Una nanopartícula magnética de doble objetivo para la detección del cáncer en humanos

Materiales y método

Condiciones de cultivo celular y línea celular

La línea celular de cáncer de colon (HT29), que se adquirió del banco de células ATCC, se cultivó a 37 ° C en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (Gibco, Grand Island, NY, EE. UU.) Que contiene un 10% de suero bovino fetal ( Gibco, Grand Island, NY, EE. UU.), 100 U / mL de penicilina y 100 μg / mL de estreptomicina, bajo 5% de CO ₂ .

Modelo animal experimental

Se compraron cuarenta ratones hembra NOD / SCID (4-6 semanas de edad) de la Compañía de Tecnología Animal de Laboratorio de Beijing Vital River (Beijing, China). Las células HT29 cultivadas en fase logarítmica se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Después de digerirlas con tripsina, las células se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 min. Luego, las células se resuspendieron en PBS y la concentración celular se ajustó a 2 x 10 ⁷ / mL. A cada ratón se le inyectaron 200 μL de suspensión celular. Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad Médica de Guangxi (Guangxi, China).

Preparación y caracterización de Fe ₃ O ₄ @ Nanoprobes magnéticos de doble anticuerpo KCTS-LECs

El quitosano (Xi’an Ruixi Biotechnology) se carboxiló con ácido α-cetoglutárico para obtener α-cetoglutarato carboximetil quitosano (KCTS) rico en grupos CO en su superficie [19]. Fe ₃ O ₄ (Biotecnología de Xi'an Ruixi) se utilizó como núcleo y KCTS se estableció como la estructura básica del esqueleto. Después de activar Fe ₃ O ₄ nanopartículas con carbodiimida, Fe ₃ O ₄ @KCTS se formó combinando el enlace covalente de KCTS-COOH y superficie-OH. Los anticuerpos LEC seleccionados fueron específicamente contra el anticuerpo humano conjugado con LYVE-1 APC (R&D Systems®, Cat. No. FAB20892A) y el anticuerpo anti-podoplanina (FITC) (Abcam, Cat. No. ab205333). Estos anticuerpos se reticularon covalentemente a Fe ₃ carboxilado O ₄ @KCTS usando EDC / NHS activado. En consecuencia, las nanosensas magnéticas modificadas con anticuerpos dobles LEC, denominados Fe ₃ O ₄ Se obtuvieron nanosondas magnéticas de doble anticuerpo KCTS-LECs (0,1 mg / ml). Las nanopartículas conjugadas con doble anticuerpo se conservaron en la oscuridad a 4 ° C.

La morfología y distribución de tamaño del Fe ₃ preparado O ₄ @ KCTS-LECs-Se evaluaron nanopartículas magnéticas de doble anticuerpo utilizando un microscopio electrónico de transmisión (TEM; H-7650, Japón). El tamaño de partícula (tamaño), el potencial zeta y el índice de dispersión de partículas (PDI) del Fe ₃ O ₄ El anticuerpo @ KCTS-Double se midió mediante dispersión de luz dinámica (DLS; PRO3000, Japón) y su fotoluminiscencia se midió con un espectrofotómetro de fluorescencia (FL-7000, Perkin Elmer, EE. UU.).

Inmunohistoquímica e inmunofluorescencia

Se prepararon secciones de tejido congeladas y se pusieron en acetona con hielo durante 10 min y luego se sumergieron en una solución de PBS durante 10 min. Después de bloquear en BSA al 1% y lavar tres veces con PBS, las secciones se incubaron con anticuerpo conjugado con APC LYVE-1 humano y anticuerpo anti-podoplanina (FITC) a 4 ° C durante 30 min. Después de la incubación, las secciones se sumergieron tres veces en solución de PBS, después de lo cual se añadió una solución de tinción 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) al tejido tumoral para cubrir completamente los tejidos. Las secciones se incubaron nuevamente durante 5 min a temperatura ambiente. A continuación, se lavaron tres veces con PBS, seguido de la adición de un agente de extinción anti-fluorescencia cuando las secciones estaban completamente secas. Finalmente, las secciones se montaron en un cubreobjetos y se observaron bajo un microscopio confocal (Nikon DS-Ri1; Nikon, Tokio, Japón).

Los tejidos de cáncer de colon conservados en formalina se incluyeron en parafina para este estudio. Se bloquearon secciones desparafinados de xenoinjertos de cáncer HT29 con peróxido de hidrógeno al 3%, se bloquearon en suero normal al 5% y se incubaron con anticuerpo anti-LYVE-1 (Abcam, ab10278, Reino Unido) durante la noche a 4ºC. A continuación, el anticuerpo secundario de cabra anti-conejo IgG H&L (HRP) marcado con biotina (ab205718) en el reactivo de marcaje de superstreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante se incubó durante 30 min. El color se midió con una solución de 3,3′-diaminobencidina (DAB).

Purificación celular

El volumen medio de los tumores fue de aproximadamente 1,5 × 1 × 1 cm ³ . Antes de extirpar los tumores, los ratones se desinfectaron sumergiéndolos en etanol al 75% durante 3-5 min. La piel de los ratones desinfectados se cortó con tijeras estériles y pinzas estériles en un banco limpio. El tejido tumoral se extirpó cuidadosamente y se colocó en una placa de Petri que contenía PBS. El tejido tumoral empapado se cortó luego con tijeras oftálmicas y se colocó en una placa estéril. El tejido triturado se pipeteó en un tubo de centrífuga de 50 ml utilizando un tubo pasteurizado. Luego se añadió al tubo tres veces el volumen de colagenasa I y se agitó con vórtex durante 10 minutos para obtener una mezcla de colagenasa I-tejido tumoral. Luego, la mezcla se colocó en un baño de agua a 37 ° C durante 20 min y esto se repitió cinco veces. Al final de la digestión, se detuvo la colagenasa I añadiendo un medio completo y se dejó reposar la mezcla durante 2 min. Después de la centrifugación a 300 g durante 10 min, los tumores se lavaron dos veces con PBS, luego se resuspendieron en 10 mL de PBS y se filtraron lentamente a través de un tamiz con un tamaño de poro de 75 μm (malla 200). Las células filtradas se contaron, se promediaron en dos tubos de centrífuga de 15 ml, se resuspendieron en PBS, luego se centrifugaron a 300 g durante 10 min y luego se lavaron tres veces. (1) Método de clasificación de perlas magnéticas MACS:las células lavadas se resuspendieron en 100 μl de tampón. Se preparó una solución que contenía PBS pH 7,2, 0,5% de BSA y EDTA 2 mM diluyendo la solución madre de MACS BSA (n. ° de catálogo 130-091-376) a 1:20 con solución de enjuague automático MACS ™ (n. ° de cat. 130 -091-222). A continuación, se añadieron 10 μL de anticuerpo conjugado con APC LYVE-1 humano y luego se incubaron a 4 ° C durante 15 min en la oscuridad. Finalmente, se lavó tres veces con 2 mL de solución tampón. Después de la centrifugación, se agregaron 80 μL de solución tampón para resuspender las células y se agregaron 20 μL de solución de perlas magnéticas de fluoresceína anti-APC. La mezcla se incubó durante 15 min, se lavó tres veces, luego se centrifugó y se mezcló bien con 300 μL de solución tampón. Finalmente, las células positivas en la columna se derribaron rápidamente con 3 ml de solución tampón. Las células resultantes se cultivaron en una placa de seis pocillos. (2) Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-método de clasificación de nanopartículas magnéticas de doble anticuerpo:las células lavadas se resuspendieron en 200 μL de tampón, mezclado con Fe ₃ O ₄ @ Nanopartículas magnéticas de doble anticuerpo KCTS-LECs, incubadas a 4 ° C durante 20 min en la oscuridad, luego lavadas tres veces con 4 mL de tampón, centrifugadas y resuspendidas en 160 μL de tampón. Finalmente, las células se eluyeron con un imán y se cultivaron en una placa de 6 pocillos.

Inmunofluorescencia de células clasificadas por diferentes métodos

Las células clasificadas mediante diferentes métodos de clasificación se ajustaron a una concentración celular de 5 × 10 ⁴ / mL con PBS y distribuir uniformemente en una placa de 12 pocillos. Se añadió un mililitro de la suspensión celular a cada pocillo y luego se cultivó a 37 ° C durante 24 h en CO ₂ al 5%. rodeando. A continuación, se desechó el medio antiguo y las células se lavaron tres veces con solución de PBS. Luego, se agregaron 200 μL de paraformaldehído al 4% a cada pocillo y las células se mantuvieron a temperatura ambiente durante 10 min. Después, las células se lavaron tres veces con solución de PBS, se añadieron anticuerpo conjugado con APC LYVE-1 humano y anticuerpo anti-podoplanina (FITC). Después de la incubación en la oscuridad a 4 ° C durante 2 h, las células se lavaron tres veces. Además, se agregaron 50 μL de DAPI a cada pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos para teñir los núcleos de azul, seguido de tres lavados con PBS. Por último, el extintor anti-fluorescencia se dejó caer en el centro del portaobjetos y el lado cubierto de células se colocó en un portaobjetos de vidrio y se observó con un microscopio confocal de barrido láser.

Citometría de flujo de células clasificadas por diferentes métodos

Las células clasificadas mediante diferentes métodos se resuspendieron con anticuerpo humano conjugado con LYVE-1 APC y anticuerpo anti-podoplanina (FITC) en 200 μL de tampón de unión (HEPES / NaOH 10 mM, pH 7,4, NaCl 140 mM, CaCl 2,5 mM). y se incubó a 4 ° C durante 1 h en la oscuridad, luego se lavó tres veces con PBS. Las células se detectaron y analizaron con citometría de flujo (BD Accury6; Becton Dickinson, San José, CA, EE. UU.) Y luego se analizaron con el software FlowJo (Tree Star Inc., Ashland, Oregón, EE. UU.).

Detección de actividad de LECs

Se recolectaron, digirieron y contaron células en fase de crecimiento logarítmico clasificadas por diferentes métodos. La concentración celular se ajustó a 2 × 10 ⁵ células / mL y 50 μL de estas células se agregaron en cada pocillo de una placa de portaobjetos μ recubierta con Matrigel y se incubaron en un 5% de CO ₂ incubadora a 37 ° C durante 6 h. El medio se separó y se desechó con un gotero pasteurizado seguido de la adición de una solución de PBS que contenía 1 µg / ml de calceína AM (Invitrogen, Cat. No. c3099). Después, las células se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h en la oscuridad, se lavaron con PBS y se fotografiaron bajo un microscopio (Nikon, Japón). A partir de entonces, 1 × 10 ⁵ las células se mezclaron con 500 μL de medio completo que contenía 20 μg / mL de DiI-ac-LDL (Molecular Probes, Invitrogen) y luego se inocularon en una placa de 24 pocillos a 37 ° C durante 4 h. La vieja solución de cultivo se eliminó y las células se lavaron tres veces en PBS. Luego, se agregaron 50 μL de solución de DAPI a cada pocillo y se incubaron durante 10 min a temperatura ambiente para teñir los núcleos de azul. Después de lavar tres veces con PBS, finalmente se obtuvieron imágenes bajo un microscopio.

Imágenes de fluorescencia y resonancia magnética in vivo

Se siguieron los siguientes pasos para determinar si el tumor estaba dirigido por Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-nanopartículas magnéticas de doble anticuerpo en animales. Se utilizó el modelo de xenoinjerto subcutáneo de cáncer de colon de ratón NOD / SCID para exploración por resonancia magnética o fluorescencia. Se realizaron imágenes ponderadas en T2 en una condición específica que incluía campo de visión (80 × 80 mm), tiempo de eco (69 ms) y grosor de capa (2,0 mm) utilizando un escáner de resonancia magnética 3.0T (Discovery 750, gE, alemania) , que tiene una bobina de volumen de ratón de 40 mm de diámetro. Los ratones NOD / SCID se dividieron en dos grupos ( n =3); el grupo experimental y el grupo de bloqueo del receptor. A todos los ratones se les inyectó Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-anticuerpo doble (0,5 mmol / kg) nanopartículas magnéticas a través de la vena de la cola. Cada ratón se escaneó en cuatro momentos específicos:antes de la inyección, 0,5 h, 12 h y 24 h después de la inyección. En el grupo de bloqueo del receptor, a cada ratón se le inyectó anticuerpo Anti-LYVE-1 (Abeam, ab10278, Reino Unido) y anticuerpo anti-podoplanina (Abcam, ab10288, Reino Unido) antes de la inyección con Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-anticuerpo doble. Las exploraciones de resonancia magnética se llevaron a cabo en los mismos cuatro puntos de tiempo. Se tomaron imágenes de fluorescencia utilizando el sistema de imágenes in vivo de animales pequeños (Bruker, EE. UU.). Los puntos de tiempo para la agrupación, la inyección de drogas y el escaneo fueron los mencionados anteriormente.

Toxicidad del Fe ₃ O ₄ @ Nanoprobe magnética de anticuerpo doble KCTS-LECs

Toxicidad del Fe ₃ O ₄ Se evaluó la nano sonda magnética de doble anticuerpo KCTS-LECs contra las LEC mediante el ensayo CCK-8. Células (100 μL de medio, 2 × 10 ⁵ / mL) se cultivaron durante la noche en placas de 96 pocillos a 37 ° C en atmósfera humanizada que contenía 5% de CO ₂ , luego tratado con Fe ₃ O ₄ @ Nanosonda magnética de doble anticuerpo KCTS-LECs (0,1, 0,5, 1,0, 2,0 mg / ml) durante 24 o 48 h en las mismas condiciones. Después de la incubación, se agregaron 10 μL de solución de CCK-8 a cada pocillo seguido de otra incubación durante 2 h. La densidad óptica (DO) se midió a 450 nm mediante un lector de microplacas ELISA (Thermo Scientific, EE. UU.).

Para evaluar la toxicidad del Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-nano sonda magnética de doble anticuerpo in vivo, ratones hembra NOD / SCID recibieron una inyección en la vena de la cola única de 200 μL de PBS (grupo de control) o Fe ₃ O ₄ @ Nanoonda magnética de doble anticuerpo KCTS-LECs (2 mg / ml) ( n =3 animales por grupo). Después de 1 semana, se sacrificaron los ratones, se obtuvieron secciones de los tejidos principales (corazón, pulmón, hígado, bazo, riñón) y se sumergieron en una solución de formaldehído al 10%, se deshidrataron y se embebieron en parafina. Se cortaron secciones parafinadas (4 μm de grosor) y se tiñeron con hematoxilina-eosina.

Análisis de fechas

Para el análisis de los datos se utilizó el software estadístico SPSS 16.0. Los datos de medición se expresaron como x ± s, la comparación entre grupos se realizó mediante análisis de varianza y la comparación de los datos de recuento se realizó mediante la prueba de chi-cuadrado. P <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultado

Principio de una nanopartícula magnética de doble focalización para la detección del cáncer humano

En este estudio, como se muestra en el Esquema 1, Fe ₃ O ₄ @KCTS, un tipo de nanopartículas magnéticas de núcleo-capa, se preparó activando Fe ₃ O ₄ con carbodiimida y reticulándola con α-cetoglutarato quitosano (KCTS). A continuación, se añadieron los anticuerpos LYVE-1 y podoplanina a la superficie de estas nanopartículas magnéticas, formando así nanoprobes magnéticos de doble focalización. Estas sondas se inyectaron en modelos de ratones a través de la vena de la cola para diagnosticar el tumor mediante imágenes de resonancia magnética ponderadas en T2 e imágenes de fluorescencia. Después de la escisión, el tumor se trituró en una sola célula y luego se incubó con la sonda para identificar las células endoteliales de linfocitos con mayor pureza mediante un imán para explorar el mecanismo de metástasis tumoral. Los resultados demostraron que se desarrolló con éxito una nanosensda magnética de doble focalización que proporciona LEC de alta pureza a partir de tejidos tumorales, lo que proporciona una base para la aplicación clínica de LEC en el cáncer colorrectal, así como en el diagnóstico clínico temprano mediante imágenes de modo dual del cáncer colorrectal.

Ilustración esquemática de Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-nanopartículas magnéticas de doble anticuerpo

Caracterización de Fe ₃ O ₄ @ Nanopartículas magnéticas de doble anticuerpo KCTS-LECs

Las imágenes TEM (Fig. 1a) mostraron que el Fe ₃ desnudo O ₄ es irregular con esférico y tiene aglomerados entre las partículas. Cuando Fe ₃ O ₄ fue modificado por KCTS (Fig. 1b), las partículas eran esféricas u ovaladas regulares y las partículas se dispersaron uniformemente. Como se muestra en la Fig. 1c, Fe ₃ O ₄ Se modificaron nanopartículas magnéticas de doble anticuerpo @ KCTS-LECs con el anticuerpo cargado negativamente en la superficie de Fe ₃ O ₄ @KCTS que confería cargas negativas, aumentando así la repulsión electrostática entre nanopartículas. Fe ₃ O ₄ Las nanopartículas magnéticas de doble anticuerpo de @ KCTS-LECs eran esféricas, uniformes, libres de agregación de partículas y no estaban dañadas. El diámetro medio fue de 91,28 ± 2,31 nm y el PDI fue de 0,207 ± 0,015 (Fig. 1d). La figura muestra que la distribución de tamaño de las nanopartículas fue estrecha y mostró una buena dispersión en agua. La superficie cargada negativamente tenía un potencial zeta de - 32,8 ± 1,51 mV, con un valor absoluto superior a - 30, lo que indica que el material tenía una buena estabilidad (Fig. 1e).

Caracterización de nanoprobeta magnética. un Imagen de micrografía electrónica de transmisión de Fe ₃ O ₄ nanoprobe (barra de escala, 100 nm). b Imagen de micrografía electrónica de transmisión de Fe ₃ O ₄ @KCTS nanoprobe (barra de escala, 100 nm). c Imagen de micrografía electrónica de transmisión de Fe ₃ O ₄ @ Nanoonda magnética de doble anticuerpo KCTS-LECs (barra de escala, 100 nm). d El tamaño de partícula se detectó mediante análisis de tamaño y el tamaño medio de la sonda fue 91,28 nm. e El potencial Zeta era de aproximadamente - 32,8 mv. f El Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-Nanoprobe de doble anticuerpo tiene picos de emisión bajo luz de excitación de 488 y 545

Los resultados del espectrómetro de fluorescencia se muestran en la Fig. 1f. Se observó un pico de emisión distinto en el anticuerpo anti-podoplanina (FITC) bajo una luz de excitación 488, y en el anticuerpo anti-LYVE-1 (APC) bajo una luz de excitación 545. La presencia de picos de emisión en el Fe ₃ O ₄ El complejo de doble anticuerpo @ KCTS-LECs bajo excitación 488 y 545 indica que los materiales se acoplaron con éxito.

Inmunohistoquímica e inmunofluorescencia

Como se muestra en la Fig. 2a, b, se observó la expresión de LYVE-1 en tejidos de cáncer de colon y LYVE-1 y anticuerpo de podoplanina en tejidos tumorales congelados. Esto demostró que había una pequeña cantidad de células endoteliales linfáticas en los tejidos del cáncer de colon.

Expresión de vasos linfáticos en tejidos de cáncer colorrectal. un Los vasos dilatados en las secciones de tejido fueron positivos para LYVE-1 en la membrana celular endotelial por inmunohistoquímica (barra de escala, 100 µm). A la derecha hay una imagen ampliada. b Los vasos dilatados en las secciones de tejido fueron positivos para LYVE-1 y podoplanina en la membrana de las células endoteliales, como lo reveló la inmunofluorescencia (barra de escala, 50 μm)

Aislamiento y enriquecimiento de LEC

La tinción por inmunofluorescencia se realizó en las células obtenidas mediante dos métodos de clasificación diferentes. Se encontró que las células clasificadas por microesferas magnéticas LYVE-1 MicroBeads expresaban la proteína LYVE-1, pero no podoplanina, mientras que las células obtenidas por Fe ₃ O ₄ Las nanopartículas magnéticas de doble anticuerpo de @ KCTS-LECs expresaron la proteína LYVE-1 y la proteína podoplanina (Fig. 3a). Además, se analizaron los resultados de la citometría de flujo de las células clasificadas por diferentes métodos. Como se muestra en la Fig. 3b, la tasa de coexpresión de la proteína LYVE-1 y la proteína podoplanina por las perlas magnéticas de LYVE-1 MicroBeads fue del 71,2%, mientras que la tasa de coexpresión de los dos marcadores obtenidos mediante la clasificación con Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-nanopartículas magnéticas de anticuerpo doble fue del 88,9%. Dos muestras independientes t Las pruebas mostraron que había diferencias estadísticamente significativas entre los dos grupos ( P <0.05) (Figura 3c).

Análisis de la pureza de las células endoteliales linfáticas. un Micrografías de fluorescencia de imágenes a doble color de LYVE-1 (rojo) y podoplanina (verde) / núcleos [4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, azul) en las LEC aisladas de cáncer colorrectal humano clasificadas utilizando microperlas LYVE-1 y Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-anticuerpo doble (barra de escala, 100 μm). b La coexpresión de LYVE-1 (APC) y podoplanina (FITC) según lo revelado por detección de citometría de flujo. c Resultados de la citometría de flujo, * P <0.05

Comparación de las funciones biológicas de las LEC obtenidas mediante los dos métodos de clasificación diferentes

Además, comparamos las características biológicas de las células endoteliales linfáticas obtenidas mediante dos métodos de clasificación diferentes. Los resultados de la prueba del tubo de pegamento Matrigel se muestran en la Fig. 4a. Las células obtenidas clasificando con Fe ₃ O ₄ Las nanopartículas magnéticas de doble anticuerpo de @ KCTS-LECs tenían una capacidad de formación de tubos más fuerte. El resultado del ensayo de absorción de células endoteliales Dil-ac-LDL que se muestra en la Fig. 4b revela que se observó una fluorescencia roja en las células clasificadas por microesferas magnéticas LYVE-1 MicroBeads, pero se observó una fluorescencia roja más fuerte en las células clasificadas por Fe ₃ O ₄ @ Nanopartículas magnéticas de doble anticuerpo KCTS-LECs. Estos resultados indican que las células obtenidas por el Fe ₃ O ₄ Las nanopartículas magnéticas de doble anticuerpo @ KCTS-LECs tenían mayor pureza, mejor capacidad de formación de tubos y fagocitosis de células endoteliales, lo que indica que son más adecuadas para la investigación de células endoteliales linfáticas en tumores.

Comparación de funciones biológicas de LEC. un Determinación de la capacidad de formación de tubos de LEC in vitro mediante Calceína AM (verde) in vitro (barra de escala, 50 μm). b Ensayo de fagocitosis de células endoteliales (marcado con DiI, rojo; DAPI, azul) de la función de las células endoteliales utilizando LEC aisladas mediante microperlas LYVE-1 y Fe ₃ O ₄ @ KCTS-LECs-Anticuerpo doble (barra de escala, 100 μm)

Análisis de imágenes bimodales en vivo

Los resultados de la formación de imágenes in vivo se muestran en la Fig. 5a. Se encontró que no había fluorescencia del tumor antes de la inyección de Fe ₃ O ₄ @ Nanopartículas magnéticas de doble anticuerpo KCTS-LECs. Después de la inyección, la fluorescencia del tumor aumentó, alcanzando el pico a las 12 h. A partir de entonces, la fluorescencia disminuyó gradualmente con el tiempo. En el grupo de control cerrado, casi no hubo fluorescencia del tumor durante todo el experimento. Después de 24 h, se observó que el material se había metabolizado completamente del cuerpo de los ratones de ambos grupos. De manera similar, la imagen por resonancia magnética que se muestra en la Fig. 5b reveló que la imagen del tumor se debilitó gradualmente, alcanzando su nivel más débil después de 12 h, seguido de una recuperación gradual con el tiempo. Sin embargo, el poder de formación de imágenes del tumor en el grupo de control cerrado se mantuvo casi sin cambios. Se puede inferir que el Fe ₃ O ₄ Las nanopartículas magnéticas de doble anticuerpo @ KCTS-LECs tenían altas propiedades de focalización tumoral in vivo.

Imágenes de fluorescencia y resonancia magnética de modelos tumorales de xenoinjerto subcutáneo de cáncer colorrectal de ratones NOD / SCID. un Se anestesiaron ratones NOD / SCID y se obtuvieron imágenes con un sistema de imágenes de fluorescencia antes y después de la inyección 0,5 h, 12 hy 24 h. b Se anestesiaron ratones NOD / SCID y se obtuvieron imágenes con un escáner de resonancia magnética 3.0T antes y después de la inyección 0.5 h, 12 hy 24 h

Toxicidad in vitro e in vivo de nanopartículas magnéticas

Se evaluó la citotoxicidad in vitro de las nanosondas magnéticas en las LEC que se clasificaron por Fe ₃ O ₄ @ Nanopartículas magnéticas de doble anticuerpo KCTS-LECs. Los resultados del ensayo CCK-8 mostraron que la viabilidad de la célula era alta después de la incubación con varias concentraciones de nanoonda magnética (Fig. 6a). Esto sugiere que Fe ₃ O ₄ Las nanopartículas magnéticas de doble anticuerpo de @ KCTS-LECs tienen una citotoxicidad mínima. Además, evaluamos la toxicidad de las nanopartículas magnéticas in vivo. Se trataron ratones NOD / SCID hembras con nano sonda magnética y luego se examinaron secciones de tejido de los órganos principales después de la tinción con hematoxilina-eosina. Como se muestra en la Fig. 6b, no se observaron signos obvios de necrosis o inflamación. Estos resultados sugirieron que la nano sonda magnética no produjo efectos tóxicos in vivo. Estos hallazgos indican que la nano sonda magnética diseñada en este estudio es adecuada para su aplicación como sonda de detección en investigaciones con animales y humanos.

Toxicidad del Fe ₃ O ₄ @ Nanosonda magnética de doble anticuerpo KCTS-LECs. un Las LEC se incubaron con diversas concentraciones de nano sonda magnética y se midió la viabilidad celular a las 24 hy 48 h. b Los ratones NOD / SCID se trataron con PBS o nanosensda magnética, y las secciones de los órganos principales se tiñeron con hematoxilina-eosina y se examinaron mediante microscopía óptica (barra de escala, 100 μm)

Discussion

It has long been know that transportation through the lymphatic system is an important pathway for tumor cell proliferation. However, compared with vascular endothelial cells (BECs) in blood vessels, LECs, as major components of lymphatic vessels, have not been fully studied. Identification of LECs markers will promote investigations on LECs and make it easier to distinguish them from BECs. LYVE-1 is a type I intact transmembrane glycoprotein receptor composed of 322 amino acid residues [20, 21], and it is presently considered to be the most specific lymphatic endothelial cells marker [22, 23]. Podoplanin is a type I transmembrane salivary mucin-like glycoprotein with a molecular weight of 38 kDa. Current research shows that podoplanin can distinguish lymphatic vessels and blood vessels very well [24, 25]. Therefore, it can be combined with other lymphatic markers to identify LECs. In this study, two antibodies were used to sort LECs, and the purity of the sorted cells was verified by immunofluorescence co-localization, flow double staining, and co-expression. The cells sorted by Fe₃ O ₄ @KCTS-LECs-double antibody magnetic nanoparticles displayed similar biological characteristics with LECs, and had stronger tube-forming ability and better phagocytic ability.

Recently, immunomagnetic-based purification methods have been used to separate different cells from mixed cultures, while magnetic beads coated with LYVE-1 or podoplanin antibodies have been used to separate specific subpopulations from crude cells populations [10, 26]. These methods only purify the target subgroups from mixed cultures. It is likely that this not only leads to incomplete isolation of LECs, but also causes contamination of heterogeneous cells such as vascular endothelial cells. Furthermore, these methods are time-consuming and are costly. Previously, several specific lymphoid markers were reported, e.g., LECs were isolated from different tissues primarily by the means of collagenase treatment. However, during primary culture, collagenase treatment may produce a mixture of cells, including vascular endothelial cells and interstitial cells.

In this study, the Fe₃ O ₄ @KCTS-LECs-diabody magnetic nano-double targeting probe was constructed using chitosan-coated ferroferric oxide which binds to highly specific target molecules LYVE-1 and podoplanin expressed on lymphatic endothelial cells. The electron microscope analysis showed that the probe had uniform appearance and good dispersibility. Zeta potential reflects the stability of a molecular probe. Highly positive or negative zeta potential values reflect high stability and low capacity to aggregate. It is generally believed that molecules with zeta potential greater than + 30 mV or less than − 30 mV have good stability. In this experiment, the probe had a zeta potential of − 32.8 ± 1.51 mV, which indicates that the probe had good stability.

Fe₃ O ₄ is a magnetic nanoparticle oxide which has been widely used in modern medicine and biology because of its unique physical properties. It is particularly used in diagnosis systems based on magnetic resonance imaging and magnetic hyperthermia as well as in cell separation applications. The contrast agents used in MR imaging can be divided into paramagnetic iron oxide nanoparticles (T2-negative contrast agent) and Gd compounds (T1-positive contrast agent). Fe₃ O ₄ nanoparticle resonance contrast agent is considered to be a R2-weighted, and its performance is often affected by some factors, such as (a) composition, (b) NP size, (c) surface coating, and (d) synergistic magnetic effect produced by multiple superparamagnetic Fe₃ O ₄ NP centers in a small volume [27]. In addition, it can be used in sorting of target cells under the magnetic field effect, that is, after the target cells are combined with specific probes, the target cells are sorted by magnet adsorption. For example, the lymphatic endothelial cells sorted using the probe designed in this study had better tube forming ability and endothelial cell phagocytosis. The relaxation parameter R1 or R2 is typically used to measure the quality of the MRI contrast agent, which describes the ability of the contrast agent T1 or T2 relaxation time [28]. The current NP-based T1 contrast agents are associated with cell toxicity, generating the need for better alternatives. Fe₃ O ₄ provides good biocompatibility compared to the above-described cerium-based materials [29]. In this study, we studied the in vitro and in vivo toxicity of the nano-probes modified by chitosan on the surface of Fe₃ O ₄ . Our results showed that the probe was suitable for sorting of specific cells, and had low toxicity. It is therefore an ideal material that can be used for culturing of the sorted cells and further research on tumor metastasis through lymphatic vessels.

Here, specific target molecules such as peptides, antibodies, aptamers, etc. were attached to the surface of magnetic nanomaterials, thereby facilitating tumor diagnosis and treatment [30, 31]. This study successfully constructed the Fe₃ O ₄ @KCTS-LECs-double antibody magnetic nano-double targeting probe. This probe could bind to specific target molecules, and hence can be used to separate lymphatic endothelial cells and MR/fluorescence imaging.

Conclusions

In summary, a dual targeting magnetic nanoparticle that can detect human cancer is presented in this study. The magnetic nanoparticle probe displays high biosafety and stability. The probe could bind to specific target molecules, thereby enabling sorting of lymphatic endothelial cells. The double antibody coating customized by incorporating self-made magnetic beads produced enabled separation of pure LECs, which reduced sorting time, improved cell activity, and reduced cost. These findings indicate that the magnetic nanoprobe designed in this study is suitable for application as a detection probe in animal and human investigations. This study provides a platform for studying the mechanisms of lymphatic metastasis and role of lymphatic endothelial cells in tumors. Moreover, the Fe₃ O ₄ @KCTS-LECs-double antibody magnetic nanoparticles can be applied in fluorescence/MR molecular imaging in vivo, enabling clinical diagnosis of cancer.

Abreviaturas

DAPI:

4 ', 6-diamidino-2-fenilindol

DMEM:

Dulbecco’s modified Eagle medium

EDC:

Clorhidrato de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida

FBS:

Containing no fetal bovine serum

Fe₃ O ₄ :

Magnetic ferroferric oxide

HT29:

Human colon cancer cell

KCT:

α-Ketoglutarate carboxymethyl chitosan

LECs:

Lymphatic endothelial cells

LYVE-1:

Lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1

MR:

Magnetic resonance

NHS:

N-hydroxysuccinimide

T2:

Transverse (spin-spin) relaxation time

TEM:

Microscopía electrónica de transmisión

VEGFR-3:

Vascular endothelial growth factor receptor 3

Un factor importante que afecta las propiedades supercapacitivas de las matrices de nanotubos de TiO2 hidrogenado:estructura cristalina La administración oral de nanopartículas lipídicas sólidas cargadas con resveratrol mejora la resistencia a la insulina al enfocarse en la expresión de proteínas SNARE en el tejido adiposo y mus…