Potente nanohidrogel biocompatible inmunoestimulador antitumoral hecho de ADN

Métodos / Experimental

Materiales

Todos los oligonucleótidos se adquirieron de Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. y se purificaron mediante cromatografía líquida de alta resolución. Conjuntos de dNTP (100 mM cada uno), ADN polimerasa phi29 (10 U / μL) y tampón de reacción de ADN polimerasa phi29 10 × (Tris-acetato 330 mM (pH 7,9 a 37 ° C), acetato de Mg 100 mM, acetato de K 660 mM , 1% ( v / v ) Tween 20, DTT 10 mM) se adquirieron de Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EE.UU.). T4 ADN ligasa (400 U / μL), 5′-trifosadenina (ATP) y tampón de reacción de ADN ligasa T4 10 × (Tris-HCl 50 mM, MgCl ₂ 10 mM , ATP 1 mM, DTT 10 mM, pH 7,5 a 25 ° C) se adquirieron de New England Biolabs, Inc. (Ipswich, MA). La cianina 5-dCTP se adquirió de PerkinElmer, Inc. (Waltham, MA, EE. UU.). Los dispositivos de filtro centrífugo Amicon Ultra-0.5 se adquirieron de Merck KGaA (Darmstadt, Alemania). El agua utilizada en este papel fue purificada por el sistema de purificación de agua ultrapura Millipore Synergy UV. Suero bovino fetal Gibco (FBS), medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, con alto contenido de glucosa, L-glutamina, rojo fenol, piruvato de sodio, sin HEPES), tripsina-EDTA (0,25%) y penicilina (10000 U / mL) - La estreptomicina (10000 µg / ml) se adquirió en Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EE. UU.). Los kits de ELISA se adquirieron en R&D Systems, Inc. El Kit de recuento de células 8 (CCK-8) se adquirió en Dojindo (Kumamoto, Japón). La línea celular similar a macrófagos de ratón (células RAW264.7) se obtuvo del banco de células de la Academia de Ciencias de China (Shanghai, China). Las líneas celulares de glioma humano (células U251) se obtuvieron del banco de células de la Academia de Ciencias de China (Shanghai, China).

Preparación de plantillas circulares de ADN

Se mezclaron ADN de hebra sencilla larga con un grupo fosforilado en el extremo 5 'con igual proporción. velocidad de - 1 ° C / s utilizando un termociclador (Bio-Rad T100, Alemania). Después de la hibridación, se añadieron 20 U / μL de ADN ligasa de T4 con ATP y tampón de reacción de ADN ligasa de T4 y se incubó a 4 ° C durante la noche. Las enzimas estuvieron inactivas a 75 ° C durante 10 min.

Preparación de geles CpG-MCA y gel CpG-RCA

Se mezcló una plantilla de ADN circular (10 μl) con 1 × tampón de reacción de la ADN polimerasa phi29, dNTP 4 mM para cada uno, y se añadieron 5 U de ADN polimerasa phi29 y DDW estéril, 50 μl en total. La mezcla se incubó a 30 ° C con agitación durante 12 h (R12). Para la formación del gel de MCA, después de 4 h de reacción de RCA, se agregaron 500 pM de cebador 2 y cebador 3 a la mezcla resultante, respectivamente, para incubarlas durante las horas de descanso a 30 ° C sin agregar reactivos adicionales (R4M4 y R4M8). La polimerasa phi29 se inactivó a 65 ° C durante 10 min. El gel CpG-RCA y los geles CpG-MCA se purificaron mediante ultrafiltración.

Concentración de geles CpG-MCA y gel CpG-RCA

La concentración de geles CpG-MCA y gel CpG-RCA se midió basándose en el número de copias de CpG involucradas en todos los hidrogeles en el grupo de tratamiento. Dado que el dNTP añadido al sistema de reacción era 4 mM para cada uno, una plantilla circular contenía 81 nucleótidos y 1 copia de CpG. Si Abs es la absorbancia de dNTP a 260 nm y ε es el coeficiente de extinción de dNTP a 260 nm, luego se podría medir el dNTP consumido en la reacción y calcular las copias totales de CpG mediante la siguiente ecuación:copias de CpG =(4 mM × 4 - Abs / ε × 1.000.000) / 81 [13]. Abs y ε de dNTP se midieron con NanoDrop 2000c.

Electroforesis en gel de agarosa

Se utilizó electroforesis en gel de agarosa para evaluar la formación y degradación de geles CpG-MCA y la formación de una plantilla circular. Los hidrogeles se procesaron en gel de agarosa al 1% a 100 V durante 60 min, y la plantilla circular se procesó en gel de agarosa al 3% a 100 V durante 60 min.

Caracterización de geles CpG-MCA y gel CpG-RCA

Se empleó microscopía electrónica de transmisión (TEM, Hitachi HT7700, Japón) para caracterizar la estructura interna y el tamaño aproximado de los geles CpG-MCA. Los geles de CpG-MCA se examinaron por ultrasonido durante 30 min antes de depositarse sobre cobre y secarse. Las pruebas se llevaron a cabo en el laboratorio central del Hospital Renji. Se utilizó microscopía electrónica de barrido (SEM, Hitachi SU8020, Japón) para obtener la morfología de los geles CpG-MCA. Los geles de CpG-MCA se examinaron por ultrasonido durante 30 minutos antes de depositarlos en una oblea de silicio limpia y la muestra se recubrió con metal con Au.

Imágenes microscópicas confocales

Se obtuvieron imágenes de la captación celular mediante un microscopio confocal Leica. Se sembraron células RAW264.7 en una placa de Petri confocal a una densidad de 2 × 10 ⁵ células / mL. Después de lavar dos veces con tampón fosfato (PBS), las células se incubaron con CpG-ODN 100 nM marcado con Cy5, gel CpG-RCA y geles CpG-MCA en medio DMEM reciente durante 2 ha 37 °. A continuación, las células se lavaron tres veces con PBS y se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 30 min, luego se tiñeron las células con FITC-faloidina y Hoechst 33342. Todas las imágenes se tomaron usando un microscopio confocal láser Leica. La semicuantitativa de la intensidad fluorescente media fue calculada por Image J, una aplicación basada en Java para analizar imágenes.

Ensayo ELISA

Se sembraron células RAW264.7 a una densidad de 7 × 10 ⁴ células / ml en una placa de 24 pocillos cultivada durante 24 h antes de su uso. Las células se incubaron en presencia de geles de CpG-MCA y otros grupos a 37 ° C durante 8 h para TNF-α y 24 h para IL-6; se recogieron los sobrenadantes. Los niveles de citocinas en los sobrenadantes se detectaron mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) siguiendo los protocolos sugeridos por el fabricante.

Ensayo de expresión génica

Los niveles de expresión génica se analizaron mediante PCR cuantitativa en tiempo real (Q-PCR). Se sembraron células RAW264.7 a una densidad de 1 × 10 ⁶ células / mL en una placa de 6 pocillos cultivada durante 24 h antes de su uso. Las células se incubaron en presencia de geles de CpG-MCA y otros grupos a 37 ° C durante 2 h para TNF-α y TLR9 y 8 h para IL-6 y otros. El aislamiento y la purificación del ARNm se realizaron usando el reactivo TRIzol (Thermo Fisher Scientific). El ARNm extraído se cuantificó mediante NanoDrop 2000c. Se sometió a transcripción inversa un microgramo de ARN total usando el kit de reactivos PrimeScript RT con gDNA Eraser (Takara Bio Inc.); La amplificación se realizó en un volumen de reacción total de 20 μL, utilizando TB Green Premix Ex Taq II (Takara Bio Inc) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cebadores para genes son los siguientes:GAPDH:F:AGGTCGGTGTGAACGGATTTG; R:TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA; TLR9:F:ATGGTTCTCCGTCGAAGGACT; R:GAGGCTTCAGCTCACAGGG; TNF-α:F:GACGTGGAACTGGCAGAAGAG; R:TTGGTGGTTTGTGAGTGTGAG; IL-6:F:CCAAGAGGTGAGTGCTTCCC; R:CTGTTGTTCAGACTCTCTCCCT; CD86:F:GAGCTGGTAGTATTTTGGCAGG; R:GGCCCAGGTACTTGGCATT; CD206 (MRC1):F:CTCTGTTCAGCTATTGGACGC; R:CGGAATTTCTGGGATTCAGCTTC.

Ensayo de migración de heridas por raspado

Se sembraron células RAW264.7 con 70 μL a una densidad de 5 × 10 ⁵ células / mL en insertos de cultivo durante 24 h antes de su uso. Luego, los insertos se retiraron con cuidado y las células se lavaron dos veces antes de ser tratadas con cada grupo en un medio nuevo. Las fotos se recolectaron en 0 h, 6 hy 24 h; el área de la herida se midió con ImageJ. Cada grupo tuvo tres repeticiones y el experimento se repitió tres veces.

Ensayo de citotoxicidad

La citotoxicidad se evaluó usando CCK8. Se sembraron células RAW264.7 en placas de 96 pocillos y se trataron con cada grupo durante 24 h. Luego, se agregaron 10 μL de solución de CCK8 a cada pocillo, seguido de 1 a 2 h de incubación a 37 ° C. La absorbancia se midió a 450 nm, cada grupo tenía tres repeticiones y el experimento se repitió tres veces.

Células U251 cocultivadas con células RAW264.7

Las células RAW264.7 se sembraron en las cámaras superiores y las células U251 se sembraron en las cámaras inferiores por separado y se incubaron durante 24 h antes del tratamiento. Después de lavar con PBS tres veces, se agregaron 1 μM de GpC-ODN, CpG-ODN, gel de CpG-RCA y geles de CpG-MCA en el medio fresco en las cámaras superior e inferior durante el tiempo indicado. Se recogieron las células U251 de las cámaras inferiores y se llevó a cabo el experimento de clonación de placas.

Ensayo de formación de clones de placas

Se analizó el efecto sobre la proliferación de células U251 cocultivadas con células RAW264.7 con experimentos de clonación en placa. Las células U251 en las cámaras inferiores se recolectaron y diluyeron con múltiples proporciones en DMEM que contenía 15% de FBS en un número final de 200 células / pocillo en una placa de cultivo de 6 pocillos y continuaron el cultivo durante 2 semanas hasta que los grupos de clones pudieron ser observados por a simple vista (más de 50 células / clon). Después de lavar suavemente con PBS, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 30 min, luego se tiñeron con violeta cristal durante 1 h. Los grupos que contienen más de 50 células se incluirían en el recuento como una formación de clones exitosa. Los experimentos se repitieron tres veces y cada experimento tuvo tres pocillos repetidos:tasa de formación de clones =(número de formación de clones / número de células inoculadas) × 100%.

Estabilidad de los geles CpG-MCA y el gel CpG-RCA

Se pusieron geles de CpG-MCA liofilizados o gel de CpG-RCA en 400 µl de DMEM que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS-DMEM al 10%) respectivamente y se incubaron a 37ºC durante 24 h; las concentraciones de ADN en el sobrenadante se midieron con NanoDrop 2000c después de centrifugarlas a 1000 rpm durante 10 s. Los hidrogeles restantes se calcularon de acuerdo con las concentraciones de ADN en el sobrenadante. El gel restante =( m - c × V ) / m × 100%, donde m es la masa de gel que agregamos, c es la concentración de ADN en el sobrenadante y V es el volumen de sobrenadante. Se pusieron geles de CpG-MCA o gel de CpG-RCA en FBS-DMEM o PBS al 10% respectivamente y se incubaron a 37ºC durante 12 ho 24 h. Después de la incubación, los geles se procesaron en gel de agarosa al 1% a 100 V durante 60 min.

CpG-ODN

El CpG-ODN monocatenario fue sintetizado por Sangon Company (Beijing, China) y purificado usando cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). El CpG-ODN utilizado en este estudio fue CpG-ODN 1668 [18]:5′-TCCATGACGTTCCTGATGCT, y los oligonucleótidos no CpG se denominaron GpC-ODN [18]:5′-TCCATGAGCTTCCTGATGCT.

Análisis estadístico

Todos los datos de este estudio se representan como valores medios ± desviación estándar (media ± DE) de dos o tres experimentos independientes. El análisis estadístico entre diferentes grupos se realizó a través de una t de Student prueba. La significancia estadística se estableció en P <0.05 (nivel de confianza del 95%).

Resultados y discusión

El inmunoestimulante de ADN se construyó con éxito a través de la reacción MCA [16]. En esta reacción, el primer e importante paso antes de la amplificación isotérmica es la reacción de ciclación de una plantilla larga de una sola hebra (ss) (esquema 1). Empleamos electroforesis en gel de agarosa para confirmar la formación de ADN circular después del recocido y la ligadura con un cebador (archivo adicional 1:Figura S1). La distancia de migración entre el cebador y la plantilla de ssDNA larga se hizo más corta ya que la estructura cambió después de que la plantilla se convirtió en un ciclo y se ligó con el cebador. La reacción de MCA contiene una cadena de unidades repetidas en serie y condujo fácilmente a la aparición de nanoflores debido al devanado continuo (Esquema 1). Los resultados de la electroforesis en gel de agarosa demostraron que los productos de la reacción RCA (gel CpG-RCA o R12) y la reacción MCA (gel CpG-MCA o R4M4 / R4M8) se obtuvieron con éxito (Fig. 1a). El gel CpG-RCA y los geles CpG-MCA fueron difíciles de migrar a través del gel de agarosa y permanecieron la retención en la posición inicial. Ambos geles eran demasiado pegajosos, por lo que se sacaron como seda cuando los pipeteamos (Archivo adicional 1:Figura S2A – C). Estos resultados sugirieron que la plantilla de ADN se amplifica exponencialmente con dNTP libres para formar un hidrogel [15]. Vale la pena mencionar que la distancia de migración no tuvo una diferencia significativa entre el gel CpG-RCA y los geles CpG-MCA. Además, los resultados de SEM y TEM mostraron además que el diámetro del gel CpG-RCA (Fig.1b, e) y los geles CpG-MCA (Fig.1c, d, fyg) variaban de nanoescala a escala micrométrica, y exhibió una morfología de nanoflores. El CpG-ODN debe internalizarse en células inmunes positivas a TLR9 e interactuar con TLR9 que se localiza en los endosomas dentro de las células inmunes para ejecutar su actividad inmunoestimuladora. Para esto, usamos CpG-ODN marcado con Cy5, gel CpG-RCA y geles CpG-MCA para investigar su captación en las células RAW264.7 usando microscopía confocal. Como se observa en la Fig. 2a, los geles de CpG-MCA marcados con Cy5 se internalizaron y distribuyeron eficazmente en el citoplasma de las células RAW264.7. Según la intensidad fluorescente media medida, la eficiencia de absorción de los geles CpG-MCA aumentó significativamente ( P <0,0001) en comparación con el de CpG-ODN (Fig. 2b), lo que demuestra la captación eficaz de los geles de CpG-MCA, que es favorable para ejercer una estimulación inmunológica más fuerte. Se informa que la captación de ADN por células RAW264.7 de macrófagos de ratón se incrementó mediante el diseño de diferentes nanoestructuras de ADN. Como el ADN estructurado en forma de tetrápodo (tetrapodna), el ADN tetraédrico (tetraedro) y el ADN tetragonal (tetragon) [19]. De manera similar, también se demostró que el ADN en forma de X, el ADN en forma de Y y el hidrogel de ADN X aumentan la captación de ADN por parte de las células [20, 21]. Estos resultados sugirieron que las estructuras de ADN de orden superior eran formas más eficientes para entregar fragmentos de ADN funcionalizados. Por lo tanto, se especuló que la alta absorción celular de los geles CpG-MCA derivaba del cambio de forma de los geles CpG-MCA a través de la formación de gel. Luego probamos la estabilidad de los geles CpG-MCA. Los geles de CpG-MCA se incubaron a 37 ° C durante diferentes tiempos en diferentes soluciones. Los resultados de la electroforesis en gel de agarosa mostraron que los geles CpG-MCA eran relativamente estables en la solución de PBS y se degradaron parcialmente en el suero involucrado en el medio (archivo adicional 1:Figura S3A). Los geles de CpG-MCA todavía se mostraban como una escalera en lugar de una sola banda, lo que sugería una degradación incompleta. Posteriormente investigamos la estabilidad de los geles en FBS-DMEM al 10%. Los resultados de TEM confirmaron que los geles de CpG-MCA se digirieron parcialmente y ya no parecen flores, pero aún mantienen la forma (archivo adicional 1:Figura S2D-F). La curva de degradación de los geles CpG-MCA se trazó mediante la detección de la concentración de ADN en el sobrenadante dentro de las 24 h (archivo adicional 1:Figura S3B). Se demostró que después de una incubación de 24 h en FBS-DMEM al 10%, R12 retuvo casi el 80%, mientras que R4M4 y R4M8 permanecieron cerca del 85%, lo que coincidió con los resultados de la electroforesis en gel de agarosa. Con el fin de confirmar la degradación de los geles, los geles CpG-MCA se incubaron a 37 ° C hasta 48 h en suero, y la producción de degradación se ejecutó en electroforesis en gel de agarosa (archivo adicional 1:Figura S4). Los geles ya no parecen escaleras porque fueron digeridos en pedazos por la enzima en el suero y perdieron su viscosidad y se convirtieron incluso en pedazos de un solo nucleótido, lo que sugiere que los geles CpG-MCA son biodegradables ya que podrían digerirse en presencia de suero fetal bovino ( FBS). En consecuencia, los geles de CpG-MCA resisten eficazmente la digestión del suero en 24 horas y finalmente se degradan por completo. La alta capacidad para resistir la degradación ayudará a mejorar su eficacia estimulante del sistema inmunológico; Los niveles de expresión de TNF-α e IL-6 en el sobrenadante de células RAW264.7 también mostraron claramente que los geles CpG-MCA podrían estimular eficazmente a las células para que produzcan citocinas inmunes.

La ilustración esquemática sobre la preparación y absorción celular de geles CpG-MCA y gel CpG-RCA. Se mezclaron ADN monocatenarios largos con un grupo fosforilado en el extremo 5 'con cebadores compuestos de motivos CpG que se hibridaron y ligaron primero con ADN ligasa T4 para formar una plantilla circular. La reacción de RCA y MCA se realizó mediante la ADN polimerasa phi29 para generar una gran cantidad de ADN concatemero secuencial y convolucionar como muchas nanoflores. Los macrófagos pueden absorber geles y estimular la secreción de citocinas

Se evaluó la eficacia inmunoestimulante de los geles CpG-MCA, tratamos macrófagos RAW264.7 con GpC-ODN (la secuencia cambió del efecto GACGTT a GAGCTT) [22], CpG-ODN, gel CpG-RCA y CpG- MCA geles y luego detectó la expersión de TNF-α e IL-6. La concentración de TNF-α en el sobrenadante de células RAW264.7 incubadas durante 8 h con gel CpG-RCA (R12) y geles CpG-MCA (R4M4 y R4M8) provocó un nivel mucho más alto de TNF-α que CpG-ODN en el misma concentración de tratamiento (Fig. 3a). Para los geles CpG-MCA, R4M8 en lugar de R4M4 indujo un mayor nivel de secreción de TNF-α ( P <0,001), lo que sugiere que la secreción de TNF-α aumentó a medida que aumentaron las copias. Además, R4M8 indujo una significativa ( P <0,001) mayor concentración de TNF-α que R12, lo que indica que los geles CpG-MCA son estimuladores más potentes que los geles CpG-RCA cuando el tiempo total de reacción es igual. La misma tendencia también se encontró en la detección de IL-6 (Fig. 3d). La secreción de IL-6 estimulada por geles CpG-MCA y gel CpG-RCA aumentó significativamente. La secreción de IL-6 en los grupos R12, R4M4 y R4M8 fue 2,97 veces ( P <0,0001), 4,39 veces ( P <0,0001) y 27,81 veces ( P <0,0001) de la del grupo CpG-ODN, respectivamente. La secreción de IL-6 en el grupo R4M8 fue 6,33 veces ( P <0,0001) del anotado en el grupo R4M4 y 9,36 veces ( P <0,001) del anotado en el grupo R12. Vale la pena mencionar que la secreción de IL-6 no tuvo diferencias significativas entre los grupos CpG-ODN, GpC-ODN y control. Estos resultados confirmaron que se observó una mayor eficiencia de TNF-α e IL-6 liberados a partir de células RAW264.7 tratadas con geles CpG-MCA en lugar de CpG-ODN. Además, también se investigó el efecto de los geles de CpG-MCA con una concentración diferente sobre la secreción de citocinas, y encontramos que la secreción de TNF-α e IL-6 aumentaba con la concentración de geles (Fig. 3b, e). El resultado de la capacidad inmunoestimulante de los geles sin CpG (indicados como R12-C, R4M4-C y R4M8-C en la Fig.3c) y GpC-ODN demostró que apenas inducían la secreción de TNF-α (Fig. 3c), lo que indica que las respuestas inmunitarias inducidas por los geles CpG-MCA resultan de los motivos CpG.

Detección de citocinas liberadas de células RAW264.7 estimuladas con CpG-ODN, gel CpG-RCA y geles CpG-MCA usando ELISA-kit. un La secreción de TNF-α de células RAW264.7. b La secreción de TNF-α de las células RAW264.7 después del tratamiento con diferentes concentraciones de geles de CpG-MCA. c Detección de la capacidad inmunoestimulante de geles CpG y geles no CpG (R12-C, R4M4-C y R4M8-C). d La secreción de IL-6 de células RAW264.7. e La secreción de IL-6 de las células RAW264.7 después del tratamiento con diferentes concentraciones de geles de MCA. Los resultados se expresan como la media ± DE de dos experimentos independientes. ** P <0.01, *** P <0,001, **** P <0,0001

A continuación, probamos la expresión de ARNm de citocinas, marcadores de superficie celular y TLR-9. El ARNm de TNF-α en el grupo CpG-ODN fue 1,25 veces mayor que la expresión detectada en el grupo de control, y el cambio de veces en los grupos R12, R4M4 y R4M8 fue 3,28 veces ( P <0.01), 2.53 veces ( P <0.05) y 4.57 veces ( P <0,001) de los probados en el grupo de CpG-ODN por separado (archivo adicional 1:Figura S5A). La expresión de ARNm de IL-6 en el grupo de CpG-ODN fue 1,01 veces mayor que en el grupo de control. La expresión de ARNm de IL-6 en los grupos R12, R4M4 y R4M8 fue 3,87 veces ( P <0.01), 4.63 veces ( P <0.05) y 23.04 veces ( P <0,0001) tanto como en el grupo CpG-ODN respectivamente (Archivo adicional 1:Figura S5B).

La expresión de ARNm de TLR-9, el receptor de CpG dentro de las células [4], también aumentó en todos los grupos en comparación con el grupo de control, pero los grupos de gel CpG-MCA mejoraron notablemente la expresión de ARNm de TLR-9 en comparación con CpG -Grupo ODN (Archivo adicional 1:Figura S5C). Además de las citocinas y TLR9, también detectamos moléculas coestimuladoras (CD) CD86 y CD206, que se utilizaron para etiquetar macrófagos proinflamatorios (M1) y promotores del crecimiento (M2), respectivamente [23]. Se encontró que no había diferencias significativas entre el grupo CpG-ODN y el grupo de control en CD86 o CD206 (archivo adicional 1:Figura S5D, E). En comparación con el grupo de gel CpG-RCA, CD86 en los grupos de gel CpG-MCA aumentó en diversos grados, mientras que CD206 disminuyó en diversos grados, y el grupo R4M8 aumentó y disminuyó más, lo que sugiere que las células RAW264.7 tratadas con geles CpG-MCA son propensos a diferenciarse en la población M1 con el marcador de superficie CD86, que verificó aún más la capacidad de estimulación inmunológica de los geles CpG-MCA.

La secreción de citocinas de los macrófagos es extremadamente importante en la respuesta de la estimulación inmunológica, así como en la proliferación y migración de los macrófagos. La estimulación de macrófagos con CpG-ODN aumentaría la producción de citocinas antiinflamatorias a través de la vía dependiente de TLR9. Las citocinas inducidas por CpG-ODN aumentaron la migración de macrófagos y promovieron la proliferación de macrófagos al regular negativamente la expresión de un regulador negativo del ciclo celular [24]. El CpG-ODN también indujo la expresión del inhibidor del activador del plasminógeno tipo 1 (PAI-1) en los macrófagos, lo que resultó en una mayor migración a través de la vitronectina [25]. También investigamos más a fondo la capacidad de los geles CpG-MCA para promover que los macrófagos migren y evaluar su citotoxicidad. La migración de células RAW264.7 fue inducida por geles CpG-MCA tanto en el sistema de migración transpocillo (Fig. 4a) como en el ensayo de migración de la herida por raspado (Fig. 4b). Se cultivaron células RAW264.7 en presencia o ausencia de geles CpG-MCA y se dejaron migrar durante 24 h. El número de migración de macrófagos en los grupos de gel CpG-MCA fue mucho mayor que en el grupo CpG-ODN (Fig. 4a). Luego, procedimos al ensayo de migración de la herida por raspado; se permitió que las células migraran durante 24 h, y las imágenes se capturaron en 0 h, 6 hy 24 h. Los resultados demostraron que el área del raspado disminuyó a medida que la herida cicatrizaba. La migración de macrófagos a las 6 h mostró que los geles CpG-MCA fueron más efectivos que el grupo CpG-ODN ya que la tasa de cicatrización de heridas fue mayor, pero no hay un significado distintivo entre los grupos R12, R4M4 y R4M8 (archivo adicional 1:Figura S6A, B). Y el área de raspado a las 24 h confirmó que la tasa de curación del área de raspado en el grupo CpG-ODN fue 1.70 veces ( P <0,05) de la del grupo de control, y la tasa de curación en los grupos R12, R4M4 y R4M8 fue 1,63 veces ( P <0,001), 1,63 veces ( P <0,0001) y 2,23 veces ( P  < 0.0001) of that measured in the CpG-ODN group separately. The healing rate in the R4M8 group was 1.36 times (P  < 0.01) of that in the R12 group. CpG-MCA gels strongly promoted the migration of RAW264.7 cells compared to that treated with the CpG-ODN or control groups (Fig. 4c). In addition, RAW264.7 cells were cultured with a series concentration of gels for 24 h. We found that the CpG-MCA gels exhibited a negligible cytotoxicity to RAW264.7 cells due to the non-toxicity of DNA itself; on the contrary, CpG-MCA gels could stimulate RAW264.7 cell proliferation with a dose-dependent effect, which was a benefit to enhance the production of immune cytokines (Fig. 4d).

The analysises of migration and cell viability of CpG-ODN, CpG-RCA gel (R12), and CpG-MCA gels (R4M4 and R4M8) in RAW264.7 cells. un The migration assay of RAW264.7 cells induced with CpG-ODN, R12, R4M4, and R4M8. b The migration assay of RAW264.7 cells stimulated with CpG-ODN, R12, R4M4, and R4M8 for 24 h. c The scratch area analysis in the scratch migration experiment. The percentages are calculated as the ratio of the original area. d The cell viability of RAW264.7 cells treated with CpG-ODN, R12, R4M4, and R4M8 for 24 h. Results are expressed as the mean ± SD of three independent experiments. ** P <0.01, *** P  < 0.001, ****P  < 0.0001

For further verifying the inhibited efficiency of CpG-MCA gels for the proliferation of solid tumor cells, we estimated the inhibitory effects of CpG-MCA gels as immune stimulators for the U251 human brain glioma cells. The U251 cells was first co-cultured with RAW264.7 macrophages for 24 h, and the clone formation rate was used to check the proliferate ability of the U251 cells. As shown in Fig. 5a–f, the clone formation rate in the CpG-ODN group was 74.1% of that observed in the control group (P  < 0.05), and the rates in R12, R4M4, and R4M8 groups were 45.4% (P  < 0.01), 15.3% (P  < 0.001), and 12.0% (P  < 0.001) of that in the CpG-ODN group, respectively. The results demonstrated that the U251 cells treated with CpG-MCA gels presented a significantly lower percentage of clone formation rate compared with that treated with the CpG-ODN or control groups (Fig. 5g). It is notable that the trend of inhibitory results was in accordance with the secretion of TNF-α among groups, CpG-MCA gels exhibited a stronger effect on stimulating RAW264.7 cells to secrete cytokines to inhibit proliferation of U251 cells than CpG-ODN. Our research provided preliminary evidence to demonstrate the CpG-MCA gels have the potential to be used as an immunostimulant.

The assessment on the therapeutic effect of immunostimulatory CpG-RCA gel (R12) and CpG-MCA gels (R4M4 and R4M8) on cancer cells in vitro by plate clone formation assay. U251 cells treated with a none, b RAW264.7 cells, c RAW264.7 cells treated with CpG-ODN, d RAW264.7 cells treated with R12, e RAW264.7 cells treated with R4M4, and f RAW264.7 cells treated with R4M8. g Results of the proliferation percentage of U251 cells after co-cultured with RAW264.7 cells for 24 h. Results are expressed as the mean ± SD of three independent experiments. ** P <0.01, *** P <0,001

Conclusions

In summary, we have successfully preparedCpG-MCA nanohydrogels that consist of hundreds of immunostimulatory CpG motifs to effectively deliver immune stimulus signal into cells and significantly induce the expression of immune cytokines. CpG-MCA nanohydrogels exhibited powerful anti-tumor immunity against human glioma cells, demonstrating that CpG-MCA nanohydrogels have the potential to be used as an immunostimulant for the therapy of cancer.

Disponibilidad de datos y materiales

Los conjuntos de datos utilizados y / o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

Abreviaturas

CpG-MCA gels:

CpG-MCA hydrogel

CpG-RCA gel:

CpG-RCA hydrogel

MCA/M:

Multi-primed chain amplification

R12:

CpG-RCA gel

R12-C, R4M4-C, R4M8-C:

Hydrogels not containing CpG motifs

R4M4, R4M8:

CpG-MCA gels

RCA/R:

Rolling circle amplification

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