Espectroscopia utilizando un microscopio óptico

Un instrumento con guión es aquel que combina las capacidades de dos tecnologías diferentes para formar una nueva técnica analítica con habilidades novedosas. El espectrofotómetro de microscopio es uno de esos instrumentos con guión; es un híbrido que combina el poder de aumento de un microscopio óptico con las capacidades analíticas de un espectrofotómetro de rango UV-visible-NIR. Como tales, los espectrofotómetros de microscopio se pueden utilizar para medir los espectros moleculares de áreas de muestras microscópicas desde el ultravioleta profundo hasta la región del infrarrojo cercano. Se pueden configurar para muchos tipos diferentes de espectroscopia y, como tales, se utilizan para medir la absorbancia, la reflectancia e incluso los espectros de emisión, como la fluorescencia y la fotoluminiscencia, de muestras de tamaño micrométrico. Con la adición de algoritmos especializados, el espectrofotómetro de microscopio también se puede usar para medir el espesor de películas delgadas o actuar como colorímetro para muestras microscópicas.

Hay muchas razones para usar el espectrofotómetro de microscopio. La más obvia es que los espectros se pueden adquirir a partir de un área de muestra inferior a una micra. Además, estos instrumentos requieren solo pequeñas cantidades de muestras en forma sólida o líquida. Otra ventaja es que se requiere muy poca o ninguna preparación para muchas muestras. Y las comparaciones de color por espectroscopia tienden a ser más precisas con espectrofotómetros porque estos instrumentos tienen un rango espectral más amplio, pueden corregir las variaciones de iluminación y pueden medir la intensidad de cada banda de luz de longitud de onda.

Antes del advenimiento de la microespectroscopia, la única forma de analizar muchos tipos de muestras microscópicas era utilizar pruebas microquímicas y luego algún tipo de examen visual. Desafortunadamente, estos métodos tienden a ser destructivos, requieren muchas muestras y sufren las imprecisiones del sistema visual humano. El espectrofotómetro del microscopio evita estos problemas y puede "ver" más allá del alcance del ojo humano y detectar variaciones que de otro modo no serían evidentes.

Diseño de espectrofotómetro de microscopio

El espectrofotómetro de microscopio integra un microscopio óptico o de luz con un espectrofotómetro de rango UV-visible-NIR (Figura 1). El microscopio es un dispositivo diseñado para ampliar una imagen de objetos pequeños para permitir su estudio. El espectrofotómetro es un instrumento que mide la intensidad de cada longitud de onda de luz desde el ultravioleta hasta las regiones visible e infrarroja cercana. Con un espectrofotómetro de microscopio correctamente configurado, uno puede adquirir espectros de absorbancia, reflectancia y emisión con áreas de muestreo en la escala submicrónica.

Para cubrir un rango espectral tan amplio con una buena imagen y calidad espectral, se construye un microscopio diseñado a medida y se integra con el espectrofotómetro. Los microscopios ópticos estándar tienen un rango espectral limitado que cubre solo una parte de la región visible debido a los materiales utilizados para la óptica, así como a las propias fuentes de luz. El espectrofotómetro de microscopio moderno utiliza un microscopio hecho a la medida con un diseño óptico y fuentes de luz optimizadas para el UV profundo a través del NIR.

El propio espectrofotómetro también debe estar diseñado para microespectroscopia con el fin de obtener buenos resultados espectrales. Esto significa que el espectrofotómetro debe ser muy sensible y al mismo tiempo mantener una resolución espectral aceptable. La estabilidad también es un problema ya que el espectrofotómetro del microscopio es un instrumento de un solo haz y se deben obtener espectros de referencia antes de medir la muestra. El instrumento también debe tener un alto rango dinámico, ya que con frecuencia se cambia de microespectroscopia de transmisión o reflectancia a espectroscopia de fluorescencia cuando se mide la misma muestra. Esto le permite obtener diferentes tipos de información espectral desde exactamente la misma ubicación en la muestra microscópica.

La integración del espectrofotómetro con el microscopio es de vital importancia. Si bien tanto el microscopio como el espectrofotómetro deben optimizarse para la microespectroscopia, la clave para el funcionamiento de un espectrofotómetro de microscopio es el hardware que les permite trabajar juntos. Esta interfaz tiene varios requisitos básicos. Lo que es más importante, debe canalizar la energía electromagnética recolectada por el microscopio de la muestra hacia el espectrofotómetro. Sin embargo, el usuario debe poder visualizar el área de medición de la muestra, pero también ver la muestra circundante. Esto se logra teniendo la apertura de entrada del espectrofotómetro en el mismo plano focal que la imagen de muestra. A continuación, la muestra se puede mover con la platina del microscopio, como se haría normalmente con un microscopio, hasta que la imagen de la abertura de entrada esté sobre el área que se va a medir. En la Figura 2, el cuadrado negro en el centro de la imagen es la apertura de entrada del espectrofotómetro. Todo esto se hace en tiempo real para que la espectroscopia de muestras al microscopio sea rápida y sencilla.

Como se muestra en la Figura 3, la óptica del microscopio enfoca la luz sobre la muestra. A continuación, el objetivo del microscopio recoge la energía electromagnética de la muestra. La luz del objetivo se enfoca en la apertura de entrada espejada del espectrofotómetro. La mayor parte de la luz se refleja desde la superficie de apertura de entrada hacia la cámara. La cámara también toma imágenes de la apertura del espectrofotómetro, de modo que aparece como un cuadrado negro en la muestra (Figura 2). Esto permite una alineación fácil y rápida del espectrofotómetro del microscopio. La luz que pasa a través de la apertura de entrada luego pasa al espectrofotómetro donde se mide el espectro.

El microscopio se puede configurar con diferentes esquemas de iluminación dependiendo del tipo de experimento a realizar. La iluminación incidente con luz blanca permite la microespectroscopía de reflectancia desde el UV profundo hasta el IR cercano. La iluminación incidente también se puede utilizar para la microespectroscopia de fluorescencia o fotoluminiscencia. Además, la microespectroscopia de transmisión es posible con luz blanca enfocada en la muestra a través del condensador del microscopio.

Aplicaciones de la Microespectroscopia

Los primeros espectrofotómetros de microscopio se desarrollaron en la década de 1940 y, desde entonces, se han desarrollado una gran cantidad de aplicaciones diferentes. Con la capacidad de adquirir espectros de áreas de muestra microscópicas, los espectrofotómetros de microscopio se utilizan en todas partes, desde laboratorios universitarios hasta líneas de producción para control de calidad y análisis de fallas.

Ciencia forense. El análisis de pruebas forenses ha sido una de las aplicaciones más importantes de los espectrofotómetros de microscopio desde principios de la década de 1980. El mayor esfuerzo estuvo en el análisis de trazas de evidencia, específicamente fibras textiles y pedacitos de pintura1, 2. Como sus nombres lo sugieren, este tipo de muestras suelen ser microscópicas y, al ser evidencia, no deben dañarse ni destruirse durante las pruebas. Con las fibras, se utilizan espectrofotómetros de microscopio para medir los espectros de absorbancia y fluorescencia UV-visible-NIR de fibras individuales. Los fragmentos de pintura generalmente se seccionan transversalmente y luego se mide el espectro de absorbancia de cada capa para que las muestras conocidas y cuestionadas puedan compararse con un alto grado de discriminación.

Pantallas planas. Las pantallas planas modernas consisten en millones de píxeles multicolores. A medida que la tecnología avanza, los píxeles se vuelven cada vez más pequeños y más compactos en superficies cada vez más grandes. Las pantallas más modernas utilizan diferentes tecnologías, como puntos cuánticos y diodos orgánicos emisores de luz, para crear píxeles de diferentes colores a escala microscópica. El espectrofotómetro del microscopio se utiliza para ayudar a desarrollar estos materiales como fuentes de luz viables y, en última instancia, como pantallas 3,4. El espectrofotómetro del microscopio también se utiliza en el proceso de producción para garantizar que tanto el color como la intensidad de los píxeles sean uniformes en toda la pantalla, lo que garantiza imágenes brillantes y uniformemente iluminadas en toda la pantalla.

Energía. Las rocas generadoras de carbón y petróleo contienen vitrinita y otros macerales. Los espectrofotómetros de microscopio se utilizan para clasificar la madurez térmica5 y, por lo tanto, el contenido de energía del carbón, el coque y la roca generadora de petróleo. Esto se hace midiendo la reflectividad absoluta de la vitrinita en una muestra pulida. Dependiendo de la reflectividad, se puede determinar la madurez térmica de la muestra.

Nanotecnología. El espectrofotómetro de microscopio también está haciendo avanzar la nanotecnología y la ciencia de los materiales en función de su capacidad para medir áreas de muestra microscópicas de espectros de transmisión, reflectancia y emisión. Un área de aplicaciones de rápido crecimiento es el desarrollo y uso de la resonancia de plasmones superficiales (SPR)6,7,8.

Los plasmones superficiales se excitan iluminando una superficie metálica plana o partículas metálicas a nanoescala con luz (Figura 4). Los cambios en las características ópticas de estos materiales ocurren cuando estas nanopartículas o superficies interactúan con otros materiales. Como tal, se está trabajando mucho para desarrollar nuevos materiales que muestren algún tipo de resonancia de plasmones, pero también para construir dispositivos que presenten estos fenómenos. Este último incluye biosensores y sensores de dispositivos microfluídicos de varios tipos. El espectrofotómetro del microscopio mide cómo cambian los espectros de los materiales SPR en diferentes condiciones, lo que brinda al investigador la capacidad de caracterizar un nuevo material y luego "ajustarlo" para efectos ópticos específicos.

Conclusión

El espectrofotómetro de microscopio es una técnica con guión que combina el microscopio óptico con un espectrofotómetro para que uno pueda adquirir espectros de áreas de muestras microscópicas. Dichos instrumentos son capaces de obtener espectros de absorbancia y reflectancia desde el ultravioleta profundo hasta las regiones visibles e infrarrojas cercanas. El espectrofotómetro del microscopio también puede medir la fluorescencia y otros tipos de espectros de emisión. Estos dispositivos han encontrado usos en muchos campos, incluida la ciencia forense, la medición del espesor de películas ópticas y de semiconductores, la biotecnología y lo último en ciencia de los materiales.

Referencias

1. S. Walbridge-Jones, Microespectrofotometría para la medición del color de fibras textiles, Identificación de fibras textiles , Woodhead Publishing, 2009, páginas 165-180,
2. Guía estándar para microespectrofotometría en análisis forense de pintura, Sociedad Estadounidense de Pruebas y Materiales.
3. Buchnev, O., Podoliak, N. y Fedotov, V. A. (2018). Metapíxel relleno de cristal líquido con reflectancia y transmitancia asimétricas conmutables . J. Molecular Liquids, 267, 411-414.
4. Rezaei, S. D., Hong Ng, R. J., Dong, Z., Ho, J., Koay, E. H., Ramakrishna, S. y Yang, J. K. (2019). Paletas de colores plasmónicos de amplia gama con resolución de longitud de onda inferior constante . ACS nano, 13 (3), 3580-3588.
5. “Métodos para el análisis petrográfico de carbones - Parte 5:Método para determinar microscópicamente la reflectancia de la vitrinita”, ISO 7404-5, Organización Internacional de Normalización, 2009.
6. Ng, R.J.H., Krishnan, R.V., Dong, Z., Ho, J., Liu, H., Ruan, Q., Pey, K.L. y Yang, JK (2019). Micro-etiquetas para arte:imágenes visibles e infrarrojas encubiertas usando plasmones gap en óxido de aluminio nativo . Materiales ópticos Express, 9 (2), 788-801.
7. Alali, M., Yu, Y., Xu, K., Ng, R.J., Dong, Z., Wang, L., Dinachali, S.S., Hong, M. y Yang, J.K. (2016). Apilamiento de colores en superredes plasmónicas exfoliables . Nanoescala, 8 (42), 18228-18234.
8. Jiang, M., Siew, S.Y., Chan, J.Y., Deng, J., Wu, Q.Y.S., Jin, L., Yang, J.K., Teng, J., Danner, A. y Qiu, C.W., (2020 ). Resistencia modelada en plata plana que logra colores plasmónicos saturados con un ancho de línea espectral inferior a 20 nm . Materiales hoy, 35, 99-105.

Este artículo fue escrito por el Dr. Paul Martin, presidente de CRAIC Technologies (San Dimas, CA). Para obtener más información, póngase en contacto con el Dr. Martin en Esta dirección de correo electrónico está protegida contra spambots. Necesita habilitar JavaScript para verlo., o visite aquí .