Stent gastrointestinal liberador de piperlongumina con esterillas de nanofibras sensibles a especies de oxígeno reactivo para la inhibición de células de colangiocarcinoma

Materiales y métodos

Materiales

PL se adquirió en LKT Labs. Co., (Minnesota, Estados Unidos). Se adquirió poli (L-lactida) (PLA, PLA-0005, PM =5000 g / mol a partir de los datos del fabricante) de Wako Pure Chem. Co. Ltd. (Osaka, Japón). Se adquirió metoxi poli (etilenglicol) succinimidilglutarato (MePEG-NHS, PM =5000 g / mol) de Sunbio Co. Ltd. (Seúl, Corea). El stent recubierto de membrana de silicona para el tracto biliar se obtuvo de M.I. Tech. (Pyeongtaek, Corea). Poli (ε-caprolactona) (PCL, PM promedio en número =80.000 g / mol), N-hidroxisuccinimida (NHS), N- (3-dimetilaminopropil) -N'-etilcarbodiimida clorhidrato (EDAC), tetrahidrofurano (THF), cloroformo , dimetilsulfóxido (DMSO), bromuro de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) y diclorhidrato de selenocistamina se adquirieron de Sigma-Aldrich Chemical Co., (St. Louis, MO , EE.UU). La membrana de diálisis o el dispositivo de diálisis (tamaño de corte de PM (MWCO) 1000 g / mol y 8000 g / mol) se adquirió de Spectrum / Por Lab., Inc. (CA, EE. UU.). Todos los disolventes orgánicos y otros productos químicos se utilizaron como grado extra puro. Los suministros de cultivo celular tales como medio RPMI1640 y suero fetal bovino (FBS) se adquirieron de Life Tech. Inc. (Grand Island, NY, EE. UU.). Todos los reactivos y disolventes orgánicos utilizados fueron de calidad HPLC.

Síntesis del copolímero de bloque LEse

Conjugados de MePEG-selenocistamina

Se disolvió MePEG-NHS (500 mg) en 20 ml de DMSO. Se disolvieron por separado más de cinco equivalentes de selenocistamina en 15 ml de agua desionizada y se mezclaron con 5 ml de DMSO. Después de eso, la solución de selenocistamina se vertió lentamente en una solución de MePEG-NHS y luego se agitó magnéticamente durante 24 h. A continuación, se introdujeron los reactivos en un tubo de diálisis (MWCO 1000 g / mol) y luego se dializaron con abundante agua durante 2 días. La solución dializada se liofilizó durante 2 días. Se utilizó un sólido liofilizado para sintetizar el copolímero de bloque.

Síntesis de copolímeros en bloque

Se disolvió PLA (500 mg) en 20 ml de DMSO con una cantidad equivalente de EDAC y NHS. Esta solución se agitó magnéticamente durante 12 h. A esta solución, se añadió mPEG-selenocistamina sólido (530 mg) y se agitó durante 2 días más. A continuación, se introdujeron los reactivos en un tubo de diálisis (MWCO:8000 g / mol) y luego se dializaron con abundante agua durante 2 días. La solución dializada se liofilizó durante 2 días. Los productos liofilizados se precipitaron en metanol para eliminar la mPEG-selenocistamina sin reaccionar una vez más. El rendimiento final fue superior al 94%. Rendimiento =[(peso de sólido liofilizado) / (peso de PLA + peso de mPEG-selenocistamina)] × 100.

Caracterización de polímeros

Para monitorear la síntesis de polímeros, ¹ Se empleó espectroscopia de resonancia magnética nuclear H (RMN). Los polímeros se disolvieron en forma DMSO-d y se midieron con ¹ Espectroscopía H-NMR (espectrómetro FT-NMR superconductor de 500 MHz, UnityInova 500, Varian Inc. Agilent Tech., CA, EE. UU.).

El peso molecular de los polímeros se midió con cromatografía de permeación en gel (GPC, sistema Waters GPC, MA 01757, EE. UU.):Bomba de disolvente para HPLC Waters 1515, un detector de índice de refracción Waters 2414 y tres columnas de alta resolución Waters Styragel (HR4, HR2, HR1 ). Los polímeros se disolvieron en THF de grado extra puro que contenía LiBr 0,1 N como eluyente (caudal 1,0 ml / min). Se utilizaron poliestirenos para hacer una curva de calibración.

Alfombrillas de nanofibras cargadas con PL y recubiertas en el stent GI

Alfombrillas de nanofibras cargadas con PL

Se disolvió vorinostat (100 mg) en 10 ml de solución de acetona. A esta solución, se le añadió luego LEse (100 ~ 400 mg) y PCL (600 ~ 900 mg) y se agitó magnéticamente durante 2 h. Esta solución se usó para fabricar tapetes de nanofibras y para recubrir el stent cubierto con membrana de silicona usando una máquina de electrohilado (EBS ES-Biocoater; Nano NC, Seúl, Corea del Sur). La máquina de electrohilado está compuesta por una fuente de alimentación de alto voltaje, una bomba de jeringa, un sistema robótico X-Y y un colector de redobles. La solución de polímero / fármaco en una jeringa (NanoNC, 24G) se pulverizó sobre el stent metálico cubierto con una membrana de silicona (diámetro 1 cm, longitud 10 cm, velocidad de laminación 500 rpm, velocidad de pulverización 100 μL / minuto, voltaje 15 kV) que es colocado sobre el colector rodante. La membrana de nanofibras cargada con PL se revistió sobre el stent. Para eliminar el disolvente restante, la endoprótesis recubierta de nanofibras cargada con PL se secó en un horno de secado al vacío durante 24 h. Los stents recubiertos de nanofibras cargados con PL se almacenaron a 4 ° C hasta el siguiente estudio.

Las esteras de nanofibras cargadas con PL se separaron cuidadosamente del stent para la liberación del fármaco y el estudio con animales. La membrana de nanofibras vacía se preparó en ausencia de PL con un procedimiento similar.

Los contenidos de fármaco se midieron como sigue:se disolvieron 5 mg de esterillas de nanofibras incorporadas en PL en DMSO durante 2 h. Se utilizó un espectrofotómetro UV (UV-1601, Shimadzu Co. Ltd. Osaka, Japón) para medir la concentración de fármaco a 325 nm. Las esteras vacías de nanofibras también se disolvieron en DMSO y se usaron para la prueba en blanco.

El estudio de liberación del fármaco se realizó con solución salina tamponada con fosfato (PBS, 0,01 M, pH 7,4) in vitro. Las esteras de nanofibras se cortaron en discos y se sumergieron 10 mg de discos en 40 ml de PBS (0,01 M, pH 7,4) en un tubo cónico de 50 ml. Este se colocó en una incubadora con agitación a 100 rpm (37 ° C). Se tomaron medios completos para medir la concentración de PL liberado de las esteras de nanofibras en intervalos de tiempo específicos. La concentración de PL en el medio se midió con un espectrofotómetro UV (325 nm). También se emplearon esteras vacías de nanofibras para su uso como prueba en blanco. En el estudio de liberación, se agregó peróxido de hidrógeno al medio de liberación para investigar el efecto de ROS en la velocidad de liberación del fármaco.

Morfología

La morfología de las esteras de nanofibras se observó con un microscopio electrónico de barrido de emisión de campo (S-4800; Hitachi, Tokio, Japón) a 25 kV.

Cultivo celular

Las líneas celulares CCA humanas tales como SNU478, SNU245 y SNU 1196 líneas celulares CCA se obtuvieron del Korean Cell Line Bank (Seúl, Corea). La línea celular HuCC-T1 humana CCA se obtuvo del Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japón). Todas las células se cultivaron en RPMI1640 complementado con FBS inactivado por calor al 10% y penicilina / estreptomicina al 1% a 37 ° C en un 5% de CO ₂ incubadora.

Estudio de actividad contra el cáncer

Varias celdas CCA (1 × 10 ⁴ ) sembradas en placas de 96 pocillos se utilizaron para evaluar la actividad anticancerígena de la propia PL, las esteras de nanofibras incorporadas a PL o las PL liberadas de las esteras de nanofibras. Las células se mantuvieron durante la noche en un 5% de CO ₂ incubadora a 37 ° C. Para el tratamiento con PL, se diluyeron PL disueltos en DMSO (10 mg PL / mL DMSO) con medio RPMI1640. La concentración final de DMSO fue inferior al 0,5%. Para el tratamiento de PL liberado de las esteras de nanofibras, las esteras de nanofibras incorporadas a PL se sumergieron en 40 ml de PBS en un tubo cónico de 50 ml. El día 5 y el día 15, se midió la concentración de PL con espectrofotómetro UV como se describió anteriormente y se usó para tratar células. La nanofibra vacía también se adaptó al experimento de liberación para comparar. Las células se expusieron al propio PL o al PL liberado de las esteras de nanofibras durante 2 días. La viabilidad de las células CCA se evaluó con un ensayo de proliferación de MTT. Se añadió una solución de MTT de treinta microlitros (5 mg / ml de PBS, pH 7,4) a los pocillos, y luego las células se incubaron durante 4 h en CO ₂ al 5%. incubadora a 37 ° C. Se descartó el medio y se le añadieron 100 µl de DMSO. La viabilidad celular se analizó con un lector de microplacas a 570 nm (lector de microplacas Infinite M200 Pro, Tecan, Mannedorf, Suiza). La viabilidad celular se expresó como media ± desviación estándar de ocho pocillos.

Medición ROS

La generación de ROS en células CCA se ensayó mediante el método DCFH-DA. Celdas CCA (1 × 10 ⁴ células) sembradas en una placa de 96 pocillos se trataron con diversas concentraciones de PL en sí o PL liberado de las esteras de nanofibras en medio RPMI sin rojo fenol con DCFH-DA (concentración final 20 µM). Seis horas o 12 h más tarde, las células se lavaron con PBS dos veces y se reemplazaron con 100 μL de medio RPMI sin rojo fenol fresco. El contenido de ROS en las células se analizó mediante cambios en la intensidad de la fluorescencia utilizando el lector de microplacas Infinite M200 pro (longitud de onda de excitación 485 nm, longitud de onda de emisión 535 nm).

Western Blot

La transferencia de Western de las células CCA se llevó a cabo como se describió anteriormente [31]. Las células se expusieron al propio PL o al PL liberado de las esteras de nanofibras durante 24 h. Después de eso, las células se recolectaron por tripsinización, se lavaron con PBS frío y se recolectaron por centrifugación. Los sedimentos se lisaron en tampón de lisis que contenía Tris 50 mM, NaCl 150 mM, NP-40 al 1%, ácido desoxicólico al 0,5%, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 0,1% con fluoruro de fenilmetilsulfonilo y un cóctel inhibidor de proteasas (Roche Diagnostics, Basilea, Suiza). ). Esta solución se centrifugó durante 30 min a 4 ° C (14.000 x g ); los lisados ​​celulares (sobrenadante) se usaron luego para medir la concentración de proteína usando el kit de ensayo de proteína BCA (Pierce, Rockford, IL, EE. UU.). Se cargó proteína (50 μg) en electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE), se transfirió a una membrana de difluoruro de polivinilo (PVDF), se bloqueó con leche desnatada al 5% en TBS-T, se probó con un anticuerpo primario apropiado y luego se trató con un anticuerpo secundario conjugado con HRP durante 1 h. Las inmunotransferencias se detectaron por quimioluminiscencia y luego se cuantificaron con análisis digitales utilizando el programa de software ImageJ.

Estudio in vivo utilizando el modelo de xenoinjerto tumoral

Se utilizaron ratones portadores de HuCC-T1 (ratón desnudo BALB / c, 5 semanas de edad, macho, 18-23 g de peso; Orient, Seongnam, Corea del Sur) para evaluar la actividad antitumoral in vivo del stent de nanofibras incorporado en PL. 1 × 10 ⁶ Se administraron por vía subcutánea (s.c.) células HuCC-T1 en 100 µl de PBS a la espalda de ratones desnudos. Se implantaron discos de nanofibras con PL incorporado y nanofibras vacías debajo del tumor sólido cuando el tumor sólido alcanzó aproximadamente 4 ~ 5 mm de diámetro. La dosis de PL fue de 10 mg PL / kg. A modo de comparación, PL se disolvió en una solución de mezcla Cremophor EL® / etanol (0,5% v / v Cremophor EL® y 0,5% v / v etanol en PBS (pH 7,4, 0,01 M)). Los grupos de control se inyectaron subcutáneamente con PBS junto al tejido tumoral. Para el grupo de nanofibras vacías y de nanofibras incorporadas en PL, se prepararon discos de nanofibras de la siguiente manera; Se cortaron obleas de nanofibras del mismo peso en discos redondos y luego se extirpó cuidadosamente la parte posterior de la piel del ratón (0,5 cm de longitud). Después de esto, se implantaron cuidadosamente obleas de nanofibras debajo del tejido tumoral sólido. Para lograr la misma condición, los ratones con tratamiento de control e inyección de PL también han extirpado la piel al lado del tumor (0,5 cm de longitud). Cada grupo estaba formado por cinco ratones. El volumen tumoral se midió con intervalos de 5 días y el primer día de implantación de nanofibras se estableció como día 0. El volumen tumoral se calculó mediante la siguiente ecuación: V =( a × [ b ] ² ) / 2. a :mayor diámetro; b :diámetro más pequeño.

Todo el estudio en animales se realizó cuidadosamente bajo las pautas del Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad Nacional de Pusan ​​(PNUIACUC). El protocolo animal utilizado en este estudio ha sido estrictamente revisado por el PNUIACUC sobre sus procedimientos éticos y cuidados científicos, y ha sido aprobado (Número de Aprobación:PNU-2017-1608).

Inmunohistoquímica

Los tejidos tumorales se aislaron 30 días después. Luego, los tejidos tumorales se fijaron en formaldehído al 4%, se incrustaron en parafina y se cortaron para tinción con hematoxilina y eosina (H&E). La tinción inmunohistoquímica se realizó con proteínas relacionadas con la apoptosis, como los anticuerpos caspasa-3 y caspasa-9. Los anticuerpos se utilizaron a una dilución de 1:100 o 1:200, y luego se realizó la tinción con un kit Envision (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.) De acuerdo con el protocolo del fabricante.

Análisis estadístico

Los análisis estadísticos de los datos de las células tratadas y no tratadas se realizaron utilizando la t de Student prueba. A p valor <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados

Caracterización de polímeros

Para fabricar la endoprótesis vascular GI liberadora de PL, se sintetizó el copolímero de bloque LEse como se muestra en la Fig. 1. Se hizo reaccionar MePEG-NHS con selenocistamina, y luego se conjugó el grupo amina terminal con el grupo terminal carboxilo de PLA. La selenocistamina sin reaccionar de los conjugados de MePEG-selenocistamina se eliminó mediante un procedimiento de diálisis. Además, los conjugados de MePEG-selenocistamina sin reaccionar del copolímero de bloques sintetizado también se eliminaron mediante el procedimiento de diálisis y precipitación en metanol. Los picos específicos de selenocistamina se confirmaron en 1,7 ppm y 2,9 ppm, respectivamente, mientras que el pico específico de MePEG también se confirmó en 3,5 ~ 3,7 ppm. Cuando se conjugó PLA, el grupo metilo de PLA se confirmó en 1,4 ppm. El homopolímero de PCL y la mezcla de copolímero de bloques de LEse se combinaron para fabricar esterillas de nanofibras. El peso molecular y la composición del copolímero de bloque LEse y el homopolímero de PCL se midieron con ¹ Espectroscopía H-NMR y GPC. Los resultados de la estimación del PM se muestran en la Tabla 1. Como se muestra en la Tabla 1, el PM del copolímero de bloque LEse se estimó en base al PM de PEG usando ¹ Espectroscopía de H-NMR como 9760 g / mol. La medición de GPC mostró que el copolímero de bloque LEse tiene 8210 g / mol de Mn, 9530 g / mol de Mw y 1,16, respectivamente.

Esquema de síntesis del copolímero de bloque LEse

Caracterización del stent gastrointestinal recubierto de nanofibras incorporadas con Piperlongumine

Como se muestra en la Fig. 2 y en la Tabla 2, se usaron diversas proporciones de copolímero de bloques de PCL y LEse para fabricar nanofibras y para revestir el stent GI. El homopolímero de PCL dio como resultado esteras de nanofibras finas y delgadas con una forma agregada minimizada. Cuando se agregó el copolímero de bloque LEse, se observó parte de la forma agregada, como gránulos y partículas, como se muestra en la Fig. 2. A una relación LEse más alta (75/25 y 60/40), las esteras de nanofibras mostraron una forma más gruesa e irregular de fibras estructura. Cuando consistía en más del 50% de proporción de LEse en su contenido, los polímeros se agregaron significativamente y los tapetes mostraron una irregularidad severa (datos no mostrados). La estructura nanofibrosa apenas se obtuvo a partir del copolímero de bloques LEse solo. Por lo tanto, se puede lograr una estructura nanofibrosa mezclando con homopolímero de PCL. Los contenidos de fármaco en los tapetes de nanofibras incorporados en PL preparados fueron casi similares al valor teórico como se muestra en la Tabla 2. Estos resultados indicaron que los tapetes de nanofibras incorporados en PL se fabricaron con éxito a partir de mezclas de homopolímero de PCL y copolímero de bloques LEse y luego se recubrieron sobre el stent GI.

un Stent gastrointestinal cubierto de nanofibras con PL incorporado. b Foto FE-SEM de nanofibra PL incorporada

La figura 3 muestra la cinética de liberación del fármaco a partir de esterillas de nanofibras. Como se muestra en la Fig. 3a, PL se liberó continuamente de las esteras de nanofibras durante 25 días. Se observó una liberación explosiva de PL de las esteras de nanofibras hasta 4 días, y luego se liberó PL continuamente de las esteras de nanofibras hasta el día 25. Los contenidos más altos de copolímero de bloque LEse en las esteras de nanofibras dieron como resultado una liberación más rápida de PL de las esteras de nanofibras. Dado que el copolímero de bloque LEse es menos hidrófobo que el homopolímero PCL, las esteras de nanofibras PCL / LEse con mayor contenido de copolímero de bloque LEse deben hincharse más que las del homopolímero PCL. Luego, las esteras de nanofibras con mayor contenido de copolímero de bloque LEse dieron como resultado una liberación de fármaco más rápida. Además, la velocidad de liberación de PL puede acelerarse en presencia de ROS ya que el enlace diselenide en el copolímero de bloque LEse puede ser desintegrado por ROS como H ₂ O ₂ , y luego estos factores inducen la desintegración sensible a redox de las esteras de nanofibras (Fig. 3c ~ e). Las esteras de nanofibras de homopolímero PCL no respondieron significativamente a la adición de H ₂ O ₂ , es decir, PCL no se ve muy afectado por H ₂ O ₂ adición; Por otro lado, cuando se mezcló el copolímero de bloque LEse, la liberación de PL de las esteras de nanofibras se aceleró significativamente a medida que H ₂ O ₂ fue añadido . Especialmente, una relación de copolímero de bloque de LEse más alta en las esteras de nanofibras indujo una cinética de liberación de fármaco más rápida como se muestra en la Fig. 3c, dye. Estos resultados indicaron que las esteras de nanofibras incorporadas con PL tienen potencial de liberación de fármacos que responden a redox en el entorno biológico. Se utilizaron esterillas de nanofibras con PL incorporado preparadas con copolímero de bloques PCL / LEse (60/40) después de un cultivo celular in vitro y un estudio animal in vivo.

un Liberación de PL a partir de nanofibras que tienen diversas composiciones. La relación de peso PCL / Lese fue 100/0, 90/10, 75/25 y 60/40, respectivamente. b El efecto del peróxido de hidrógeno en la liberación de PL de las esteras de nanofibras (la relación en peso PCL / Lese fue 100/0). c El efecto del peróxido de hidrógeno sobre la liberación de PL de las esteras de nanofibras (la relación en peso PCL / Lese fue 90/10). d El efecto del peróxido de hidrógeno en la liberación de PL de las esteras de nanofibras (la relación en peso PCL / Lese fue 75/25). e El efecto del peróxido de hidrógeno en la liberación de PL de las esteras de nanofibras (la relación de peso PCL / Lese fue 60/40)

Actividad anticáncer in vitro

Las propiedades anticancerígenas de la endoprótesis recubierta con esterilla de nanofibras incorporada en PL se evaluaron con varias células CCA. A modo de comparación, el PL liberado de las esteras de nanofibras se extrajo el día 5 y el día 15 durante el experimento de liberación y se comparó con PL intacto. Como se muestra en la Fig.4, la actividad anticancerígena en PL liberadas desde el día 5 y el día 15 no cambió significativamente en comparación con el PL mismo en todas las células HuCC-T1 (Fig. 4a), células SNU1196 (Fig. 4b), células SNU478 ( Fig. 4c) y células SNU245 (Fig. 4d). Tienen un potencial de inhibición casi similar en la viabilidad celular a pesar de que el PL en sí mismo dio como resultado una mayor actividad anticancerígena a una concentración superior a 10 μg / ml. La Tabla 3 muestra el IC ₅₀ valor de PL en sí mismo y PL liberado de las esteras de nanofibras. Además del PL mismo, el PL liberado desde el día 5 y el día 15 mantuvo la actividad anticancerosa hasta los 15 días del experimento de liberación del fármaco y mostró un IC ₅₀ razonable valor en todas las líneas celulares CCA, aunque esos valores aumentaron gradualmente en PL desde el día 5 y el día 15 en comparación con el PL mismo. PL liberado desde el día 4 y el día 15 en presencia de H ₂ O ₂ también mantuvo la actividad anticancerígena, así como la propia PL. Estos resultados indicaron que la actividad anticancerígena de PL se mantuvo durante el proceso de fabricación de nanofibras y el período de liberación del fármaco en el entorno biológico. Además, el PL liberado de las esteras de nanofibras produjo una capacidad de generación de ROS hasta los 15 días del período de liberación del fármaco, similar al PL mismo (Fig. 5). Como se muestra en la Fig. 5a yb, el PL mismo produjo ROS significativamente más a una tasa mayor que 5 μg / mL. La PL liberada desde el día 5 y el día 15 también produjo ROS, aunque la producción de ROS disminuyó ligeramente por la PL liberada desde el día 15, lo que indica que las esteras de nanofibras incorporadas a PL mantuvieron la propiedad anticancerígena intrínseca de PL durante el período de liberación del fármaco.

El efecto de PL y PL liberado de las esteras de nanofibras sobre la viabilidad de varias células CCA. un HuCC-T1, b SNU1196, c SNU478 y d Células de colangiocarcinoma SNU245. 2 × 10 ⁴ las células en placas de 96 pocillos se expusieron a PL o se liberaron PL de nanofibras durante 2 días. Para el tratamiento de PL liberado, se sumergieron discos de nanofibras incorporados en PL en PBS y luego se realizó el experimento de liberación durante 5 y 15 días con o sin H ₂ 10 mM O ₂ . El medio se cambió hasta 3 días como similar con el estudio de liberación del fármaco. Después de eso, el medio se cosechó entre 5 y 15 días después del experimento de liberación. Esta solución se utilizó para investigar la comparación de la actividad anticancerígena de PL en sí y lanzó PL

El efecto de PL y PL liberado de las esteras de nanofibras en la generación de ROS de las células HuCC-T1 ( a ) y celdas SNU245 ( b ). PL en sí y PL liberado se trataron como se describe en la Fig. 3

La Figura 6 mostró la expresión de la proteína de apoptosis en células HuCC-T1 CCA. La PL liberada (5 días) tiene una actividad similar en la inducción de la apoptosis de las células HuCC-T1 en comparación con la PL misma, es decir, la expresión de BAX, caspasa-3, 7 y 9, y la escisión de PARP escindida se incrementó gradualmente mediante el tratamiento de lanzó PL (5 días) así como PL mismo. Estos resultados también indicaron que la PL liberada tiene una actividad anticancerígena razonable contra las células CCA y contra la PL misma.

Análisis de inmunotransferencia de tipo Western de la apoptosis de células HuCC-T1. Las células se trataron con PL en sí o se liberaron PL de nanofibras durante 1 día y luego se realizaron análisis de transferencia de Western

Actividad anticáncer in vivo contra el modelo de xenoinjerto tumoral HuCC-T1

Se prepararon ratones desnudos portadores de HuCC-T1 para evaluar la actividad anticancerosa in vivo de la endoprótesis recubierta de nanofibras incorporada con PL como se muestra en las Figs. 7 y 8. Como se muestra en la Fig. 7, el volumen del tumor HuCC-T1 se incrementó gradualmente durante 1 mes. El crecimiento del volumen tumoral en el tratamiento de nanofibras vacías fue casi similar con el tratamiento de control. PL injection properly inhibited tumor growth, compared to control treatment or empty nanofiber treatment. Especially, tumor growth was significantly inhibited by the treatment of PL-incorporated nanofiber, i.e., tumor mass in the treatment of PL-incorporated nanofiber was one third of control treatment. These results indicate that PL-incorporated nanofiber mats have superior potential in inhibition of tumor growth of CCA cells. Furthermore, the expression of caspase-3 and 9 was also increased in tumor tissues as shown in Fig. 8, indicating that released PL from nanofiber mats properly inhibited the growth of the tumor and induced apoptosis of tumor cells. Also, PL-incorporated nanofiber-coated stent has potential to inhibit CCA cells in vitro and in vivo.

The effect of PL solution, empty nanofiber mats or PL-incorporated nanofiber mats on the growth of HuCC-T1 tumor (a ) and the body weight changes (b ). HuCC-T1 (1 × 10 ⁶ cells) cells were implanted to the back of mice. PL dose was adjusted to 10 mg/kg. One hundred microliters of PBS or PL solution was s.c. injected beside the tumor tissue for control treatment and PL solution treatment, respectively. For empty nanofiber and vorinostat nanofiber implantation, wafers of the same weight were cut and then implanted under the tumor tissue. *p <0,001; ** p <0.01

Immunohistochemical staining (× 400) of HuCC-T1 tumor tissues. Each tumor tissues were stained with BAX, caspase-3, 7, and 9, and PARP-1

Discussion

Abnormal accumulation of ROS in tumor epithelial cells induces carcinogenesis and affects surrounding cells or tissues which constitute tumor microenvironment [39]. Then, abnormal tumor microenvironment is the key player in proliferation, migration, angiogenesis, and metastasis of cancer cells [39,40,41]. An elevated level of ROS in tumor microenvironment induces oxidative stress and causes DNA damage [39]. Also, ROS is also correlated with cholangiocellular proliferation and oncogenic transformation [42]. Paradoxically, increased accumulation of intracellular ROS over toxic level induces apoptosis of cancer cells and tumor suppression [39,40,41,42]. For example, Thanee et al. reported that sulfasalazine as a cystine-glutamate transporter-target drug increased intracellular ROS level and then induced cell death [43]. They also argued that therapeutic efficacy of anticancer drug can be improved by blocking the mechanism of the cell’s ROS defensive system. Also, many research groups investigated ROS-producing small molecules such as melatonin, luteolin, chloroqine, and PL to suppress CCA growth rate by increasing intracellular ROS [44,45,46,47]. Thongsom et al. reported that PL stimulates ROS accumulation in CCA cells and induces cell death by activation of caspase-3 and PARP [47]. We also observed that PL increases the accumulation of intracellular ROS in various CCA cells as shown in Fig. 5. Increased ROS level induced apoptosis signals such as BAX, caspase-3, 7, and 9, and PARP (Fig. 6). The ROS-producing capability of piperlongumine was slightly decreased on day 5 and 15 as shown in Fig. 5. These results might be due to that piperlongumine is unstable in physiological solution, and then ROS-producing capability might have been slightly decreased. Additionally, physicochemical properties of piperlongumine may be affected during the fabrication process of the nanofiber. However, our results showed that ROS-producing capacity of piperlongumine was still maintained during the 15 days of drug release experiment.

Local treatment can be applied for patients with an advanced stage or unresectable stage of CCA [48]. Among various treatment options, DES is a promising candidate for unresectable CCA patients. However, conventional DES for GI tract has no tumor-targetable drug release function, and cytotoxic agent can be eluted in all areas of polymer membrane on the stent. Chemical, physical, or biological stimuli have been applied to induce altered drug delivery in the local region [49,50,51,52]. For example, Wang et al. used a magnitude of applied tensile strain to control drug release rate on the esophageal stent, i.e., increased drug release in a specific region was observed by propagating patterned crack of multilayered coating on the stent [49]. Thin film or nanoporous devices having stimuli-responsiveness such as pH and ionic strength were also investigated for application in DES [50, 51]. Chen and Huang reported that chitosan/poly(vinyl alcohol) hybrid nanofiber membrane was crosslinked with ally disulfide to endow reductant-responsiveness, and then hybrid nanofiber membrane showed favorable biological/material features [52]. We synthesized LEse deblock copolymer and fabricate redox-responsive nanofiber mats for local application in CCA tumors. PCL/LEse-blended nanofiber mats showed increased drug release behavior with responsiveness against H₂ O ₂ , indicating that drug release kinetics can be controlled by ROS level in cancer cells or tumor tissues. Furthermore, ROS-dependent drug release from nanofiber mats can be accelerated in tumor since PL is a ROS-producing agent. PL in the tumor may synergistically increase ROS level and then accelerate drug release from nanofiber mats. After all, ROS-dependent release of PL from nanofiber-coated stent synergistically inhibits CCA cells in vitro and in vivo.

Conclusion

We fabricated ROS-sensitive nanofiber mats-coated GI stent using PCL/LEse block copolymer blend. PL was incorporated in nanofiber mats by electrospinning technique. PL release from nanofiber mats was accelerated by addition of H₂ O ₂ , indicating that PL-incorporated nanofiber membranes have ROS-responsiveness. PL released from nanofiber mats at 5 days and 15 days showed appropriate anticancer activity even though its anticancer activity was slightly decreased compared to PL itself. As well as PL itself, PL released from nanofiber mats induced ROS generation and apoptosis of CCA cells. Furthermore, PL-incorporated nanofiber mats properly inhibited the growth of HuCC-T1 tumor in mice. We suggest PL-incorporated nanofiber mats prepared by PCL/LEse block copolymer blend as a promising candidate for local treatment of CCA cells.

Láser de fibra dopada con Er con bloqueo de modo mediante el uso de un absorbente saturable de MoS2 / SiO2 Evaluación de biodegradación de poli (ácido láctico) relleno con nanopartículas de titania funcionalizadas (PLA / TiO2) en condiciones de compostaje