tisular, el propio BF podría atravesar la BHE, posiblemente debido a su alta solubilidad en lípidos, bajo peso molecular (386,52 g / mol) y estructura química, similar a la del colesterol, con el que comparte la misma estructura nuclear madre. Sin embargo, la aplicación clínica de BF es limitada debido a su alta solubilidad en lípidos y escasa solubilidad en agua. La biodisponibilidad de BF es baja si no se administra en una forma alternativa. En un estudio anterior [6], mostramos que la formulación BF / PEG-LP podría mejorar la solubilidad en agua, extender la duración de la circulación sanguínea, prolongar la vida media y ampliar el alcance de aplicación de BF, incluso para i.v. quimioterapia. En el estudio actual, la administración de BF / PEG-LP resultó en un aumento de la concentración de BF en el cerebro, que se mantuvo durante más tiempo (90 min). Además, hubo una diferencia significativa en la concentración de BF entre los grupos BF y BF / PEG-LP a los 45 min (167,59 ± 54,52 vs. 71,52 ± 48,35 ng / g, P <0.01).

En un estudio anterior, se demostró que la BF ejerce un efecto similar al de la digital en el corazón, aumentando la frecuencia cardíaca y el poder de contracción del miocardio en ratas [22]. Por tanto, la cardiotoxicidad de la BF a grandes dosis puede deberse a su acumulación en el corazón. El experimento de biodistribución en este estudio mostró que la acumulación de BF en el corazón fue menor en el grupo BF / PEG-LP que en el grupo BF (95.0 ± 18.5 vs . 134 ± 17,8 ng / ga 5 min, P <0,01; 15,32 ± 5,56 frente a 63,79 ± 28,21 ng / ga 15 min, P <0,01). Si la toxicidad cardíaca puede atenuarse con una dosis más baja de BF requiere una verificación adicional. Nevertheless, the antitumor effect of BF was sufficiently strong in this study (the IC₅₀ values for glioma cells were nanomolar). For in vivo application, it is critical to decrease the toxicity (especially heart toxicity) and increase the water solubility of BF, which was our focus in this study.

In general, PEGylated liposomes are considered to have no or low immunogenicity. However, according to recent studies, when PEGylated liposomes were repeatedly injected into the same animal, an immune response was triggered [23]. In fact, a second injection of PEGylated liposomes resulted in reduced blood circulation time and increased hepatic and splenic accumulation, which is known as the accelerated blood clearance (ABC) phenomenon. Such immunogenicity of PEGylated liposomes presents major challenges in the research of liposomal formulations and their clinical application. However, liposomal formulations that do not display the ABC phenomenon have been reported, such as a long-circulating DOX-loaded liposomal formulation (Doxil, Sequus pharmaceuticals, Inc., San Francisco, CA, USA), which has been commercialized. DOX was released from the liposomes and entered the spleen, damaging spleen cells and thereby reducing the production of anti-PEG IgM, which could selectively bind with PEG on the surface of the liposomes administered at the second injection. Whether BF/PEG-LP exhibits the ABC phenomenon remains unknown and requires further study. If so, mitigating the ABC phenomenon will require in-depth investigation.

Conclusion

In the present study, we evaluated hemolysis induced by BF/PEG-LP and the cytotoxicity of blank liposomes to verify the safety thereof. Moreover, the effect of environmental pH on the release of BF from liposomes was investigated to assess the stability of BF/PEG-LP. BF encapsulation in a liposomal suspension might affect its antitumor activity in vitro and in vivo and general behavior, acute toxicity, and tissue distribution in vivo. Nonetheless, we believe that the development of the liposomal formulation described in this study has laid a foundation for the future clinical application of BF. Intensive investigation of the relevance of the ABC phenomenon to BF/PEG-LP is warranted in the future.

Disponibilidad de datos y materiales

All data generated or analyzed during this study are included in this published article and its supplementary information files.

Abreviaturas

ABC:

Accelerated blood clearance

AIE:

The aggregation-induced emission

BBB:

Barrera hematoencefálica

BF:

Bufalin

BF/PEG-LP:

Bufalin-loaded PEGylated liposomes

CBG:

Cinobufagin

CCK-8:

Kit de conteo de células 8

IC₅₀ :

Half-maximal inhibitory concentration

i.p.:

Intraperitoneally

IS:

Internal standard

i.v. :

Intravenously

LD₅₀ :

Median lethal concentration

PBS:

Solución salina tamponada con fosfato

RBC:

Red blood cell

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