Técnica PRISM Rompe Límites de Difracción de Luz para Imagen de Células Vivas en Espacio y Tiempo

• Investigadores desarrollan una nueva técnica (PRISM) que puede observar más allá de la difracción de la luz.
• Puede capturar vistas excepcionales dentro de células vivas mediante imagen super-resolución espacial y temporal.

Durante las últimas dos décadas, hemos estado usando métodos de imagen de fluorescencia de campo amplio, como PALM y STORM, para observar estructuras subcelulares. Estos métodos requieren cientos y miles de imágenes en bruto en secuencias largas. Así, aumentar la resolución espacial disminuye la resolución temporal.

Ahora, investigadores de EPFL (institución de investigación en Lausana, Suiza) han diseñado un sistema que puede capturar vistas excepcionales dentro de células vivas mediante imagen super-resolución espacial y temporal (tanto en espacio como en tiempo).

La nueva plataforma de microscopía, llamada PRISM (Phase Retrieval Instrument with Super-resolution Microscopy), puede observar más allá de la difracción de la luz. Integra microscopía 3-dimensional y una técnica novedosa para recuperación de fase 3-dimensional de luz blanca.

Combina la resolución espacial de super-resolución de fluorescencia y especificidad molecular con la imagen de fase cuantitativa de alta velocidad y sensible, permitiendo imagen multimodal 4-dimensional.

¿Cómo Funciona la Microscopía 4D de Células?

Los investigadores usaron filtrado de Fourier para extraer fase cuantitativa 3D de un array de imágenes de luz blanca. Luego explicaron esta imagen de fase resuelta en profundidad de campo brillante a través de formación de imagen 3D parcialmente coherente.

Demostraron su concepto recuperando datos de fase 3D de alta resolución de células estables de una gran pila de intensidades desplazadas en z. Desarrollaron PRISM para adquisición concurrente de 8 planos – puede realizar imagen de fase 3D de alta velocidad a través de 2.5x50x50-micrómetros de volumen. Finalmente, imaginaron secuencialmente muestras de células con microscopía de fase 3D y imagen de fluctuación óptica super-resolución (SOFI).

SOFI soporta imagen 3D de célula viva con casi un segundo por imagen reconstruida de resolución temporal en un microscopio multi-plano. Además, ofrece evaluación cuantitativa de parámetros moleculares, y tolera altas densidades de etiquetado.

Referencia: Nature Photonics | doi:10.1038/s41566-018-0109-4 | EPFL

En lenguaje simple, PRISM es un complemento a las plataformas de microscopía de campo amplio actuales, que permite implementación simple y rápida de imagen super-resolución de fluorescencia 3D y fase cuantitativa 3D. En resumen, el nuevo sistema presenta una mejor oportunidad para observar la fisiología temporal y espacial compleja de células vivas.

Detalles Técnicos

Una célula observada con la técnica PRISM | Crédito: T. Lasser / EPFL

Basado en la ecuación de onda de Helmholtz, la técnica está incrustada en el marco del teorema de Wiener–Khintchine. El proceso de decodificación de datos de fase a lo largo del eje z se hace calculando la interferencia de dispersión débil hacia adelante.

Construyeron un algoritmo eficiente para recuperar los datos de fase 3D de una pila de intensidad volumétrica adquirida. La alta apertura numérica de detección e iluminación de Köhler de luz blanca proporcionan imagen de fase cuantitativa de alta resolución, estable y libre de speckle de células vivas. Además, las simulaciones verificaron una resolución axial de 350x560 nanómetros.

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En general, el procedimiento permite actualizar un microscopio de campo brillante convencional en un microscopio de fase 3D simple, rápido y fiable, que se supone cumple las expectativas para numerosas investigaciones y aplicaciones en ciencias de la vida y biología.