Respuesta de osteoblastos a recubrimientos microporosos dopados con cobre sobre titanio para una mejor integración ósea
Resumen
Debido a sus excelentes propiedades mecánicas y buena biocompatibilidad, las aleaciones de titanio se han convertido en un tema de investigación popular en el campo de los implantes metálicos médicos. Sin embargo, la superficie de la aleación de titanio no presenta actividad biológica, lo que puede provocar una mala integración entre la interfaz del implante de titanio y la interfaz del tejido óseo y, posteriormente, puede provocar que el implante se caiga. Por lo tanto, la inercia biológica de la superficie es uno de los problemas que deben superar las aleaciones de titanio para convertirse en un material de implante ortopédico ideal. La modificación de la superficie puede mejorar las propiedades biológicas del titanio, mejorando así su efecto de osteointegración. El cobre es un oligoelemento esencial para el cuerpo humano, puede promover la formación de huesos y desempeña un papel importante en el mantenimiento de la estructura fisiológica y la función del hueso y el crecimiento y desarrollo de los huesos. En este estudio, se preparó un recubrimiento microporoso de dióxido de titanio y cobre sobre la superficie del titanio mediante oxidación por microarco. En base a la evaluación de sus características superficiales, se observó la adhesión, proliferación y diferenciación de las células MC3T3-E1. Se implantó una varilla de titanio en el cóndilo femoral del conejo y se evaluó la integración del revestimiento y el tejido óseo. Los resultados de nuestra investigación muestran que el recubrimiento microporoso de dióxido de titanio y cobre tiene una estructura porosa casi tridimensional, y el cobre se incorpora al recubrimiento sin cambiar la estructura del recubrimiento. Los experimentos in vitro encontraron que el recubrimiento puede promover la adhesión, proliferación y diferenciación de las células MC3T3-E1. Los experimentos in vivo confirmaron además que el recubrimiento microporoso de titanio, cobre-dióxido de titanio puede promover la osteointegración de los implantes de titanio. En conclusión, los recubrimientos microporosos de cobre-dióxido de titanio pueden prepararse mediante oxidación por microarco, lo que puede mejorar la actividad biológica y la biocompatibilidad del titanio, promover la formación de hueso nuevo y demostrar buenas propiedades osteoinductoras. Por lo tanto, el uso de este recubrimiento en ortopedia tiene una aplicación clínica potencial.
Introducción
Un material de implante médico de tejido duro debe tener propiedades mecánicas adecuadas, tales como resistencia, módulo elástico, resistencia al desgaste y resistencia a la fatiga, de modo que el implante pueda soportar la carga fisiológica del área implantada durante mucho tiempo. Al mismo tiempo, el material debe tener buena biocompatibilidad e incluso bioactividad para que el implante pueda formar una buena combinación con el tejido fisiológico de la zona de implantación sin provocar reacciones adversas en el cuerpo humano. El titanio puro y las aleaciones de titanio tienen buenas propiedades mecánicas y biocompatibilidad y actualmente son los materiales de implantes metálicos más utilizados.
Después de que se implanta el implante, primero ocurren una serie de reacciones bioquímicas en la superficie del material, y las características de la superficie juegan un papel vital en la respuesta del implante al ambiente interno. La microestructura y la composición química de la superficie del implante pueden cambiar la adsorción de proteínas, y las proteínas regulan la adhesión celular y, en última instancia, determinan su función [1]. Aunque el titanio y las aleaciones de titanio son los materiales de implantes ortopédicos más utilizados, el titanio no tiene actividad biológica. Después de la implantación en el cuerpo, no puede formar un enlace químico con el tejido óseo del área de implantación. El titanio y las aleaciones de titanio se basan principalmente en el enclavamiento mecánico para lograr la retención [2] y no favorecen la función física a largo plazo del cuerpo.
El revestimiento de la superficie de los implantes de titanio puede complementar las propiedades mecánicas del titanio y superar sus deficiencias relacionadas con la mala actividad biológica; es decir, el titanio como sustrato puede proporcionar propiedades mecánicas, y como revestimiento se utilizan elementos con buena estructura superficial y actividad biológica. Esta capa proporciona actividad biológica y la investigación en esta área se ha convertido en un punto de acceso para la investigación.
En la actualidad, las tecnologías utilizadas para la preparación de recubrimientos bioactivos en superficies metálicas incluyen principalmente la pulverización de plasma, la deposición asistida por haz de iones, la deposición electroforética, la deposición física de vapor por láser pulsado, la oxidación por microarco, la deposición por pulverización catódica de magnetrón, el sol-gel, el revestimiento por láser directo y ablación con láser [3,4,5,6,7,8,9,10]. Entre ellos, la tecnología de pulverización de plasma tiene aplicaciones comerciales; sin embargo, la tecnología de recubrimiento actual todavía no puede cumplir con los requisitos clínicos, principalmente debido a los siguientes problemas:la fase bioactiva del recubrimiento tiene baja cristalinidad y poca bioactividad; la fuerza de unión entre el revestimiento y el sustrato no es buena; el material interno del revestimiento se disuelve fácilmente, lo que afecta la estabilidad a largo plazo del revestimiento en el cuerpo; y el proceso de preparación del recubrimiento es demasiado complicado, las condiciones del proceso son estrictas, el costo es alto y la eficiencia es baja [11].
La oxidación por microarco, una tecnología eficaz de modificación de superficies que actualmente se utiliza ampliamente en la modificación de superficies de implantes metálicos, utiliza el efecto de sinterización instantánea del plasma a alta temperatura y alta presión; no solo la superficie del material genera una superficie rugosa y porosa, sino que también se pueden introducir elementos biológicamente activos en el revestimiento. La superficie del material modificada por la tecnología de oxidación por microarco puede mejorar significativamente la morfología de la superficie, la rugosidad, la hidrofobicidad y la energía superficial del material de la matriz y otras propiedades físicas y químicas, de modo que la actividad biológica y la biocompatibilidad del material mejoran enormemente. La osteointegración entre el material importado y el tejido óseo es de gran importancia [12].
El cobre (Cu) es un oligoelemento esencial en el cuerpo humano que tiene una variedad de funciones, incluida la promoción del crecimiento de los osteoblastos y la promoción de la expresión del factor de crecimiento del endotelio vascular en los tejidos de la íntima, que es beneficioso para la adhesión y proliferación del endotelio vascular. células. El Cu también mejora la reacción de peroxidación de lípidos, inhibe la síntesis de ADN bacteriano activo y enzimas relacionadas que interfieren con el metabolismo energético bacteriano y no conduce fácilmente a la resistencia a los fármacos [13]; lo que es más importante, se reconoce que los iones de cobre en un cierto intervalo de concentración tienen una alta actividad biológica y excelentes propiedades antibacterianas. Por lo tanto, se ha demostrado que los iones de cobre tienen una buena biocompatibilidad cuando se utilizan en el diseño de biomateriales [14].
La interacción entre las células y el implante es un factor importante para inducir la formación de una interfaz de osteointegración. Esta interacción depende principalmente de las propiedades del material de la superficie del implante, como la composición química de la superficie, la energía superficial, la carga superficial y la morfología de la superficie. Esta interacción entre células e implantes puede afectar la adhesión, proliferación y diferenciación celular. Se ha demostrado que una superficie porosa mejora la adhesión, proliferación y diferenciación celular, y también se ha demostrado que los implantes dopados con iones inorgánicos (zinc, estroncio, magnesio, etc.) promueven la osteointegración [15, 16].
El proceso del equipo de oxidación por microarco es simple y las propiedades del recubrimiento preparado se pueden ajustar. Se pueden preparar revestimientos dopados con diferentes iones cambiando la composición del electrolito. El cobre juega un papel importante en el organismo. La cantidad apropiada de iones de cobre en el recubrimiento puede promover la proliferación de osteoblastos e inhibir la adhesión de bacterias superficiales. Por lo tanto, en este estudio, preparamos un Cu – TiO 2 microporoso recubrimiento en la superficie de titanio y se utilizaron experimentos con células in vitro y experimentos con animales para observar y analizar el efecto del microporoso Cu – TiO 2 Recubrimiento sobre la actividad superficial y biocompatibilidad del titanio. También buscamos explorar la viabilidad de Cu – TiO 2 microporoso Recubrimiento como un nuevo tipo de material de recubrimiento de implantes para mejorar la adhesión, proliferación y diferenciación osteogénica de las células MC3T3-E1 y promover la formación y osteointegración de hueso nuevo en la interfaz implante-hueso para sentar una base teórica y experimental para la aplicación clínica de microporoso Cu – TiO 2 recubrimiento en la superficie de los implantes de titanio.
Materiales y métodos
Preparación y caracterización de muestras
Mediante corte con alambre, el titanio se procesó en una muestra con un diámetro de 12 mm y un espesor de 1 mm. Los implantes se convirtieron en varillas de titanio con un diámetro de 3 mm y una longitud de 8 mm. El papel de lija se alisó y se lavó con acetona y agua desionizada para preparar el revestimiento. En este estudio, se utilizó una fuente de alimentación de oxidación de microarco de baja potencia casera; el voltaje de oxidación del microarco fue de 450 V, el modo fue de corriente constante, el tiempo de oxidación del microarco fue de 5 min y la frecuencia fue de 1000 Hz.
El grupo de control en blanco se marcó con Ti, y se utilizaron acetato de calcio y glicerofosfato de calcio como soluciones de electrolitos básicos. Las muestras de Ti después de la oxidación por microarco en la solución de electrolito básico se marcaron con TCP, y las muestras después de la oxidación por microarco con diferentes contenidos de óxido de cobre en la solución de electrolito básico se marcaron con TCP Cu I y TCP Cu II (Tabla 1).
Se usó microscopía electrónica de barrido de emisión de campo (FE-SEM) para observar la morfología de la superficie de las muestras, se usó espectroscopía de dispersión de energía (EDS) para observar la distribución de elementos en la superficie del recubrimiento, y se usó un perfilador de rugosidad superficial para evaluar la rugosidad de diferentes muestras. Se utilizó difracción de rayos X (XRD) y espectroscopía de fotoelectrones de rayos X (XPS) para observar la composición elemental y la microestructura de la fase de recubrimiento y el estado químico.
Cultivo celular
Se utilizaron células MC3T3-E1 (extraídas de células de cráneo de ratón) para pruebas de células in vitro. Las células se incubaron en MEM con 10% de suero bovino fetal α a 37 ° C en CO 2 al 5% . Cuando las células se fusionaron y crecieron hasta una densidad del 80%, se digirieron y se pasaron con tripsina al 0,25%. El tercer pase se utilizó para experimentos celulares.
Tinción viva / muerta
La citotoxicidad de cada grupo se evaluó mediante tinción de fluorescencia viva / muerta. La densidad de siembra celular fue de 1,5 × 10 4 células / cm 2 . Después de 3 días de cultivo, las muestras se enjuagaron con PBS estéril y se trataron de acuerdo con el kit de viabilidad / citotoxicidad viva / muerta. La citotoxicidad del material se observó mediante microscopía de fluorescencia.
Adhesión y proliferación celular
Las células se inocularon en la superficie de cada grupo a una densidad de 1,5 × 10 4 células / cm 2 . Después de incubar durante 1 h, 2 hy 6 h, las células se aclararon con PBS y se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 30 min. Después de enjuagar con PBS, se dejaron caer 40 μL de agente de tinción DAPI sobre la superficie de la muestra durante 10 minutos para evitar la tinción con luz, y las muestras se observaron y se tomaron imágenes con un microscopio confocal láser.
La densidad de siembra celular y el método de cultivo fueron los mismos que los anteriores, y la actividad de proliferación de las células se midió con el kit CCK-8 1, 3 y 10 días después del cultivo celular.
Expresión de genes relacionados con la diferenciación osteogénica
La densidad de inoculación celular y el método de cultivo fueron los mismos que los anteriores. Las células se recolectaron 1, 3 y 10 días después de la inoculación, y se utilizó PCR cuantitativa en tiempo real para detectar los niveles de ARNm de genes relacionados con la diferenciación osteogénica (incluido BMP , COL-I, ALP y OCN ). Los niveles de expresión de los genes diana se normalizaron a los del gen de mantenimiento GAPDH . Los juegos de cebadores se enumeran en la Tabla 2.
Animales y cirugía
Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales del Hospital Popular Provincial de Guizhou. Se compraron dieciséis conejos adultos, machos y hembras, que pesaban 3,6 kg (3,2-3,9 kg) en el Centro de Animales Experimentales de la Universidad de Soochow y se dividieron en un grupo experimental y un grupo de control (8 conejos cada uno). Se realizó anestesia intravenosa con pentobarbital sódico al 3% (0,1 mL por kilogramo de peso corporal). Después de la preparación de la piel, la piel se fijó y desinfectó de forma rutinaria. Se hizo una incisión longitudinal en el cóndilo femoral lateral para exponer el cóndilo lateral. Utilizando un taladro eléctrico quirúrgico, se taladró un orificio con un diámetro de 2,7 mm y una profundidad de 6 mm en una superficie plana. Se implantaron dos juegos de varillas de titanio en el defecto óseo (la izquierda en el grupo experimental y la derecha en el grupo de control) y se administró penicilina durante 3 días consecutivos después de la operación para prevenir infecciones.
Ensayo de micro-TC
Después de la operación, los conejos se mantuvieron en jaulas separadas y pudieron comer y beber agua. A las 4 y 8 semanas después de la operación, se sacrificaron 8 conejos mediante embolización de aire. Se retiraron los cóndilos femorales de los conejos que contenían varillas de titanio en el grupo experimental y el grupo de control, se recortó el tamaño de la muestra, se fijaron las muestras con formalina y se utilizó una exploración micro-CT para la reconstrucción tridimensional. La región de interés (ROI) se estableció mediante el software Micro-CT y se midió la fracción de volumen óseo de la región de interés (volumen óseo / volumen total, BV / TV%).
Evaluación histológica mediante tinción con azul de toluidina y azul de fucsina-metileno
Las muestras se deshidrataron con gradiente de alcohol (70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 100%). Las muestras deshidratadas se embebieron con metacrilato de metilo. Después de la incrustación exitosa, las muestras se cortaron y recortaron, se fijaron en una rebanadora con adhesivo para cortar y finalmente se pulieron con papel de lija hasta un grosor de rodajas de aproximadamente 20-30 μm. (1) Tinción con azul de toluidina:se añadió colorante azul de toluidina a la superficie de la rodaja y la rodaja se tiñó en un baño de agua. El tinte de la superficie se secó con papel de filtro, se enjuagó y se secó de forma natural al aire. La película se selló y se observó al microscopio óptico. (2) Tinción con azul de fucsina-metileno:el método fue el mismo que la tinción con azul de toluidina. Primero, se añadió una solución de tinción de azul de metileno a la superficie de las rodajas para teñir, se secó al aire y se enjuagó. Luego, las rodajas se empaparon en una solución de tinción de fucsina para teñir, se secaron naturalmente al aire, se sellaron y se observaron.
Análisis estadístico
Los datos se expresan como la media ± desviación estándar determinada por el software SPSS 16.0. Se utilizaron ANOVA de una vía y la prueba SNK para comparar las diferencias entre grupos. P <0.05 indica una diferencia significativa.
Resultados
La morfología de la superficie, la fase y la composición del elemento químico de la muestra
La Figura 1 muestra las morfologías de superficie SEM de diferentes muestras. Las morfologías del grupo Ti y otros grupos son significativamente diferentes. El grupo Ti no tiene agujeros en la superficie y la superficie es relativamente plana, dejando solo algunos rasguños. El grupo TCP tiene una morfología de superficie de oxidación de microarcos típica, y la superficie está cubierta con microporos de diferentes tamaños. Estos microporos se cruzan entre sí y tienen una "estructura tridimensional" aproximada. Los poros grandes y pequeños están anidados entre sí y los poros no tienen reglas fijas. La forma es irregular. Además, hay marcas de quemaduras en los espacios entre los orificios. Similar a la morfología de la superficie del grupo TCP, las superficies de los grupos TCP Cu I y TCP Cu II también están cubiertas por microporos de forma irregular, y no hay una diferencia obvia en la morfología de la superficie entre los grupos. El dopaje del cobre no afecta la estructura y morfología de los microporos.
Morfologías superficiales de Ti, TCP, CP Cu I y TCP Cu II
La Figura 2 muestra el diagrama de mapeo y EDS del microporoso Cu – TiO 2 revestimiento Como se ve en el diagrama EDS, el Cu – TiO 2 microporoso El revestimiento está compuesto de Cu, Ti, Ca, P y O. La solución que contiene Cu, Ca y P se incorporó completamente al revestimiento. Más importante aún, no encontramos otros elementos tóxicos y dañinos. Los resultados del mapeo del microporoso Cu – TiO 2 El revestimiento muestra que el cobre, el calcio y el fósforo se distribuyen uniformemente en el revestimiento.
Mapeo y diagrama EDS del Cu – TiO 2 revestimiento (TCP Cu II)
La Figura 3 muestra los patrones XRD de Ti, TCP, TCP Cu I y TCP Cu II. Todos los recubrimientos son principalmente Ti, rutilo y anatasa. Más importante aún, CuO apareció en el microporoso Cu – TiO 2 revestimiento, que indicó que el cobre existía en forma de CuO.
Patrones XRD de Ti, TCP, TCP CuI y TCP CuII
La Figura 4 es la imagen XPS del microporoso Cu – TiO 2 revestimiento. La Figura 3a muestra el espectro completo del microporoso Cu – TiO 2 recubrimiento determinado por espectroscopia de fotoelectrones de rayos X, que es similar al resultado de EDS, excepto para titanio, oxígeno, calcio y fósforo. Además de los picos característicos del cobre, también hay picos característicos del cobre. El pico en el Ti2 p el espectro corresponde a TiO 2 y el pico de Cu2 p a 932,7 eV se considera indicativo de CuO [17, 18].
Imagen XPS del microporoso Cu-TiO 2 revestimiento. un Espectro XPS, b Ti2 p , c Cu2 p , d Ca2 p , e P2 p y f O1 s espectros
La Figura 5 muestra la morfología del perfilómetro de diferentes muestras. A excepción de las muestras de Ti, la morfología de la superficie del perfilómetro de cada grupo es similar, lo que muestra una estructura de cavidad de poros multietapa similar a un volcán. Un análisis más detallado de la rugosidad Ra de cada grupo mostró que la rugosidad de TCP, TCP CuI y TCP CuII era mayor que la de Ti. La rugosidad de TCP, TCP CuI y TCP CuII es similar, y la diferencia no es significativa, lo que indica que la oxidación por microarco aumenta la rugosidad del Ti, pero el dopaje con cobre no afecta la rugosidad de las muestras.
Morfología de perfilómetro de diferentes muestras
Adhesión y proliferación celular
La Figura 6a muestra imágenes de adherencia celular 1, 2 y 6 h después de la tinción con DAPI. En la Figura 6b, el número de células MC3T3-E1 adheridas a las superficies de diferentes muestras en diferentes momentos. Los números de células adherentes en diferentes grupos de muestras en diferentes puntos de tiempo se organizan en el siguiente orden:TCP Cu II> TCP Cu I> TCP> Ti. En comparación con los grupos Ti y TCP, el número de células adherentes en los grupos TCP Cu I y TCP Cu II aumentó significativamente. Por lo tanto, el microporoso Cu – TiO 2 El recubrimiento puede promover significativamente la adhesión celular.
Adhesión y proliferación de células MC3T3-E1 en las superficies de diferentes muestras. un Imágenes de adherencia celular 1, 2 y 6 h después de la tinción con DAPI, b gráfico de barras de células adherentes y c gráfico de barras de la proliferación celular (los datos se presentan como media ± DE, n =5. ** p <0.01 en comparación con el grupo TCP)
La Figura 6c muestra la proliferación de células MC3T3-E1 en la superficie de diferentes muestras en diferentes momentos. Similar a la tendencia de adhesión de las células anteriores, la proliferación celular de los grupos TCP Cu I y TCP Cu II fue significativamente mayor que la de los grupos Ti y TCP. La morfología de la superficie del microporoso Cu – TiO 2 el revestimiento y los iones de cobre juntos promovieron la proliferación celular.
La Figura 7 muestra los resultados de la tinción de EdU. La proporción de núcleos positivos para EdU siguió este orden:TCP CuII> TCP CuI> TCP> Ti. En comparación con el grupo Ti, la proliferación de células en el grupo TCP CuII difirió significativamente.
Tinción de EdU medida después de 3 días de cultivo (los datos se presentan como media ± DE, n =5. ** p <0.01 en comparación con el grupo TCP)
Tinción viva / muerta
La citocompatibilidad es el requisito básico de los materiales de implantes. La tinción fluorescente viva / muerta puede evaluar la citotoxicidad y biocompatibilidad de los materiales. La Figura 8 muestra los resultados de la tinción de células vivas / muertas después de que las células se cultivaron en la superficie de diferentes muestras durante 3 días. Solo había unas pocas células muertas (rojas) en la superficie de cada grupo de muestras, lo que indica que no hay citotoxicidad obvia. Dopaje de cobre en el microporoso Cu – TiO 2 obviamente, el recubrimiento no aumenta la citotoxicidad y tiene una buena compatibilidad celular.
Tinción de células vivas / muertas en las superficies de diferentes muestras (los datos se presentan como media ± DE, n =5. ** p <0.01 en comparación con el grupo TCP)
Expresión de genes de diferenciación osteogénica
La Figura 9 muestra los niveles de expresión de ARNm de genes de diferenciación osteogénica ( BMP , OCN , ALP y COL-I ) en las células de la superficie de cada grupo de muestras en diferentes momentos. Con el tiempo, la expresión de genes de diferenciación osteogénica en la superficie de cada grupo de muestras aumentó gradualmente. Al mismo tiempo, la expresión de cada grupo de genes mostró la siguiente tendencia:TCP Cu II> TCP Cu I> TCP> Ti. En comparación con los grupos Ti y TCP, la expresión de genes de diferenciación relacionados con el hueso compuestos de TCP Cu I y TCP Cu II se mejoró significativamente, lo que indica que el microporoso Cu – TiO 2 El recubrimiento puede promover la diferenciación osteogénica.
La expresión de ARNm de BMP , OCN , ALP y COL-I después de 1, 3 y 10 días de incubación (los datos se presentan como media ± DE, n =5. * p <0.05 en comparación con el grupo TCP, ** p <0.01 en comparación con el grupo TCP)
Observación general y análisis de micro-TC
La Figura 10 muestra los resultados de la observación macroscópica y la reconstrucción con micro-TC del cóndilo femoral. La observación general mostró que los implantes en los dos grupos estaban en el medio del cóndilo femoral a las 4 y 8 semanas con un buen posicionamiento, sin infección obvia y sin aflojamiento del implante. La reconstrucción tridimensional de micro-TC muestra que con el tiempo, el tejido óseo nuevo en la superficie de los dos grupos de muestras a las 8 semanas fue mayor que a las 4 semanas, y en diferentes momentos, se formó tejido óseo nuevo en la superficie. del microporoso Cu – TiO 2 -implante de titanio recubierto, y la cantidad fue mayor que la del grupo de control. Al comparar la fracción de volumen óseo de los dos grupos, la fracción de volumen óseo (BV / TV) de Cu – TiO microporoso 2 El titanio recubierto fue significativamente más alto que el del grupo de control en blanco. Cu – TiO microporoso 2 -el titanio recubierto puede promover la osteointegración de los implantes de titanio.
Se observó observación macroscópica y reconstrucción con micro-TC del cóndilo femoral a las 4 y 8 semanas después de la implantación
Evaluación histológica
La Figura 11 muestra los resultados de la tinción con azul de toluidina y azul de fucsina-metileno. No se observó envoltura de fibra en la interfaz hueso-implante, lo que indica que el implante de titanio no tuvo una reacción inflamatoria en la interfaz con el hueso. Pueden verse espacios blancos en los espacios de la interfaz hueso-implante de titanio en los dos grupos. El ancho de los espacios blancos en el grupo de control fue mayor que el del microporoso Cu – TiO 2 titanio recubierto. Cuanto mayor sea la brecha, más débil será la inducción de tejido óseo nuevo por parte de los implantes. La tinción con azul de toluidina muestra la banda azul en el espacio entre el implante y el hueso, que es el hueso nuevo. Cu – TiO microporoso 2 el titanio recubierto tenía más tejido óseo que el grupo de control, lo que indica que el Cu-TiO 2 microporoso El recubrimiento puede promover mejor la osteogénesis y tiene un mejor efecto de osteointegración. La matriz ósea alrededor del microporoso Cu – TiO 2 el titanio recubierto era más grueso y continuo, y el tejido óseo aumentó significativamente. Por el contrario, el grupo de control tenía menos hueso. Este resultado muestra que el Cu – TiO 2 microporoso el titanio recubierto puede promover mejor la osteogénesis y tiene un mejor efecto de osteointegración.
Tinción con azul de toluidina y azul de fucsina-metileno de la formación de hueso nuevo a las 4 y 8 semanas después de la implantación
Discusión
El titanio metálico y sus aleaciones son ampliamente utilizados en odontología, cirugía plástica y otros campos debido a sus excelentes propiedades mecánicas y biocompatibilidad; sin embargo, el titanio como implante solo puede combinarse pasivamente con tejido óseo. Esta combinación es a menudo una combinación mecánica, que tiende a aflojarse y hundirse del implante, lo que lleva al fracaso del implante. En la actualidad, el método de modificación de la superficie del implante se utiliza principalmente para mejorar su capacidad de osteointegración [19]. La superficie del implante ideal debe tener tanto osteoconductividad como osteoinductividad, buena biocompatibilidad y promover la formación de osteointegración entre el implante y el tejido óseo [20]. En este estudio, preparamos un innovador Cu – TiO 2 microporoso Recubrimiento en la superficie del titanio, con la esperanza de mejorar la actividad biológica y la biocompatibilidad del titanio y superar las deficiencias de los implantes de titanio en las aplicaciones clínicas actuales.
Se ha demostrado que los iones de cobre y el dióxido de titanio tienen una buena actividad biológica [21]. En este estudio, el microporoso Cu – TiO 2 El recubrimiento preparado por oxidación por microarco en la superficie de titanio mostró la mayor ventaja de unión firme entre el recubrimiento y el sustrato de titanio, lo que ha sido confirmado en la literatura [22]. La buena fuerza de unión del recubrimiento de oxidación por microarco está estrechamente relacionada con el proceso de formación. En el proceso de oxidación por microarco coexisten la oxidación química, la oxidación electroquímica y la oxidación del plasma. Bajo la acción de la alta temperatura y alta presión instantáneas generadas por la descarga del arco, la superficie de titanio crece sobre la superficie del sustrato en forma de "crecimiento", principalmente el óxido del sustrato. El revestimiento cerámico, el revestimiento y los dientes caninos del sustrato están escalonados y tienen una buena fuerza de unión [23].
Las características de la superficie de los materiales biológicos afectan directamente las características biológicas de los materiales. El recubrimiento de oxidación por microarco presenta una morfología superficial rugosa y porosa bajo un microscopio electrónico. La morfología está compuesta principalmente por microporos de diferentes tamaños que se interpenetran entre sí. Estos pequeños poros se forman en el proceso de oxidación por microarco, la superficie del metal se descompone bajo alto voltaje y la sinterización instantánea a alta temperatura en la zona de microarco oxida y sinteriza directamente la matriz de titanio en una película cerámica con una estructura de fase cerámica cristalina. , donde se produce una avería eléctrica. Se forman los microporos observados bajo el microscopio electrónico. These rough and porous structures can not only increase the attachment area of tissue cells, but these interpenetrating micropores are also equivalent to a three-dimensional scaffold structure, which can induce bone tissue to grow into the pores and promote cell adhesion and extension. Pan et al. [24] prepared micro/nanohierarchical structured TiO2 coatings on polished titanium by micro-arc oxidation and found that the coatings were favorable for the adhesion and extension of MG63 cells. Zhang y col. [25] prepared a Si–TiO2 coating by micro-arc oxidation, and further study showed that the adhesion of MC3T3-E1 cells on this silicon-containing TiO2 coating was significantly higher than that on a Si-free TiO2 coating and pure Ti.
The greatest advantage of the microarc oxidation coating is that the ions in the electrolyte solution can be introduced into the coating during the microarc oxidation process. In this study, the EDS analysis results of the coating surface showed that the microporous Cu–TiO2 coating is mainly composed of Cu, Ca, P, O and Ti elements, of which titanium comes from the matrix, calcium and phosphorus come from the basic electrolyte solution, and the copper ions in the electrolyte are deposited in the coating along with the formation of the ceramic film. The calcium and phosphorus components on the surface of the implant can not only improve the surface properties of the material but also induce bone formation. In addition to calcium and phosphorus, the copper ions in the microporous Cu–TiO2 coating have good biocompatibility and biological activity. Copper-doped coatings on the surface of implants have also been reported in the literature. Astasov-Frauenhoffer et al. [26] deposited copper on Ti via a spark-assisted anodization method and confirmed that the viability of the bacterial cells was strongly inhibited. Zong et al. [27] combined anodization and magnetron sputtering to combine copper into TiO2 nanotubes and prepare copper (Cu) into TiO2 NTAs (Cu–Ti–O NTAs), and further study showed that Cu–Ti–O NTAs have excellent long-term antibacterial ability and favorable angiogenic activity.
Biocompatibility is the minimum requirement for measuring implants and is also the basic guarantee for implant safety. In this study, biologically active copper was introduced into the surface of titanium implants through microarc oxidation; however, copper ions, as heavy metal ions, have potential toxicity. Therefore, we must consider whether the microporous Cu–TiO2 coating is cytotoxic. In this study, live/dead cell staining was used to evaluate the microporous Cu–TiO2 revestimiento. The results showed no obvious cytotoxicity on the surface of the microporous Cu–TiO2 coating on the titanium surface, and good cell compatibility was observed. We speculate that this finding may be related to the low copper content of the coating. Huang et al. [28] fabricated gap-bridging chitosan–gelatin nanocomposite coatings incorporated with different amounts of copper (Cu; 0.01, 0.1, 1, and 10 mM for Cu I, II, III, and IV groups, respectively) on Ti and demonstrated that the activities of bone marrow stromal cells were not impaired on Cu-doped coatings except for the Cu IV group.
Cell adhesion and proliferation are the basis of implant osseointegration in the later stage. The more cells that adhere and proliferate on the surface of the implant, the better the effect of implant-bone interface osseointegration. The results of this study showed that on the first day after the material surface was inoculated, the amount of cell adhesion on the surface of the samples of each group differed, and the amount of adhesion on the surface of the microporous Cu–TiO2 coating group increased significantly. The number of cells that adhered to the sample surface gradually increased, but the number of cells that adhered to the group with microporous Cu–TiO2 coating was significantly greater than that of the other two groups. The difference was statistically significant, indicating that the microporous Cu–TiO2 coating was doped with copper ions. A porous, rough surface is most conducive to cell adhesion. Similar to cell adhesion, cell proliferation on the surface of each group of materials also showed similar results. Our research results are similar to previous reports [29].
In addition to adhesion and proliferation, the degree of cell differentiation on the surface of the material can further reflect the performance of the implant's osseointegration. The osteogenic differentiation marker genes ALP , BMP , RUNX2 , OCN and COL-I can reflect cell differentiation. In this study, as time went by, the expression of BMP, OCN, ALP and COL-I on the surface of each group of samples increased, but the expression of the microporous Cu–TiO2 coating group was significantly higher than that of the control group. This finding is closely related to the promotion of osteogenic differentiation by copper ions. Komarova et al. [30] prepared Zn- and Cu-containing CaP-based coatings by microarc oxidation on Ti and showed that low amounts of Cu and Zn in the coatings promoted high motility of human adipose-derived multipotent mesenchymal stromal cells and subsequent ability to differentiate into osteoblasts.
Osseointegration is the key to the success or failure of the implant. This means that there is no fibrous tissue between the implant and the bone tissue. There is direct contact between the implant and the bone tissue, and it can directly bear stress to realize the relationship between the implant and the bone tissue, establishing a functional connection. The osseointegration between orthopedic implants and bone tissue is affected by many factors, such as the initial stability of the implant and the mechanical properties of the implant material, implant surface properties, biocompatibility, biological activity and the condition of the surrounding bone tissue [31].
An ideal implant position and a stable biomechanical environment are the prerequisite and basis for the osseointegration of the implant-bone interface. In this study, the femoral condyle was chosen to be implanted with a copper-doped microporous coating because the abundant blood supply and sufficient bone volume at the femoral condyle can provide a good anatomical basis and a relatively stable mechanical environment for the implant. Moreover, the femoral condyle is mostly cancellous bone. After implantation, bone formation and the effect of implant-bone interface osseointegration can be more intuitively evaluated.
Micro-CT is currently a common method for observing the osteogenesis performance of implants and is also an effective method for evaluating the osseointegration between implants and bone tissue. Bone microstructure is visualized through three-dimensional reconstruction and the region of interest (ROI) analysis with the assistance of related software to obtain the relevant parameters of new bone tissue. Among all the parameters, BV/TV represents the total amount of bone formation and is an important indicator reflecting the osseointegration of the implant. In this study, we chose BV/TV as the detection index. Four weeks after implantation, the BV/TV of the microporous Cu–TiO2 coating group was higher than that of the control group. Eight weeks after implantation, the BV/TV values of the microporous Cu–TiO2 coating group and the control group were higher than those at 4 weeks, and the BV/TV of the microporous Cu–TiO2 coating group was higher than that of the control group. On the basis of micro-CT detection, we performed histological observation and quantitative analysis of the bone tissue around the implant through hard tissue slices. The results of VG staining showed that the microporous Cu–TiO2 coating group formed more new bone than the control group, and the new bone that formed around it was in direct contact with the internal implant without fibrous tissue infiltration. These results indicate that microporous Cu–TiO2 coating on the titanium surface can promote the osseointegration of titanium implants. This finding is similar to previous in vitro studies. The rough, porous structure produced by microarc oxidation mimics the micro/nanostructure of normal bone tissue. More importantly, biologically active copper ions promote bone tissue regeneration. Under the action of these common factors, bone tissue regeneration on the surface of the implant is promoted. Our research results are consistent with literature reports. Milan et al. [32] designed a multifunctional Cu/a-C:H thin coating deposited on Ti–6Al–4 V alloy (TC4) via magnetron sputtering and found that the coating composition can stimulate angiogenesis and osteogenesis and control the host response, thereby increasing the success rate of implants.
Conclusion
In summary, we prepared a microporous Cu–TiO2 coating on a titanium surface by microarc oxidation. The surface of the coating has a porous structure with pores of different sizes and interconnected pores. The coating increases the surface roughness of Ti and copper is evenly distributed on the surface of the coating. In vitro studies revealed that the coating has no obvious cytotoxicity and can promote the adhesion, proliferation and differentiation of MC3T3-E1 cells. In vivo experiments further confirmed that the coating can induce the formation of new bone tissue and promote osseointegration at the titanium implant-bone interface. In view of the biological activity in vivo and in vitro, we believe that the microporous Cu–TiO2 coating on the surface of titanium implants has potential clinical application value in orthopedics.
Disponibilidad de datos y materiales
Not applicable.
Abreviaturas
- MAO:
-
micro-arc oxidation
- Cu:
-
copper
- Zn:
-
zinc
- Cu–TiO2 coating:
-
copper–titanium dioxide coating
- ROI:
-
region of interest
- ALP:
-
alkaline phosphatase
Nanomateriales
- Blanco de aleación de tungsteno y titanio para chips
- Consejos para usar sartenes de titanio
- 3 claves para mejorar el rendimiento de la planta
- Recubrimiento nano para varios colores
- ¿Por qué se utiliza titanio para implantes ortopédicos?
- Nanopartículas de oro multifuncionales para aplicaciones terapéuticas y diagnósticas mejoradas:una revisión
- El precursor de titanio óptimo para la fabricación de una capa compacta de TiO2 para células solares de perovskita
- 7 recubrimientos de herramientas imprescindibles para el mecanizado de alto rendimiento
- Perfomax:optimizado para titanio
- Revestimiento de película fina de nitruro de titanio y niobio
- 7 beneficios del uso de recubrimientos en polvo en la fabricación