Espectroscopía integrada a microscopía: Análisis preciso UV-Vis-NIR de muestras a microescala

Un instrumento hifenado es aquel que combina las capacidades de dos tecnologías diferentes para formar una nueva técnica analítica con habilidades novedosas. El espectrofotómetro de microscopio es uno de esos instrumentos hifenados; es un híbrido que combina el poder de aumento de un microscopio óptico con las competencias analíticas de un espectrofotómetro de rango UV-visible-NIR. Como tal, los espectrofotómetros de microscopio pueden usarse para medir los espectros moleculares de áreas de muestra microscópicas desde el ultravioleta profundo hasta la región del infrarrojo cercano. Pueden configurarse para muchos tipos diferentes de espectroscopía y, como tal, se usan para medir absorbancia, reflectancia e incluso espectros de emisión, como fluorescencia y fotoluminiscencia, de muestras de tamaño micrónico. Con la adición de algoritmos especializados, el espectrofotómetro de microscopio también puede usarse para medir el espesor de películas delgadas o actuar como colorímetro para muestras microscópicas.

Hay muchas razones para usar el espectrofotómetro de microscopio. La más obvia es que los espectros pueden adquirirse de un área de muestra menor a un micrón. Además, estos instrumentos requieren solo pequeñas cantidades de muestras ya sea en forma sólida o líquida. Otra ventaja es que se requiere muy poca o ninguna preparación para muchas muestras. Y las comparaciones de color por espectroscopía tienden a ser más precisas con espectrofotómetros porque estos instrumentos tienen un rango espectral más amplio, pueden corregir variaciones de iluminación y pueden medir la intensidad de cada banda de longitud de onda de luz.

Antes del advenimiento de la microespectroscopía, la única forma de analizar muchos tipos de muestras microscópicas era usar pruebas micro-químicas y luego algún tipo de examen visual. Desafortunadamente, estos métodos tienden a ser destructivos, requieren muchas muestras y sufren de las inexactitudes del sistema visual humano. El espectrofotómetro de microscopio evita estos problemas y puede "ver" más allá del rango del ojo humano y detectar variaciones que de otro modo no serían aparentes.

Diseño del espectrofotómetro de microscopio

El espectrofotómetro de microscopio integra un microscopio óptico o de luz con un espectrofotómetro de rango UV-visible-NIR (Figura 1). El microscopio es un dispositivo diseñado para agrandar una imagen de objetos pequeños para permitir su estudio. El espectrofotómetro es un instrumento que mide la intensidad de cada longitud de onda de luz desde el ultravioleta a través del visible y regiones del infrarrojo cercano. Con un espectrofotómetro de microscopio correctamente configurado, se pueden adquirir espectros de absorbancia, reflectancia y emisión con áreas de muestreo en escala submicrónica.

Para cubrir un rango espectral tan amplio con buena calidad de imagen y espectral, se construye un microscopio diseñado a medida e integrado con el espectrofotómetro. Los microscopios ópticos estándar tienen un rango espectral limitado que cubre solo una porción de la región visible debido a los materiales usados para la óptica y las fuentes de luz mismas. El moderno espectrofotómetro de microscopio utiliza un microscopio construido a medida con diseño óptico y fuentes de luz optimizadas para el UV profundo hasta el NIR.

El espectrofotómetro en sí también debe diseñarse para microespectroscopía para obtener buenos resultados espectrales. Esto significa que el espectrofotómetro debe ser altamente sensible mientras mantiene una resolución espectral aceptable. La estabilidad también es un problema ya que el espectrofotómetro de microscopio es un instrumento de haz único y los espectros de referencia deben obtenerse antes de medir la muestra. El instrumento también debe tener un alto rango dinámico ya que uno cambia frecuentemente de microespectroscopía de transmisión o reflectancia a espectroscopía de fluorescencia al medir la misma muestra. Esto permite obtener diferentes tipos de información espectral de exactamente la misma ubicación en la muestra microscópica.

La integración del espectrofotómetro con el microscopio es críticamente importante. Mientras el microscopio y espectrofotómetro deben estar ambos optimizados para microespectroscopía, la clave para la operación de un espectrofotómetro de microscopio es el hardware que les permite trabajar juntos. Esta interfaz tiene varios requisitos básicos. Lo más importante, debe canalizar la energía electromagnética recogida por el microscopio de la muestra hacia el espectrofotómetro. Sin embargo, el usuario debe poder visualizar el área de medición de la muestra, pero también ver la muestra circundante. Esto se hace teniendo la apertura de entrada del espectrofotómetro en el mismo plano focal que la imagen de la muestra. La muestra puede entonces moverse con la platina del microscopio, como se haría normalmente con un microscopio, hasta que la imagen de la apertura de entrada esté sobre el área a medir. En la Figura 2, el cuadrado negro en el centro de la imagen es la apertura de entrada del espectrofotómetro. Todo esto se hace en tiempo real para que la espectroscopía de muestras de microscopio sea rápida y fácil.

Como se muestra en la Figura 3, la óptica del microscopio enfoca luz sobre la muestra. La energía electromagnética es luego recogida de la muestra por el objetivo del microscopio. La luz del objetivo es enfocada sobre la apertura de entrada espejada del espectrofotómetro. La mayoría de la luz es reflejada desde la superficie de la apertura de entrada hacia la cámara. La apertura del espectrofotómetro también es imagenada por la cámara para que aparezca como un cuadrado negro en la muestra (Figura 2). Esto permite alineación fácil y rápida del espectrofotómetro de microscopio. La luz que pasa a través de la apertura de entrada luego pasa al espectrofotómetro donde se mide un espectro.

El microscopio puede configurarse con diferentes esquemas de iluminación dependiendo del tipo de experimento a realizar. Iluminación incidente con luz blanca permite microespectroscopía de reflectancia desde UV profundo hasta IR cercano. La iluminación incidente también puede usarse para microespectroscopía de fluorescencia o fotoluminiscencia. Además, la microespectroscopía de transmisión es posible con luz blanca enfocada sobre la muestra a través del condensador del microscopio.

Aplicaciones de la microespectroscopía

Los primeros espectrofotómetros de microscopio se desarrollaron en los años 1940 y desde entonces se han desarrollado una gran cantidad de aplicaciones diferentes. Con la capacidad de adquirir espectros de áreas de muestra microscópicas, los espectrofotómetros de microscopio se usan en todas partes, desde laboratorios universitarios hasta líneas de producción para control de calidad y análisis de fallos.

Ciencia Forense. El análisis de evidencia forense ha sido una de las aplicaciones más importantes para los espectrofotómetros de microscopio desde principios de los 80. El mayor esfuerzo fue en el análisis de evidencia traza, específicamente fibras textiles y fragmentos de pintura. Como sugieren sus nombres, estos tipos de muestras son usualmente microscópicas y, al ser evidencia, no deben ser dañadas o destruidas por las pruebas. Con fibras, los espectrofotómetros de microscopio se usan para medir los espectros de absorbancia y fluorescencia UV-visible-NIR de fibras individuales. Los fragmentos de pintura usualmente se seccionan transversalmente y luego se mide el espectro de absorbancia de cada capa para que muestras conocidas y cuestionadas puedan compararse con alto grado de discriminación.

Pantallas de panel plano. Las pantallas de panel plano modernas consisten en millones de píxeles multi-color. A medida que la tecnología ha progresado, los píxeles se vuelven cada vez más pequeños y empaquetados más densamente en superficies cada vez más grandes. Las pantallas más modernas usan diferentes tecnologías, como puntos cuánticos y diodos orgánicos emisores de luz, para crear píxeles de diferentes colores en escala microscópica. El espectrofotómetro de microscopio se usa para ayudar a desarrollar estos materiales como fuentes de luz viables y finalmente como pantallas. El espectrofotómetro de microscopio también se usa en el proceso de producción para asegurar que tanto el color como la intensidad de los píxeles sean consistentes a lo largo de toda la pantalla, asegurando imágenes brillantes e iluminadas uniformemente a lo largo de la pantalla.

Energía. El carbón y roca fuente de petróleo contienen vitrinita y otros macerales. Los espectrofotómetros de microscopio se usan para gradar la madurez térmica y, por tanto, el contenido energético, de carbón, coque y roca fuente de petróleo. Esto se hace midiendo la reflectividad absoluta de vitrinita en una muestra pulida. Dependiendo de la reflectividad, la madurez térmica de la muestra puede determinarse.

Nanotecnología. El espectrofotómetro de microscopio también está avanzando la nanotecnología y ciencia de materiales basándose en su capacidad para medir espectros de transmisión, reflectancia y emisión de áreas de muestra microscópicas. Un área de aplicaciones de rápido crecimiento es en el desarrollo y uso de resonancia de plasmones de superficie (SPR).

Los plasmones de superficie son excitados al iluminar una superficie metálica planar o partículas metálicas a nanoescala con luz (Figura 4). Cambios en las características ópticas de estos materiales ocurren cuando estas nanopartículas o superficies interactúan con otros materiales. Como tal, mucho trabajo se está haciendo para desarrollar nuevos materiales que exhiban alguna forma de resonancia de plasmon, pero también para construir dispositivos que presenten estos fenómenos. Esto incluye biosensores y sensores de dispositivos microfluídicos de varios tipos. El espectrofotómetro de microscopio mide cómo cambian los espectros de materiales SPR bajo diferentes condiciones dando al investigador la capacidad de caracterizar un nuevo material, luego "ajustar" ese material para efectos ópticos específicos.

Conclusión

El espectrofotómetro de microscopio es una técnica hifenada que combina el microscopio óptico con un espectrofotómetro para que se puedan adquirir espectros de áreas de muestra microscópicas. Tales instrumentos son capaces de espectros de absorbancia y reflectancia desde UV profundo a través del visible y hasta el infrarrojo cercano. El espectrofotómetro de microscopio también puede medir fluorescencia y otros tipos de espectros de emisión. Estos dispositivos han encontrado usos en muchos campos incluyendo ciencia forense, medición de espesor de películas semiconductoras y ópticas, biotecnología y lo último en ciencia de materiales.

Referencias

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Este artículo fue escrito por Dr. Paul Martin, Presidente, CRAIC Technologies (San Dimas, CA). Para más información, contacte al Dr. Martin en Esta dirección de correo electrónico está siendo protegida contra los robots de spam. Necesita tener JavaScript habilitado para poder verla., o visite aquí .