Detección basada en nanopartículas de oro de AGE de bajo peso molecular a partir de muestras in vitro de hemoglobina glicosilada A0

Resumen

La glicación de proteínas es un evento bioquímico importante que tiene lugar en el plasma de los pacientes diabéticos debido al aumento de los niveles de azúcar. La glicación extensa conduce a la formación de productos finales de glicación avanzada (AGE) que es bien conocido por tener efectos perjudiciales en los pacientes diabéticos. En el trabajo actual, hemos glicado la proteína de importancia fisiológica Hemoglobina A0 in vitro para estudiar la formación y la actividad de AGE usándolas como plantilla para la síntesis de nanopartículas de oro (GNP). Se encontró que la resonancia del plasmón superficial de los GNP sintetizados mostró una alta correlación con el grado de glicación. En el fraccionamiento, la hemoglobina A0 glicada se segrega en dos poblaciones distintas de productos, una que consta de fragmentos proteicos reticulados más grandes de hemoglobina A0 y una segunda población de AGE de bajo peso molecular no proteináceos. Solo los AGE de bajo peso molecular contribuyeron a la síntesis de los PNB al usar las fracciones como plantilla, lo que confirma el principio del ensayo propuesto basado en el PNB. Debido a su importancia fisiológica, los AGE pueden usarse como un medio de diagnóstico para la diabetes y sus complicaciones asociadas. En este estudio, hemos empleado la alta reactividad de los AGE para el desarrollo de un sensor colorimétrico novedoso basado en GNP para permitir su detección. Nuestra detección propuesta basada en el PNB podría tener una gran importancia clínica en la detección de la diabetes y las complejidades asociadas.

Antecedentes

La diabetes mellitus tipo II (DM2) es un trastorno metabólico complejo caracterizado por la presencia de niveles elevados de azúcar en sangre. La hiperglucemia que persiste en el cuerpo inicia una serie de reacciones químicas y bioquímicas y la reacción más importante que ocurre durante el curso de la hiperglucemia se conoce como reacción de Maillard, que implica una reacción no enzimática entre azúcares y proteínas para formar una aldimina reversible (base de Schiff). enlace. La base de Schiff relativamente inestable se tautomeriza en su forma ceto más estable, que también se conoce como el "Producto Amadori" [1]. Los productos de Amadori, también conocidos como productos intermedios de glicación o productos de glicación temprana, experimentan reordenamientos de grupo, ciclación, deshidratación y reacciones de degradación para formar una variedad de compuestos químicos. Se sabe que estos compuestos son reticuladores potenciales de proteínas y agentes glicosilantes [2]. Son susceptibles a una mayor degradación que conduce a la formación de productos finales de glicación avanzada (AGE) [3]. A altas concentraciones endógenas, los AGE contribuyen a las complicaciones de la diabetes [4], ya sea induciendo enlaces cruzados de proteínas o mediante la transducción de señales intracelulares mediada por receptores (RAGE), lo que conduce a estrés oxidativo e inflamación [5, 6]. También se sabe que está asociado con enfermedades cardiovasculares [7, 8], nefropatías [9, 10], retinopatías [11, 12], envejecimiento [13, 14], artritis, cáncer [15,16,17], enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer [15] y el desarrollo de depresión [18]. Además de la reacción de Maillard, varias otras vías, incluida la oxidación de la glucosa, la oxidación de lípidos y la vía del poliol, también conducen a la formación de AGE [19, 20] in vivo. Además de eso, la ingesta dietética de ciertos alimentos que se sabe que son ricos en AGE también contribuye al total de AGE dentro del cuerpo [6].

Aunque la mayoría de los productos AGE tienen un elemento estructural común [21], aún no se han identificado las estructuras químicas exactas de cientos de AGE [22]. A pesar de su heterogeneidad, la formación de enlaces cruzados covalentes con la proteína y el "efecto de pardeamiento" son típicos de todos los AGE conocidos [23]. Los aductos que involucran azúcar y proteínas que se forman en la etapa temprana de la glicación se denominan aductos de glicación temprana. La fructosilisina y la fructosamina son ejemplos de tales estructuras y son posibles reticuladores [24, 25, 26]. Algunas de las edades más estudiadas incluyen N -carboximetil-lisina (CML), N -carboxietil-lisina (CEL) [27], pentosidina [28], glucosapano [29], pirralina, Argpyramidine, Crossline y Vesperlysine C [30].

Los estudios sobre el papel de los AGE en la progresión de la diabetes, el envejecimiento y las complicaciones asociadas van en aumento y se ha informado que son un buen biomarcador para los estudios respectivos [https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02863224] [ 31,32,33,34]. Sin embargo, la complejidad y heterogeneidad en la estructura de los AGE es un obstáculo importante en el desarrollo de un sistema de detección universal [35]. El análisis cualitativo de los AGE se realiza generalmente mediante técnicas espectroscópicas y colorimétricas [36] en las que la evolución de los productos de reacción de Maillard se controla midiendo el aumento de la absorción de luz a 280 nm que corresponde a los primeros productos de reacción de Maillard [37] o midiendo la emisión de fluorescencia a 450 nm [38,39,40,41,42]. Aún se están realizando estudios para la identificación de distintos productos AGE; sin embargo, se hicieron algunos intentos para la cuantificación de pentosidina [43] y carboximetil lisina [44]. La mayoría de los AGE se estudiaron a nivel tisular mediante inmunohistoquímica y cuantificación basada en ELISA utilizando una variedad de anticuerpos poli- y monoclonales [21, 45]. La mejor técnica analítica disponible hasta la fecha para la detección de AGE es la cromatografía líquida o de gases seguida de la detección espectrofotométrica o espectrométrica de masas [12, 46,47,48,49]. El análisis cuantitativo de los AGE sigue siendo un desafío técnico importante y las pocas técnicas disponibles para el mismo son costosas y, por lo tanto, limitan su uso en aplicaciones en el punto de atención. El desarrollo de estrategias novedosas para la evaluación cualitativa y cuantitativa de los AGE es la necesidad del momento debido a sus implicaciones en las enfermedades que amenazan la vida.

Se han realizado grandes esfuerzos para el desarrollo de sensores colorimétricos debido a su simplicidad en la detección, tiempo de respuesta rápido y rentabilidad, especialmente para aplicaciones biológicas [50]. Entre ellos, los sensores basados en resonancia de plasmón de superficie (SPR) son de particular interés debido a su alta sensibilidad de detección [51]. En el presente estudio, hemos explorado las propiedades ópticas de las nanopartículas de oro (GNP) para la identificación cualitativa de productos AGE. Los GNP son conocidos por su SPR sintonizable único y, por lo tanto, evolucionaron como un informador colorimétrico para la detección de varias biomoléculas. Los sensores ópticos basados en GNP incluyen los de analitos químicos pequeños [52], azúcares [53], diferentes proteínas [54], agregados de proteínas [55] y variantes conformacionales de una proteína [56]. Anteriormente, mostramos que los PNB cuando se siembran en una plantilla de proteína glicosilada podrían responder al avance de la glicación [57]. Aquí, hemos ampliado este concepto para la detección cualitativa de diferentes productos de glicación colorimétrica mediante el empleo de la propiedad reductora exhibida por los AGE. Brevemente, se glicó la HbA0 in vitro, usando fructosa como azúcar reductor, la formación de AGE y los cambios estructurales asociados en la estructura de la proteína se confirmaron usando espectroscopía. La Hb glicada se fraccionó mediante cromatografía de filtración en gel para separar los productos en función de su peso molecular y se sintetizaron los GNP utilizando las fracciones obtenidas. Solo los productos AGE no proteicos dirigieron la síntesis de nanoestructuras de oro permitiendo así su identificación.

Las crecientes evidencias apoyan la participación de diferentes productos de la glicación en enfermedades que incluyen diabetes, envejecimiento, Alzheimer, enfermedades renales, aterosclerosis y diferentes tipos de cánceres. Nuestros hallazgos acentúan el uso de los GNP como una plataforma de detección colorimétrica simple y altamente sensible para la identificación de diferentes productos AGE que podrían estar implicados en el pronóstico de las complicaciones de salud asociadas a la diabetes.

Métodos

Materiales

La hemoglobina A0 (HbA0) y Sephadex (G25) se obtuvieron de Sigma Aldrich India Pvt. Ltd. Trihidrato de tetracloroaurato (III) de hidrógeno (HAuCl ₄ .3H ₂ O) se adquirió de Loba Chemie. Fructosa, dihidrógeno ortofosfato de potasio, hidrógeno ortofosfato dipotásico, dihidrógeno ortofosfato de sodio, hidrógeno ortofosfato disódico, ferricianuro de potasio, ácido tricloroacético, cloruro férrico, ácido nítrico (HNO ₃ ), ácido clorhídrico (HCl), acrilamida, bis acrilamida, persulfato de amonio, TEMED, dodecil sulfato de sodio, azul brillante de Coomassie, glicerol, ditiotreitol, base TRIS y otros productos químicos utilizados fueron de calidad analítica y se utilizaron sin purificación adicional. Se utilizó agua ultrapura MilliQ (> 18 MΩ) para todos los experimentos.

Métodos

Glicación de HbA0

Se prepararon soluciones madre de HbA0 y fructosa en tampón de fosfato de potasio esterilizado en autoclave (0,1 M, pH 7,4) y se filtraron utilizando filtros de jeringa de 0,2 µm antes de su uso. Las muestras de HbA0 se incubaron con diferentes concentraciones de fructosa durante diferentes períodos de tiempo (1 a 10 días) en una incubadora a 37 ° C. Las concentraciones finales de fructosa y HbA0 fueron 0,1 M y 1 mg mL ⁻¹ respectivamente. También se mantuvieron controles de HbA0 y fructosa que estaban en las mismas concentraciones. Las muestras que fueron glicadas durante 10 días se etiquetan con el prefijo "Día 10" y las muestras de control que no se incubaron se etiquetan con el prefijo "Día 0". Todos los experimentos se realizaron en condiciones estériles en una campana de flujo de aire laminar.

Ensayo de reducción de propiedades

Las propiedades reductoras de las muestras glicadas se determinaron mediante el método descrito por Gu. et al. [37] con modificaciones menores. Luego, 100 μL de las muestras glicadas y sus respectivos controles de proteína y azúcar se mezclaron con 1 mL de tampón de fosfato de sodio 0,2 M y 1 mL de ferricianuro de potasio al 1%. Las mezclas se incubaron a 50 ° C en un baño de agua durante 20 min. Después de enfriar la mezcla a temperatura ambiente, se añadió 1 ml de ácido tricloroacético al 10%. A 1 mL de esta mezcla, se le añadió 1 mL de agua MilliQ y 200 μL de cloruro férrico al 0.1%. La absorbancia de la mezcla resultante se midió a 700 nm. Se mantuvo un control negativo en el que se añadió tampón fosfato 0,1 M en lugar de la muestra glicosilada y esto sirvió como blanco para las medidas de absorbancia. Cuanto mayor sea la absorbancia a 700 nm, mayor será su propiedad reductora.

Cromatografía de filtración en gel de Fruc-Hb día 0 y Fruc-Hb día 10 utilizando Sephadex (G25)

Brevemente, las perlas de Sephadex (G25) se remojaron en agua MilliQ durante la noche, luego se empaquetaron en una columna de vidrio de 15 cm de longitud, 1 cm de diámetro y 15 ml de volumen interno. Al principio, la columna se lavó con abundante cantidad de agua MilliQ seguida de tampón de fosfato de potasio (0,1 M, pH 7,4). Aproximadamente 600 μL de la muestra de Fruc-Hb se cargaron en la columna después de equilibrar la misma con tampón fosfato. La elución se llevó a cabo con el mismo tampón a un caudal de 7,5 ml por hora. Las fracciones se recogieron una vez que la muestra cargada cruzó aproximadamente 10 cm de distancia de la columna. Se recogieron aproximadamente 30 fracciones de cada una de las muestras y se caracterizaron posteriormente. Aquí, la Fruc-Hb del día 0 y las fracciones derivadas de ella sirvieron como control frente a la muestra de Fruc-Hb del día 10 y sus respectivas fracciones.

Síntesis de nanopartículas de oro

Todos los artículos de vidrio utilizados para la síntesis de GNP se lavaron con Aqua Regia (HCl:HNO ₃ en una proporción de 3:1 por volumen) y se enjuaga con etanol y agua ultrapura antes de su uso ( ¡Atención! Aqua Regia es un agente oxidante muy corrosivo que debe manipularse con mucho cuidado ). Se llevó a cabo la síntesis de GNP aprovechando la propiedad reductora de los productos de glicación de Hb. En un experimento típico realizado a temperatura ambiente (RT), 32 μL de solución acuosa de HAuCl ₄ (1% w / v ) a 3,868 ml de agua MilliQ con agitación constante. Tras la completa disolución de la sal de oro, la solución se vuelve de color amarillo pálido. A continuación, se añadieron 50 μL de la muestra de Fruc-Hb necesaria o 100 μL de la fracción a la solución de sal de oro. Una vez que todos los reactivos se mezclaron completamente, se detuvo la agitación y la mezcla de reacción se dejó en reposo para permitir el crecimiento de GNP. En la mezcla de reacción final, la concentración de la muestra de Fruc-Hb fue de 12,5 ng μL ⁻¹ (12,5 μg mL ⁻¹ ) y el de la fracción fue 1 ng μL ⁻¹ (1 μg mL ⁻¹ ) (Los cálculos detallados se dan en S6). Se desarrollaron colores que iban del rosa al violeta en las mezclas de reacción, dependiendo de la muestra añadida. Todas las muestras se mantuvieron hasta que el color de la mezcla de reacción se estabilizó y no se observaron más cambios.

Ensayo de Bradford

Las fracciones recogidas de las muestras de Fruc-Hb se analizaron para determinar la presencia o ausencia de proteína usando el ensayo de Bradford. Brevemente, a cada uno de los 20 μL de fracciones sin diluir, se agregaron aproximadamente 200 μL de reactivo de Bradford y se midió la absorbancia a 595 nm y 450 nm [58]. La proporción de DO a 595 nm a 450 nm se representó frente al número de fracción y una proporción más alta indicó un porcentaje relativamente más alto de proteína.

Espectroscopia

Espectroscopía UV-Visible

Los espectros UV-Visible de todas las muestras de Fruc-Hb, sus respectivos controles y las fracciones cromatográficas de las muestras glicadas se registraron en un espectrómetro Perkin Elmer, Lambda 25 UV-Visible. Los espectros se tomaron ejecutando un escaneo de 800 a 200 nm con una velocidad de escaneo de 240 nm / min y un ancho de rendija de 1 nm. Todas las medidas se tomaron utilizando cubetas de cuarzo de 1 cm de longitud de recorrido y 1 ml. Los espectros UV-Visible de los PNB también se registraron de manera similar.

Espectroscopía de fluorescencia

Para identificar las alteraciones estructurales de las proteínas y la formación de AGE, se realizaron los perfiles de emisión de fluorescencia de las muestras de Fruc-Hb y las fracciones de Fruc-Hb del día 0 y Fruc-Hb del día 10 utilizando un espectrofotómetro de fluorescencia Cary Eclipse de Agilent Technologies. Los anchos de las ranuras de excitación y emisión se establecieron en 5 nm y los espectros se tomaron usando una cubeta de cuarzo de 1 cm de longitud de trayectoria. Las muestras se excitaron a 280 nm y 350 nm para comprobar la fluorescencia de triptófano / fluorescencia de proteína intrínseca y la fluorescencia de AGE, respectivamente [34,35,36,37,38].

Espectroscopía de dicroísmo circular

Las alteraciones de la estructura secundaria en las muestras de Fruc-Hb se identificaron mediante espectroscopia de dicroísmo circular. Las mediciones se realizaron utilizando un espectrómetro de dicroísmo circular (CD) con Stop Flow, Applied PhotoPhysics Chirascan (Applied Photophysics Limited, Reino Unido). Los espectros se tomaron en el ultravioleta lejano, en un rango de 190 a 260 nm.

Para todas las mediciones de espectroscopia, muestras de Fruc-Hb de 0,1 mg mL ⁻¹ se utilizaron concentraciones y se analizaron las fracciones de Fruc-Hb del día 0 y Fruc-Hb del día 10 sin dilución alguna. El tampón de fosfato de potasio (pH 7,4, 10 mM) sirvió como blanco en todos los experimentos. Todas las lecturas se tomaron por triplicado a temperatura ambiente.

Microscopía electrónica de transmisión

Para identificar el tamaño y la estructura de los GNP sintetizados a partir de las muestras de Fruc-Hb y sus respectivos controles, se realizó un análisis de microscopía electrónica utilizando microscopio electrónico de transmisión (TEM) –JEOL 2100F. Los GNP se concentraron por centrifugación a 6000 rpm y se vertieron gota a gota sobre rejillas de carbón recubiertas de cobre con un tamaño de malla 300. Las muestras se dejaron secar durante la noche a temperatura ambiente antes del análisis.

Perfil de intensidad de color de los PNB

Para expresar el color de los PNB en valores medibles, se calculó (RB) / G ((Intensidad roja – Intensidad azul) / Intensidad verde) extrayendo planos de color rojo, azul y verde de cada uno de los coloides dorados utilizando un color digital metro.

SDS Electroforesis en gel de poliacrilamida

Se realizó electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio (SDS PAGE) para ver las diferencias en el peso molecular de HbA0, post glicación. Los controles de HbA0 del día 0, el día 10 y la Fruc-Hb del día 0 y el día 10 se mezclaron con SDS al 10% que contenía tampón de carga 6X y se hirvieron durante 5 min, después de lo cual se cargaron 30 μL de las muestras en el gel moldeado (Stacking gel- 5%; gel de resolución - 12%). Las muestras se procesaron junto con la escalera de proteínas teñida previamente con PiNK Plus de 10-175 kDa (nº de cat. PM005 0500) a 100 V usando el sistema Mini PROTEAN Tetrad de Bio-Rad. Los geles se visualizaron bajo la fuente de luz blanca de un iluminador Bio-Rad Trans.

Resultados

Síntesis de GNP a partir de fructosa, hemoglobina A0 y hemoglobina glicosilada A0

Se sabe que la glucosa del azúcar reductor reacciona con la HbA0 in vivo para producir HbA1c, el conocido aducto de glicación temprana que es un biomarcador importante de los niveles hiperglucémicos asociados con la diabetes [59]. Para lograr una cinética de glicación más rápida y una alta acumulación de AGE in vitro, se usa fructosa en lugar de glucosa, que es un potente agente de glicación en comparación con esta última [55,56,57,58,59,60]. En nuestro estudio, realizamos la glicación de la hemoglobina A0 utilizando fructosa como azúcar reductor y se controló la glicación hasta 10 días, lo que se informó que es lo suficientemente bueno para la formación sustancial de AGE [57]. La Figura 1 ilustra la formación de AGE en las muestras de HbA0 después de 10 días de incubación con fructosa in vitro. La formación de AGE se evaluó midiendo cualitativamente la emisión de fluorescencia a 450 nm tras la excitación a 350 nm [38,39,40,41,42]. Un aumento de más de diez veces en la emisión de fluorescencia a 450 nm confirmó la formación de productos AGE en HbA0 glicosilada (día 10 Fruc-Hb) en comparación con la HbA0 no glicosilada (día 0 Fruc-Hb- Mezcla física de HbA0 y fructosa sin incubación). La caracterización biofísica detallada de las muestras se analiza en el archivo adicional 1 (S1 y S2).

Formación de AGE medida por generación de fluorescencia a 450 nm cuando se incuba hemoglobina con fructosa durante 10 días. Comparación de la emisión de fluorescencia de 450 nm en el día 0 Fruc-Hb y el día 10 Fruc-Hb

Para utilizar los GNP como sensor colorimétrico para los AGE derivados de la glicación de proteínas, era un requisito previo estudiar la cinética de formación de los GNP a partir de los reactivos de azúcar y proteínas. Ya se ha informado que la fructosa y la hemoglobina A0 dirigen la síntesis de nanoestructuras de oro [53, 61,62,63] cuando se usan solas o en combinación con un agente reductor fuerte. Sin embargo, para comprender la diferencia en la cinética de formación, comparamos los GNP sintetizados a partir de Fruc-Hb, fructosa y HbA0 incubados durante 0 y 10 días respectivamente en ausencia de un agente reductor adicional. La propiedad reductora de estas plantillas se midió bioquímicamente de acuerdo con el protocolo descrito en la sección de métodos. En general, las muestras del día 10 mostraron una propiedad reductora más alta que las muestras del día 0, y Fruc-Hb exhibió la propiedad reductora máxima seguida de fructosa y HbA0 en ambos casos, lo que podría atribuirse a la presencia de AGE en las muestras de Fruc-Hb ( Figura 2a). De estas muestras, a una concentración típica, solo el día 10 Fruc-Hb contribuyó a la síntesis de PNB estables (Fig.2b) al final de los 4 días, mientras que el resto de las muestras solo pudieron hacerlo cuando se les permitió conservarse durante un tiempo prolongado (normalmente más de 10 días) y los resultados están de acuerdo con las propiedades reductoras obtenidas de las muestras (datos no mostrados). El espectro de absorción de luz visible del día 10 Fruc-Hb_GNPs generó un pico alrededor de 530 nm (Fig. 2c) y las partículas también fueron caracterizadas por microscopía electrónica de transmisión (TEM), para estudiar el tamaño y morfología (Fig. 2d). La micrografía electrónica mostró la presencia de partículas esféricas con un diámetro promedio de 21,930 ± 2,4 nm (Fig. 2e). Además, las partículas eran de naturaleza policristalina con puntos de red correspondientes a los planos 111, 200, 220, 311 de una red fcc (Fig. 2f). En S3 se ofrece un análisis cinético detallado de la formación de GNP a partir de muestras con glicación diferencial.

Caracterización de la formación de AGE y síntesis de GNP a partir de muestras de HbA0, fructosa y Fruc-Hb. un Propiedades reductoras de HbA0, fructosa, Fruc-Hb de 0 y 10 días de incubación respectivamente medidas por la prueba de reducción de iones férricos. b Fotografías de PNB sintetizadas a partir de las respectivas muestras. c Espectro de absorción UV-visible para el día10 Fruc-Hb_GNPs. d Micrografía electrónica de transmisión del día10 Fruc-Hb_GNPs (barra de escala:20 nm). e Distribución de tamaño de las partículas y f SAED para las partículas

Aquí, Fruc-Hb actúa tanto como plantilla como estabilizador para dirigir la síntesis de nanoestructuras de oro de forma esférica. Dado que solo el día 10 Fruc-Hb permite la síntesis de partículas en un tiempo estipulado en comparación con las contrapartes de azúcar y proteína, este mecanismo se puede utilizar para diferenciar entre una plantilla de proteína glicada y no glicada.

El fraccionamiento de Fruc-Hb resuelve dos clases distintas de productos de glicosilación

Fue interesante ver si los AGE o las alteraciones en la estructura de la proteína son responsables de la respuesta diferencial de SPR observada en los GNP sembrados en la plantilla de Fruc-Hb del día 10. Para investigar más, fraccionamos la Fruc-Hb del día 10 y la Fruc-Hb del día 0 utilizando cromatografía de filtración en gel como se describe en la sección de métodos. Las fracciones derivadas de Fruc-Hb del día 0 sirvieron como control frente a las fracciones de Fruc-Hb del día 10. La figura 3 resume la caracterización espectroscópica de las fracciones. La Figura 3a muestra los perfiles de elución de las fracciones recogidas del día 0 Fruc-Hb (rojo) y del día 10 Fruc-Hb (negro). El perfil de elución característico obtenido para el fraccionamiento de Fruc-Hb es consistente con los informes anteriores [37].

Perfil de elución de las fracciones Fruc-Hb (rojo) del día 0 y Fruc-Hb (negro) del día 10. Perfil de absorbancia UV medido a 280 nm ( a ) y el ensayo de Bradford para determinar la presencia de proteínas ( b ) de fracciones desde el día 0 Fruc-Hb y el día 10 Fruc-Hb

La presencia de proteína en las fracciones desde el día 0 y el día 10 fue confirmada por la absorción de luz UV a 280 nm por los aminoácidos aromáticos presentes en la proteína. El perfil de elución del día 10 Fruc-Hb medido por absorción de luz a 280 nm muestra la presencia de dos poblaciones de productos marcados I y II. La población I, que consta de productos de alto peso molecular, varía desde la fracción núm. 5 a 12 y fracción no. 15 en adelante correspondientes a productos de bajo peso molecular caen en la población II. Se observó un rango pequeño que abarcaba de 2 a 3 fracciones entre I y II, donde no se observó absorción de UV. Por otro lado, una sola población de fracciones del día 0 Fruc-Hb mostró absorción de luz UV (población I), lo que confirma que la absorción en la región II en las fracciones del día 10 es por los productos generados en el día 10 Fruc-Hb como resultado de glicación. Ya se ha informado de que los intermedios de la reacción de Maillard absorben la luz en el rango de UV cercano [64], lo que respalda la observación. La absorción mejorada de luz UV a 280 nm en las fracciones del día 10 en comparación con las fracciones del día 0 podría deberse al extenso despliegue de proteínas como resultado de la glicación, lo que da como resultado la exposición de aminoácidos aromáticos (Fig. 3a).

La glicación altera considerablemente las estructuras secundarias y cuaternarias de la proteína, como se analiza en S1. Para confirmar el estado estructural de la proteína en las fracciones, realizamos electroforesis en gel de poliacrilamida SDS de las fracciones y encontramos que en lugar de bandas monoméricas y diméricas, se observaron bandas fusionadas que confirman la reticulación de la proteína en la muestra de Fruc-Hb del día 10. (Archivo adicional 1:Figura S4).

Al comparar los perfiles de elución del día 0 Fruc-Hb y el día 10 Fruc-Hb, discernimos que las fracciones que caen en la población I son de naturaleza proteica y que la segunda población que estaba completamente ausente en las fracciones del día 0 (no glucosilada) consiste en productos de glicación no proteináceos. Estos hallazgos están respaldados por la estimación de proteínas mediante el ensayo de Bradford, donde se confirmó la naturaleza proteica de las fracciones en la población I de Fruc-Hb tanto en el día 0 como en el día 10 (Fig. 3b). De manera concisa, el fraccionamiento de la Fruc-Hb del día 10 mediante cromatografía de filtración en gel produjo dos poblaciones diferentes de fracciones, ambas absorbiendo luz a 280 nm, siendo una de naturaleza proteica y la otra no proteica.

Los productos de glicación proteicos y los productos de glicación no proteináceos son de naturaleza fluorescente

Habiendo entendido la elución de productos de glicación de naturaleza proteica y no proteica, se midió la emisión de fluorescencia de estas fracciones a 450 nm para caracterizar la presencia de productos AGE. Similar al perfil de elución UV, se observan dos poblaciones de emisión de fluorescencia para las fracciones del día 10, pero ninguna de las fracciones del día 0 presentó emisión de fluorescencia a 450 nm ya que no se produjo formación de AGE en el día 0 Fruc-Hb (Fig. 4). La intensidad de la fluorescencia varió significativamente entre las fracciones del día 10, lo que indica la naturaleza química diferencial de los productos de glicación. En el perfil de elución de fluorescencia, las eluciones iniciales pertenecientes a la población I consistieron en productos de glicación de alta intensidad de fluorescencia. Esto, junto con la estimación de proteínas mostrada en la Fig. 3, sugiere la elución de productos de glicación altamente fluorescentes que comprenden estructuras proteínicas en estas fracciones. La segunda población exhibió una emisión de fluorescencia de menor intensidad en comparación con las fracciones iniciales. Se encontró que eran de naturaleza no proteica (Fig. 3b) pero capaces de absorber luz ultravioleta a 280 nm (Fig. 3a).

Comparación de la fluorescencia de AGE en las fracciones de Fruc-Hb del día 0 y Fruc-Hb del día 10 expresadas como la intensidad de la emisión de fluorescencia a 450 nm

Teniendo en cuenta la absorción de UV (Fig. 3) y la emisión de fluorescencia de las fracciones del día 10 (Fig. 4), es evidente que el fraccionamiento diferencia dos clases diferentes de productos de glicación de HbA0. La población de fracciones que se eluye de la columna G25 es inicialmente de alto peso molecular, de naturaleza proteica y emite una fuerte fluorescencia a 450 nm. La segunda clase de productos son estructuras no proteicas de bajo peso molecular, que emiten fluorescencia a 450 nm pero de intensidad comparativamente menor. Dado que ambos productos exhiben fluorescencia 'AGE', las estructuras proteínicas podrían ser los productos AGE reticulados a la estructura de la proteína que se forman inicialmente durante la reacción de Maillard y las fracciones de la segunda población podrían ser los productos tardíos de la glicación que se forman como resultado. de la degradación de los enlaces cruzados de proteínas AGE.

Los PNB sembrados en fracciones de la muestra de Fruc-Hb permiten la diferenciación entre los productos de glicación

Es evidente que la síntesis de GNP se puede utilizar para diferenciar entre una plantilla glucosilada y no glucosilada (Fig. 2). Ahora, para investigar si los GNP pueden diferenciar entre los eluidos proteicos y no proteináceos del día 10 Fruc-Hb, sintetizamos los GNP utilizando las fracciones obtenidas del día 10 Fruc-Hb como se describe en los métodos. Se controló el color de los PNB formados hasta que todas las muestras se estabilizaron.

Como se muestra en la Fig.5, ninguna de las fracciones que constan de estructuras proteínicas (población I) exhibió una formación de GNP notable, mientras que las fracciones que contenían productos AGE no proteicos (población II) produjeron GNP estables que exhibían una gama de colores en solución coloidal. La formación de GNP se caracterizó mediante el uso de espectroscopía UV-Visible y los máximos de absorbancia se representaron frente a los números de fracción. Los datos de espectroscopía son compatibles con el perfil de color GNP visualizado. Estos datos concluyen que la diferenciación de la plantilla de proteína glucosilada de la plantilla de proteína no glucosilada basada en el mecanismo de detección basado en GNP está mediada por los productos AGE de bajo peso molecular y el mismo mecanismo se puede utilizar para distinguir entre las proteínas proteicas y las no glucosiladas de bajo peso molecular. -productos de glicación proteicos.

Síntesis de GNP a partir de las fracciones de Fruc-Hb del día 10. El perfil colorimétrico de los PNB sintetizados a partir de las fracciones del día 10 y sus máximos de absorción representados frente al número de fracción

La cinética de la detección colorimétrica basada en GNP se puede mejorar en mayor medida simplemente aumentando las concentraciones de Fruc-Hb y sal de oro, reduciendo así el tiempo de respuesta. When the concentrations of the Fruc-Hb and gold salt was increased four times than the concentrations used initially in this study, GNP formation was completed within 1 day, substantiating the use of the proposed colorimetric sensor for point-of-care applications (Additional file 1:Figure S5).

The linearity of detection for this colorimetric sensor was also confirmed using different concentrations of the day 10 glycosylated HbA0 (day 10 Fruc-Hb) (Fig. 6). Colour formation was not prominent enough for the lower concentrations of day 10 Fruc-Hb used, and as the concentration was increased from 20 to 40 ng/μL, the colour intensity increased linearly. This confirms that the colour intensity profile extracted from the GNPs obtained from differentially glycated haemoglobin samples can be used for qualitative measurement of AGEs in respective samples.

Linearity of detection. The red colour intensity as quantified by (R-G)/B intensity of GNP colloids plotted against the concentration of day 10 Fruc-Hb used for the synthesis. The concentration was varied from 8 to 40 ng/μL

Discussion

The study presented here provides a detailed mechanism of GNP formation from a glycosylated HbA0 template and also discusses how this technique can be expanded for highly sensitive detection of AGE products in a simple manner. Our primary objective for this work was to establish a colorimetric sensing mechanism based on GNPs for the differentiation of glycated and non-glycated samples. The glycated HbA0 was found to be having high reducing property in comparison to the protein and sugar counterparts, enabling formation of stable and mono dispersed GNPs (Fig. 2). Since, among the control samples tested for GNP synthesis, only day 10 Fruc-Hb showed AGE fluorescence, the reactivity can be attributed to the AGE products than a mere structural alterations of the due to glycation (Figs. 1 and 2). To confirm this norm further, the products of glycation obtained from day 10 Fruc-Hb was fractionated to separate the products according to their molecular weights.

Fractionation of glycated Hb segregated two major population of products, high molecular weight proteinaceous (population I) and low molecular weight non-proteinaceous (population II) glycation products (Figs. 3 and 4). When GNPs were synthesised using these fractions of day 10 Fruc-Hb, it was found that only the products belonging to population II, the non-proteinaceous glycation products, were capable of carrying out the synthesis of particles (Fig. 5). This confirmed that the non-proteinaceous AGE products can initiate GNP synthesis by their own and the formation of GNPs from a Fruc-Hb template can be clearly attributed to the AGEs. Also, this opens up the possibility of using this property for the colorimetric detection of AGE products along with the distinction between proteinaceous and non-proteinaceous glycation products of HbA0.

Generally, CARBONYL groups present in the protein and sugar enable the stable synthesis of gold nanostructures in biological syntheses. Here, the generation of AGE products consisting of dicarbonyl functional groups during glycation might be providing the reducing environment for the proposed GNP synthesis [65]. As a matter of fact, the suggested mechanism can be used for the detection of advanced lipid per-oxidation end products (ALEs) as well, since the latter is also characterised by dicarbonyl functional groups and shares structural similarities with AGEs [66]. In short, GNPs synthesised from fractionated glycosylated Hb samples can clearly distinguish between proteinaceous and non-proteinaceous products. Our GNP-based simple colorimetric sensing of glycation products is highly sensitive and can detect nanogram levels of glycation products (S6) in a concentration-dependent manner (Fig. 6). The detection limit using the proposed sensing mechanism for the fractions is 1 ng/μL. The method developed in here can be scaled down to smaller reaction volumes without affecting the reaction kinetics, thus enabling lower sample requirements (data not shown) as well as enhance the reaction kinetics by increasing the concentrations (S5).

Conclusiones

Concisely, in this study, we have demonstrated a colorimetric sensing mechanism for the non-proteinaceous AGE products which is simple and highly sensitive with a detection limit down to nanogram levels. Conditions like type 2 diabetes requires continuous monitoring of sugar levels at regular time intervals. Currently, levels of HbA1c formed as a result of extensive glycation of haemoglobin is used as a diagnostic means for diabetes. Chromatographic [67], electrophoretic and advanced technologies including high-performance liquid chromatography (HPLC) and mass spectrometry (MS) [12, 46,47,48,49, 68] are used for HbA1c detection. Early glycation adducts including fructosamines are also indicative of the glycemic control [69] which can be used as a marker for diabetes detection. Monitoring the AGE levels in addition to the HbA1c levels can significantly improve the determination the degree of complexity associated with diabetes, since the advancement of the disease is often associated with AGE formation and is involved in the progression of the disorder as well. Till date, the LC-MS/MS offers the highest selectivity and sensitivity in AGE detection [70]. But when it comes to simple, cost-effective, point-of-care diagnostics, our method can detect few nanograms of the sample compared to other fluorescence emission-based techniques [71, 72]. The method is highly specific for the AGEs, such that sugars and proteins do not develop any colour as such which are the expected interferences in the clinical samples such as blood or serum for the proposed study (Additional file 1 section 7). In this study, we have also segregated the products of glycation to proteinaceous and non-proteinaceous components and proved that non-proteinaceous AGEs are more reactive by the GNP based colorimetric assay. Further research can explore how this idea can be expanded for the distinction between different AGEs and thereby apply it for the diagnosis of organ specific diabetes-related complications.

Abreviaturas

AGEs:: Advanced glycation end products
Fruc-Hb:: Glycated Hb
GNPs:: Nanopartículas de oro
HbA0:: Haemoglobin A0
SPR:: Surface plasmon resonance

Decoración de nanovesículas con péptido de inserción de pH (bajo) (pHLIP) para entrega dirigida Diseño racional de compuestos 3D SnS2 Quantum Dots / rGO en forma de panal como materiales de ánodo de alto rendimiento para baterías de iones de litio / sodio

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